Summary
Denne protokollen definerer en ny metode for å opprette en romlig detaljert endelig element modell av intracellulær arkitektur cardiomyocytes fra elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi bilder. Kraften i dette romlig detaljert modell er demonstrert ved hjelp av case-studier i kalsium signalisering og Bioenergi.
Abstract
Med ankomsten av tredimensjonale (3D) bildeteknologi som elektron tomografi, seriell-blokk-ansikt skanning elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi, det vitenskapelige samfunnet har tilgang til store datasett på sub mikrometer oppløsning som karakteriserer arkitektoniske remodeling som følger endringer i cardiomyocyte-funksjonen i helse og sykdom. Men er disse datasett under-utnyttet for å undersøke rollen av mobilnettet arkitektur remodeling i cardiomyocyte-funksjonen. Formålet med denne protokollen er å skissere hvordan å lage en nøyaktig endelig element modell av en cardiomyocyte med høy oppløsning elektronmikroskop og AC confocal mikroskopi bilder. En detaljert og nøyaktig modell av mobilnettet arkitektur har betydelig potensial for å gi ny innsikt i cardiomyocyte biologi, mer enn eksperimenter alene kan garner. Kraften i denne metoden ligger i dens evne til beregningsmessig sikring informasjon fra to ulike tenkelig modaliteter av cardiomyocyte ultrastructure å utvikle en enhetlig og detaljert modell av cardiomyocyte. Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å integrere elektron tomografi og AC confocal mikroskopi bilder av voksne mannlige Wistar (navn etter en bestemt hunderase albino rotten) rotte cardiomyocytes å utvikle en halv-sarcomere endelig element modell av cardiomyocyte. Fremgangsmåten genererer en 3D endelig element modell som inneholder en nøyaktig, høyoppløselige skildring (på ~ 35 nm) av fordelingen av mitokondrier, myofibrils og ryanodine reseptor klynger som frigjør nødvendig kalsium for cardiomyocyte sammentrekning fra sarcoplasmic reticular nettverket (SR) i myofibril og cytosolic kupé. Modellen generert her som en illustrasjon ikke innlemme tverrstilt-tubule arkitekturen eller sarcoplasmic reticular nettverket og er derfor en minimal modell av cardiomyocyte. Likevel kan modellen som allerede brukes i simulering-baserte undersøkelser i rollen av cellestruktur i kalsium signal og mitokondrie bioenergi, som er illustrert og diskutert bruker to kasusstudier presenteres etter det detaljert protokollen.
Introduction
Eksitasjon-sammentrekning kopling (ECC) i hjertet refererer til viktige og intrikat kobling mellom elektrisk magnetisering av cardiomyocyte membranen og påfølgende mekanisk sammentrekning av cellen under hvert hjerteslag. Matematiske modeller har spilt en nøkkelrolle i å utvikle en kvantitative forståelse av sammenkoblede biokjemiske prosesser som regulerer handling potensial1, cytosolic kalsium signalering2, bioenergi3, og påfølgende kontraktile styrkegenerering. Slike modeller har også vellykket forutsagte endringer i hjerterytme når én eller flere av disse biokjemiske prosesser gjennomgå endringer4,5. Den svært organisert ultrastructure av cardiomyocyte har stadig blitt anerkjent å spille en avgjørende rolle i normal kontraktile funksjon av cellen og hele hjerte. Faktisk forekomme endringer i morfologi og organisering av komponenter i cardiac ultrastructure parallelt biokjemiske endringer i sykdom forhold som hypertrofi6, hjertesvikt7og diabetiker kardiomyopati8. Om disse strukturelle endringer er mindre, adaptive eller patologisk svar til endring biokjemiske forhold er fortsatt hovedsakelig ukjent9. Den iboende tett koplingen mellom form og funksjon i biologi betyr at eksperimentelle studier alene ikke kan gi dypere innsikt enn sammenhenger mellom strukturelle remodeling og cardiomyocyte funksjon. En ny generasjon av matematiske modeller som kan innlemme strukturelle montering av sub mobilnettet komponentene sammen med godt studert biokjemiske prosesser, er nødvendig for å utvikle en omfattende, kvantitative forståelse av forholdet mellom struktur, biokjemi og contractile kraften i cardiomyocytes. Denne protokollen beskriver metoder som kan brukes til å generere strukturelt nøyaktig endelig element modeller av cardiomyocytes som kan brukes til slike undersøkelser.
Det siste tiåret har sett betydelige fremskritt i 3D elektronmikroskop10, AC confocal11og super-oppløsning mikroskopi12 som gir enestående, høyoppløselige innsikt i nano-skala og mikro-skala montering av den sub cellulære komponenter av cardiomyocyte. Nylig har disse datasett blitt brukt til å generere datamodeller cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. Disse modellene bruke en veletablert engineering simulering metoden, kalles de endelige element metoden17, opprette endelig element beregningsorientert maskene over hvilke biokjemiske prosesser og cardiomyocyte sammentrekninger kan simuleres. Men er disse modellene begrenset av oppløsning og detaljer som mikroskopi metode kan tilby i et bilde datasett. For eksempel elektronmikroskop kan generere nanometer-nivå detalj cellestruktur, men det er vanskelig å identifisere spesifikke proteiner i bildet som ville være nødvendig å opprette en modell. På den annen side, optisk super-oppløsning mikroskopi gir høy kontrast bilder med en oppløsning på 50 nm i bare en velge noen molekylær komponenter i cellen. Bare ved å integrere utfyllende informasjon fra disse tenkelig modaliteter kan en realistisk utforske følsomheten til funksjonen endringer i strukturen. Correlative lys og elektronmikroskop er fortsatt ikke en rutinemessig prosedyre og det vil fortsatt lide begrensningen at kun et begrenset antall komponenter kan være farget i visningen immunofluorescence og korrelert med visningen elektronmikroskop.
Denne protokollen presenterer en ny tilnærming18 som statistiske metoder19 til å analysere og beregningsmessig sikring * lys informasjon på den romlige fordelingen av ion-kanaler med elektronmikroskop informasjon på andre hjerte Ultrastructure komponenter, for eksempel myofibrils og mitokondrier. Dette gir en endelig element modell som kan brukes med Biofysiske modeller av biokjemiske prosesser for å studere rollen til cardiomyocyte sub mobilnettet organisasjon biokjemiske prosesser som regulerer cardiomyocyte sammentrekning. For eksempel denne protokollen kan brukes til å lage modeller fra sunn og streptozotocin-indusert diabetiker cardiac myocytter å studere effekten av strukturelle Boligmodernisering på cardiac celle-funksjonen som er observert i diabetiker dyr modeller8. En ekstra fordel av statistiske natur presentert metoden er også illustrert i protokollen: metoden kan generere flere forekomster av finite element geometrier som nærmere etterligner eksperimentelt observert variasjoner i cellestrukturen.
Som en oversikt, punktene protokollen inkludere: (i) utarbeidelse av hjerte vev for elektronmikroskop å generere 3D-bilder med tilstrekkelig oppløsning og kontrast; (ii) rekonstruksjon og segmentering av 3D bildestakker fra elektronmikroskop data ved hjelp av en 3D elektronmikroskop gjenoppbygging og bildeanalyse programvare kalt IMOD20; (iii) bruke iso2mesh21 til å generere et endelig element nett bruker segmenterte data som inndata; (iv) bruker romanen algoritme og koder for å kartlegge fordelingen av ionekanaler på endelig element mesh.
Forutsetningen av tilnærming til hvert trinn er beskrevet i protokollen, og representant resultatene er gitt i de tilhørende figurene. En oversikt markeres angir hvor de genererte romlig detaljerte modellene kan brukes til å studere romlige dynamikken i kalsium ECC, samt mitokondrie bioenergi. Noen av de nåværende begrensningene av protokollen er diskutert, samt nye utbygginger som er underveis for å overvinne dem og videre før en kvantitative forståelse av rollen cellestrukturen til hjerte systemer biologi. Hvordan disse metodene kan generaliseres åopprette endelig element modeller av andre celletyper er også adressert.
Brukere av denne protokollen kan hoppe over trinn 1 og gjenoppbygging del av trinn 2 hvis de har tilgang til en eksisterende elektronmikroskop bildestakk. Brukere som har til hensikt å skaffe data i samarbeid med erfarne elektron microscopists ønsker å diskutere og sammenligne fiksering og flekker prosedyrer i trinn 1 med expert å bestemme en optimal protokoll for oppkjøpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av University of Auckland dyr etikk og University of California, San Diego institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen, der vev protokollen ble opprinnelig utviklet.
1. eksperimentelle forberedelse
- Klargjør lager løsninger av 0,15 M og 0,3 M natrium cacodylate buffere ved pH 7.4 etter tabell 1.
-
Forberede glutaraldehyde bindemiddel (2% paraformaldehyde (PFA) + 2,5% glutaraldehyde + 0,2% garvesyre 0,15 M natrium cacodylate buffer ved pH 7.4) bruker komponenter oppført i tabell 1.
- Oppløse 2 g PFA pulver i 20 mL destillert vann på 60 ° C på en kokeplate med konstant omrøring.
- Tilsett 1 M NaOH løsning til løsningen er klart.
- Vent til temperaturen i løsningen er under 40 ° C, deretter legge 10 mL av glutaraldehyde og 20 mL 0,3 M natrium cacodylate.
- Legg 0.2 g garvesyre og oppløse den i løsningen.
- Legge til 50 mL av 0,15 M natrium cacodylate.
- Lagre tre eller fire 20 mL scintillation ampuller av bindemiddel i kjøleskapet i 4 ° C, eller på isen hvis brukt på samme dag.
- Forberede Tyrodes løsning med 20 mM 2,3-butanedione monoxime (BDM), ifølge oppskriften i tabell 1.
-
Konstruere en Langendorff apparater inne en røyk skap.
- Klemme to 100 mL plastsprøyte rør til to forskjellige retorten står, ca 70 cm høye stå basen.
- Koble plastsprøyte rør og en kontakt rør med 3 mm indre diameter rør og en treveis stopcock som vist i figur 1.
- Passe en 3 mm ytre diameter kanyle til bunnen av kontakten rør, hvor hjertet vil være knyttet til perfusjon fiksering.
-
Fyll sprøyten rør med Tyrodes løsning og etappe, den stabiliserende løsninger på 37 ° C.
- Fjerne luftbobler i slangen ved å sende følgende sprøyten gjennom dem.
2. kjøpe elektronmikroskop Data Cardiomyocyte Ultrastructure
- Forberede dyret excision og kjemiske fiksering av hjertet.
Merk: Denne protokollen detaljer trinnene for å behandle voksne mannlige Wistar (navn etter en bestemt hunderase albino rotten) rotte hjerte vev. Protokollen kan kreve endringer når hjerte vev er Hentet fra andre arter.- Bedøve dyr ved å behandle rotta (200-250 g av kroppsvekt) med 0,5 mL av 250 U/mL heparin via intraperitoneal injeksjon. Vente på 10 min og deretter behandle rotte med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (210 mg/kg kroppsvekt).
- Bekrefte en riktig grad av anestesi ved å teste den tå knipe refleks.
- Euthanize dyret av cervical forvridning.
- Innhøstingen hjertet bruke disseksjon prosedyrer ligner på tidligere utgitt JoVE artikler22,23, deretter plassere den i iskalde saltvann.
- Isolere stigende aorta og cannulate. Kontroller at spissen av kanyle sitter like over semi lunar ventilen, der coronary arteries grenen av. Knytt en tråd tett rundt stigende aorta.
- Koble kanyle til tyngdekraften-drevet Langendorff apparatet drives på ~ 70 cm over bunnen av systemet (figur 1).
- Vri på stopcock på Langendorff systemet perfuse hjertet med Tyrodes løsning, inkludert 20 mM BDM (en myosin hemmer) for 2-3 minutter.
- Vri på stopcock for å starte perfusjonsmåling med bindemiddel 2% paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehyde og 0,2% garvesyre i 0,15 M natrium cacodylate ved 37 ° C i 10 min. Hvis hjertet vil snu blek brun og bli stiv og gummiaktig.
- Bruke et barberblad, dissekere vev kvartaler fra venstre ventrikkel (lateral) gratis veggen og få vev blokkerer ca 1 mm3 i størrelse.
- Store eksemplene i pre-avkjølt 20 mL scintillation ampuller av den samme bindemiddel på is 2 h. lagre så mange prøver som mulig i hetteglass, og sikre at prøvene er neddykket i løsningen.
Advarsel: Det er viktig å holde prøver kaldt før etter 100% dehydrering trinnene nedenfor.
- Videre fiksering og flekker av prøver for elektronmikroskop.
- Hell 100 mL 0,15 M natrium cacodylate buffer i et glass beaker og Avkjøl på is.
- Forberede like volum av 4% osmium tetroxide og 0,3 M natrium cacodylate, etterfulgt av tillegg av 0,08 g av kalium ferrocyanide å gjøre en heavy metal flekk løsning som inneholder 2% kalium ferrocyanide i 2% osmium tetroxide og 0,15 M natrium cacodylate. Cool løsningen på is.
- Pipetter bindemiddel ut og erstatte den med nok kaldt 0,15 M natrium cacodylate buffer å senke prøver i hetteglass. Plass hetteglass på is 5 min.
- Gjenta trinn 2.2.3 ganger med 0,15 M natrium cacodylate å fjerne overflødig bindemiddel.
Advarsel: Ikke bruk glass Pipetter fordi lille skår kan komme inn prøven og kan ødelegge diamantkniver under vev blokk snitting. Det er viktig å pre avkjøle alle løsninger på is før du legger dem til prøven. Det er også viktig at prøven er dekket av løsning tidene (svært korte perioder med delvis dekning varer mer enn noen få sekunder kan kort tolereres under løsning utveksling). Når vasking og erstatte løsninger, raskt legge til den nye løsningen etter fjerner den forrige løsningen. Hold scintillation hetteglass på is mellom vasker. Merk at dette trinnet ikke er tid sensitiv, vev blokkene kan vaskes litt lenger, hvis nødvendig. - Erstatt natrium cacodylate buffer med iskald heavy metal flekk løsning og lagre det på isen over natten. Sikre at ferrocyanide er godt blandet ved å riste ampullen hånd; løsningen bør bli svart.
FORSIKTIG: Arbeid i avtrekksvifte når du utfører dette trinnet fordi osmium er giftig. - Fortynne 4% vandig uranyl acetate (UA) lagerløsning (tabell 1) til 2% like volum av lager UA løsning og dobbel destillert vann, og kjøle den ned på is.
- Erstatt heavy metal flekk med is-avkjølt 0,15 M natrium cacodylate buffer, og la prøven ruge i 5 min på is.
- Gjenta trinn 2.2.7 ganger på is skylle av overflødig heavy metal flekk løsning.
- Skyll prøvene fire ganger, med en 2 minutters vente-periode i mellom i renset vann (dobbel-destillert er tilstrekkelig).
- Erstatte renset vann med iskald 2% UA og la prøven ruge i 60-120 min på is.
- Avkjøl fem 20 mL scintillation ampuller av etanol (nok å senke prøver) på is som skal brukes i dehydrering trinn. Seks hetteglass har stadig større andeler av etanol i destillert vann: 20%, 50%, 70%, 90% og 100%.
- Hell ren aceton i en annen 20 mL scintillation medisinglass og kul på is med etanol hetteglass.
- Skyll prøver renset vann fire ganger med 2 min ventetider på is å vaske overflødig UA.
- Tørke prøver etanol.
- Mister i kalde etanol serien suksessivt erstatte løsning i prøven ampullen som følger, på is: 20% etanol i 10 min; 50% etanol i 10 min; 70% etanol i 10 min; 90% etanol i 10 min; deretter to ganger i 100% etanol i 10 min.
- Overgang å romtemperatur ved å erstatte de siste 100% etanol med avkjølt ren aceton og plasser prøven ampullen på en romtemperert lab-benken for 10 min.
- Utføre en mer 10 min vask i ren aceton ved romtemperatur å fjerne kondensvann som er i hetteglass. Mens rugende, utgjør aceton/harpiks løsninger.
- Erstatte den ren aceton i hetteglass med 50/50 ren aceton og epoxy harpiks (med proporsjoner for epoxy harpiks komponenter som nevnt av produsenten). Bruk alle komponenter fra samme batch. La harpiks fylt eksempel hetteglass over natten på en rotor.
- Bygge inn eksempler i harpiks.
- Erstatt 50/50 harpiks med 75% harpiks (25% aceton) og ruge 3 h, etterfulgt av ytterligere inkubasjon/infiltrasjon i 100% harpiks 4 h ved romtemperatur.
- Erstatte 100% harpiks med fersk 100% harpiks, og la utvalg hetteglass over natten for dypere penetrasjon av harpiks inn i vevsprøver.
- Ta prøver av hetteglass og plassere dem i beholdere som er ovnen-vennlig og har flat bunn; aluminium eller folie bakervarer kopper kan brukes for dette formålet, for eksempel.
- Forsiktig helle (for å unngå forskyvning av prøvene) fersk harpiks over prøvene (dermed bygge prøver i harpiks) og danner harpiks og prøver i en ovn ved 60 ° C i 48 timer.
- Re-orientere harpiks blokker bilde celler i tverrsnitt.
- Få 1 µm tykk test deler harpiks blokker bruker en ultramicrotome med glass kniv for å vurdere celle retning24.
- Stain delene tykk test for 20 s med 1% toluen blå og 1% boraks.
- Undersøke muskel celle retning under lysende felt mikroskop.
- Basert på retningen avledet fra bilder av delene farget test, re-orientere langs eller skrå orientert (lik figur 2A) harpiks blokkene slik at cellene er utsatt for glasskniven slik at de vil bli kuttet i tverrsnitt ( ligner på figur 2B).
- Bildet vev seksjoner med elektron tomografi.
- Få semi tynne snitt (~ 300 nm) av reorientert vev blokker med en diamant kniv og overføre delene på kobber rutenett25.
- Stain delene tykk med 2% UA og Sato ledelsen25.
- Bruk kolloidalt gull partikler på begge sider av deler25.
- Få sett av enkle eller dual-aksen tilt rekke projiserte bilder fra-70 ° til 70 °25.
- Bruke IMOD20 å rekonstruere det 3D bildestakk (en serie av 2D-bilder som inneholder 3D-informasjon for en enkelt elektron tomografi) av cellen. Denne rekonstruert bunken blir segmentert i neste trinn.
3. segmentere Myofibrils og mitokondrier regioner fra EM 3D Image datasett
- Kjør IMOD programmet "3dmod".
- I det grafiske brukergrensesnittet i 3dmod, angi adressen til ".rec" eller ".mrc" filen som inneholder 3D rekonstruert bilde dataset i cellen (generert i trinn 2.7) inn i posten boksen "Image filer:", trykk "OK".
- På "Fil"-menyen, velger ny modell, og deretter lagre filen med et passende navn bruker "Lagre modellen som"... menyelementet under "Fil".
Merk: Et objekt i IMOD kan inneholde en samling av segmentert komponentene som utgjør det "objektet". Som standard inneholder en ny modell et nytt objekt med id "#1". - Under "Spesielle"-menyen velger du "Tegning verktøy". Dette vil åpne en ny verktøylinje som er lik som vist i figur 3A.
Merk: Det finnes flere verktøy som kan brukes til å lage konturer rundt ulike organelle grensene. Mer hjelp om hvordan du bruker disse verktøyene kan finnes i IMOD20 dokumentasjonen. - Velg alternativet "Skulptur" i "tegneverktøy-menyen, og beveg musen over bildet vinduet; en sirkulær kontur sentrert på musepekeren vises.
- Holder det midtre musen knappen nede over en mitokondrie (de mørke delene av bildefilene, som illustrert ved demarkasjoner med grønne høydekurver i figur 3A), dra omkretsen av sirkelen konturen i form av grensen.
- Når kontur av mitokondrie grensen er fullført, midterste knappen, og gjentar trinn 3.6 for hver mitokondrie i dataene. Hver profil vil automatisk bli gjenkjent av IMOD som en ny profil i samme objekt.
- Under det "Rediger | Objektet "meny, velg"Ny"for å opprette et nytt objekt. Dette vil øke antall objekter med en og tilordner dette nummeret til det nye objektet automatisk.
- Gjenta 3.6 og 3.7 segment og lagre myofibril konturer.
- Gjenta trinn 3.8, etterfulgt av trinn 3.6, segmentere cellegrensen også.
- Lagre modellfilen på "Fil"-menyen.
- Kjør følgende kommandoer i kommandolinjevinduet konvertere hvert objekt gruppering i en binær maske som vist i Figur 4Vekselstrøm.
- Pakk ut et bestemt objekt fra den modellen "imodextract objektet modelfile outputmodelfile" hvor "objekt" er nummeret på objektet som skal hentes.
- Opprett en maske for objektet: imodmop-maske 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Konvertere filen til et tif-stakken: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. Opprett en Finite Element maske fra segmentert komponentene
- Iso2mesh er et fritt tilgjengelig MATLAB-program for å konvertere TIFF bildestakker til volumetriske tetrahedral endelig element nett. Laste ned og legge iso2mesh å MATLAB banen fra iso2mesh.sourceforge.net.
- Last ned kildekoder og data å simulere RyR klynger på nettet fra github nettsted https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
- Start programmet CardiacCellMeshGenerator MATLAB (figur 5).
- Laste inn forskjellige organelle komponent maskene i MATLAB bruker tre knapper på øvre venstre side på GUI.
- Opprette en binær bildestakk som demarcates mellom myofibrils og mitokondrier som vist i figur 6A.
- Åpne ImageJ.
- Bruke filen | Åpne dialogboksen, laste myofibrils og mitokondrier tiff stabler inn i programmet.
- Starte image tillegg plugin ved å velge "prosess | Kalkulator Plus ".
- Velg myofibril-bildestakk som i1, mitokondrier bilde stabelen som i2, og velg "Legg til" operatør. Klikk "OK".
- Etter en ny bildestakk representerer resultatet av 4.5.4 vises, velg "Rediger | Inverter"for å produsere en bildestakk ligner på figur 6A.
- Last filen som inneholder binære bilder papirbunken gapene mellom myofibrils og mitokondrier ved å trykke på "RyRGapsFile"-knappen på programmet CardiacCellMeshGenerator.
- Trykk "Generere Mesh" på GUI. Dette vil utløse iso2mesh kommandoen v2m med alternativet 'cgalmesh' til å generere en tetrahedral maske ligner på figur 4E. Tre filer skal vises på slutten av dette trinnet: en .ele-fil, en .face-fil og en .node fil som inneholder listen over noder som utgjør elementene, nodene som utgjør ansikter og koordinatene for noder , henholdsvis.
5. matematisk kart romlig varierende tettheten av Ion-kanaler rundt på Finite Element Mesh.
-
Generere nødvendige kontakter for RyR-Simulator ved å trykke på knappen generere RyR-Simulator innganger på GUI.
Merk: Knappen vil utløse en funksjon generateRyRsimulatorInputs.m, som bruker følgende informasjon fra trinn 4 generere innganger:
(1) outDir: plasseringen for utskrift av filer som er nødvendige for RyR klynger simulering.
(2) imres: pixel oppløsning i tre retninger av bildestakker.
(3) myofibril_file: filen som inneholder den binære bildestakk som vist i figur 4B.
(4) sarcolemma_file: filen som inneholder den binære bildestakk som vist i figur 4A.
(5) ryrgaps_file: filen som inneholder den binære bildestakk som vist i figur 5A.- Når denne funksjonen utfører, må du kontrollere at følgende filer opprettet i katalogen som angis som outDir:
- d_axial_micron.txt, som representerer akseavstand mellom plasseringen av z-platen og resten av bildepunktene i bildet stakken.
- d_radial_micron.txt, som representerer euklidsk avstanden (unntatt komponenten aksial) fra hver piksel i settet med mulige RyR klyngen steder til bildepunktene på z-disc flyet.
- W_micron.txt, som representerer listen over romlige koordinater for alle tilgjengelige stillingene for RyR klynger for å være til stede.
- De gjenværende 3 filene i mappen inneholder suffikset "_pixel" i stedet for "_micron" for å betegne at verdiene i disse filene har blitt skrevet ut i pixel koordinere form.
-
Simulere RyR klyngen distribusjoner på binære bilder stabelen med myofibrils.
- Trykk på knappen "Åpne RyR-simulator i R" starte programmet R.
- R-gui, velg "fil | Åpne"og Finn filen"innstillinger. R"i RyR-Simulator pakken (RyR-Simulator/kilde/innstillinger. R).
- Også åpne filen ryr-simulator-parallell. R (ligger i RyR-Simulator/kilde/ryr-simulator-parallell. R). miljøer som Rstudio (https://www.rstudio.com) eller en vanlig kommandolinjegrensesnittet kan brukes, for eksempel kommandoen R64 i et shell eller kommandere vindu.
- Endre parameterne i innstillingene. R filen som beskrevet nedenfor:
- Angi bane2 til mappeadressen som inneholder filene i 5.1.2 for en eksperimentelt ervervet AC confocal bildestakk RyR klynger og myofibrils.
Merk: Github oppbevaringssted mappen input-filer/master-cellen / inneholder allerede filer som ble generert for en tidligere innsamlede bildestakk. - Sett Path4 til en mappe adresse der filene som ble generert i trinn 5.1.2 lagres.
- Angi bane3 til en mappe der brukeren vil de simulerte RyR klynge stedene lagres.
- Sett N antall RyR klynger kan simuleres i modellen (vanligvis i størrelsesorden 200 til 300).
- Angi etol, en toleranse innstilling, forskjellen mellom eksperimentelt målt romlige fordelingen av RyR klynger og modell simulert romlige fordelingen av RyR klynger.
- Angi numIter til å begrense antall forsøk som RyR-Simulator bør ta for å finne en simulert RyR klyngen mønster som tilfredsstiller etol verdien.
Merk: Verdier for etol og numIter er satt til verdiene i innstillingene. R-fil. - Angi numPatterns for antall forskjellige RyR klyngen mønstre som brukeren ønsker å simulere (vanligvis er det nyttig praksis simulere 99 mønstre for statistiske tillit).
- Angi numCores å aktivere bruk av flere CPU tråder (kjerner) for raskere parallell behandling med R å simulere punkt mønstre.
- Angi bane2 til mappeadressen som inneholder filene i 5.1.2 for en eksperimentelt ervervet AC confocal bildestakk RyR klynger og myofibrils.
- Kontroller at følgende pakker installeres ved hjelp av pakkeinstallasjonsprogrammet gui R: snø, doSNOW, doparallel, foreach, iteratorer og rgl.
- Kjøre simulatoren ved å skrive inn følgende kommando i vinduet R: kilde (' banen til ryr-simulator-parallell. R', chdir = TRUE)
Merk: Produksjon av programmet RyR-Simulator er en liste over txt-filer (en numPatterns-fil blir generert) som inneholder koordinere lister i N rader og 3 kolonner, som representerer x-, y- og z-koordinatene av N simulert RyR klynger.
-
Tilordne poeng som romlige tettheter på en beregningsmodell ved hjelp av CardiacCellMeshGenerator.
- Ved å velge knappen merket "Vel RyR poeng fil", velger en simulert RyR klyngen distribusjon tekstfil fra de som var resultatet av RyR-Simulator.
- Kjør "RyR tetthet kart" på GUI i MATLAB. Dette vil kartlegge romlige plasseringen av simulert RyR klynger i txt-filen i trinn 5.3.1 på endelig element mesh som ble generert i trinn 4.8 bruker en metode som kalles en sfærisk kjernen intensitet estimator metoden26.
Merk: Utdataene fra dette trinnet er txt-fil som inneholder en liste over verdier for numeriske tetthet av ion-kanalen per enhet sfærisk volum på hver av de beregningsorientert mesh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 til figur 7 gir representant resultater av flere viktige trinnene i denne protokollen: (i) visualisere og snu vev blokker for cross-sectional elektronmikroskop visninger. (ii) genererer en 3D elektronmikroskop bildestakk; (iii) segmentering sub mobilnettet ultrastructure for organeller steder. (iv) generasjon en endelig element mesh med iso2mesh; (v) simulere en realistisk fordeling av RyR klynger på nettet; (vi) fulgte ved å tilordne denne romlige fordelingen som en romlige tetthet over beregningsorientert mesh.
Figur 2 viser typiske lyse feltet bilder som viser hvordan celler vises når orientert langs (figur 2A, merket L), skrått (figur 2A, merket O) og cross-sectionally (figur 2B) med hensyn til den skjæringsplanet. Skrå og langs orientert utstilling striations, mens cross-sectionally orientert prøver ikke stiller striations. Kapillærene vises også sirkulær i tverrsnittvisninger enn i skrå visninger.
Figur 3A viser et representativt bilde av en god tomogram stabel som kan erverves når vev forberedelse protokollen i trinn 1 er fulgt. Være må forsiktig når du utfører 3D rekonstruksjon fra mikroskop bildet tilt serien. Feil sporing av kolloidalt gull partikler, eller mangel på tilstrekkelig gull partikler kan påvirke kvaliteten-image kontrast og bilde-av tomogram betydelig. Dette påvirker evnen til å segmentere ulike strukturer betydelig. Omsorg og erfaring er nødvendig for å sikre at vev blokkene er farget tilstrekkelig og at det er en jevn distribusjon av kolloidalt gull partikler gjennom vev volumet. Hvis du er i tvil, kan det være nyttig å rådføre seg med en spesialist laboratorium eller anlegg på lokale institusjonen. Hvis modell generasjon er forsøkt med lav kontrast eller feil rekonstruert data, modeller kan likevel genereres men av modellering resultater med egenskapene til de biologiske systemene kan simuleres kan være dårlig. Figur 3B viser et representativt bilde av hva en segmentert modell av myofibrils og mitokondrier ser ut.
Figur 4E viser en 3D-gjengivelse av tetrahedral nettet som produseres av iso2mesh. Så lenge de opprinnelige bilde stabel og segmentering aktivitetene er av god kvalitet, er dette ganske robust. Figur 6B og figur 6C viser en typisk RyR klyngen fordeling (i rødt) innenfor 3D cellular topologien. På dette stadiet er mesh selv ikke inndata i RyR simulator. En bildestakk cellegrensen og gapene mellom myofibrils og mitokondrier-generert fra segmentert bildene i Figur 4 -form store innganger i RyR simulator. Må utvises segmentere grensene for myofibrils og mitokondrier så nøyaktig som mulig; unøyaktig segmentations vil resultere i en unøyaktig fremstilling av cellen topologien i dataene, påvirker derfor RyR plassering i nettet. Dette vil deretter påvirke spatio-temporale dynamikken i kalsium signalering i cardiomyocyte (program 1).
Figur 7 viser 3 forekomster av simulert RyR klynger på samme mesh topologi etter benytter sfæriske kjernen intensitet estimator algoritmen. Se variasjonen i organiseringen av RyR klynger. Variasjonene har blitt målt for å være innen variasjon som ble funnet i den eksperimentelle data18. Må utvises velger kjernen sfære radius og trinn størrelsen som kjernen prøver RyR klyngen tetthet. Disse to faktorene påvirker hvordan kraftig eller diffusely en representasjon av tettheten av RyR klynger bli avbildet på nettet. En analyse av effekten av ulike verdier for parameterne vil bidra til å begrense på parameteren valgene for en rimelig mesh.
Den resulterende mesh RyR klynger, myofibrils og mitokondrier er en minimal cardiomyocyte strukturen. Denne mesh er brukt, samt varianter av det som var avledet fra andre cellestruktur data, kalsium dynamics og Bioenergi. En oversikt over disse to programmene er beskrevet nedenfor for å illustrere makt begrenset element modellering av cellestruktur gi innsikt på struktur-funksjon relasjoner.
Program 1 18 : Spatiotemporal dynamics av kalsium slipper i cardiomyocytes. Denne modellen har blitt brukt til å undersøke rollen av heterogene distribusjon av RyR klynger, myofibrils, og mitokondrier på kalsium signalering. Figur 8 viser spatiotemporal dynamikken i cytosolic kalsium i stigende fasen av forbigående når simuleres mesh topologien generert fra denne protokollen. Figur 8B viser heterogene gratis kalsium og fluorophore-grense-kalsium konsentrasjon over tid. Pilene peker til små flekker av høy kalsium på grunn av en høyere tetthet av RyR klynger eller mitokondrier i disse regionene. Figur 8 c viser simulert linje-scan-bilder som kan sammenlignes med eksperimentelle linje-scan bilder av kalsium dynamikken som vanligvis samles inn med live AC confocal mikroskopi. Modell simuleringen viser mye høyere oppløsning den romlige heterogenitet kalsium enn et eksperimentelt ervervet bilde. Videre, på grunn av modellen er avledet fra strukturelle mikroskopi data, antallet klynger som må være deaktivert (~ 4-6) etter elektrisk aktivisering for heterogeneities oppstår i AC confocal linje-scan bildet kan nettopp bestemmes. Lignende heterogeneities er observert eksperimentelt ervervet linje-scan bilder av kalsium dynamikken i dyremodeller hjertesvikt18
Programmet 2 27 : Spatiotemporal dynamikken i mitokondrie bioenergi i cardiomyocytes. Dette arbeidet overordnede mål er å studere forholdet mellom kalsium dynamics, mitokondrie bioenergi og muskel sammentrekning. Som et første skritt, er simuleringer av mitokondrie oxidative fosforylering i isolasjon innen cardiomyocyte utført. Slik distribusjon av RyR klynger er ikke nødvendig, og man kan bare bruke mesh på trinn 3.4. Som et mer komplekst program, kan bioenergi (program 2) kombineres med kalsium dynamics (program 1) i en modell som bruker alle komponenter vurdert i mesh og modell konstruksjon, dvs mitokondrier, myofibrils og ryanodine reseptorer.
Figur 9 representerer resultatene fra disse romlige metabolisme simuleringer over ulike regioner av en mesh generert ved hjelp av trinn 3.4. Figur 9A viser oksygen konsentrasjon hele cellen tverrsnitt, mens figur 9B viser konsentrasjonen av ADP bare i myofibril rommet i cellen. Figur 9C viser fordelingen av mitokondrie membran potensial i mitokondrie nettverket. Disse tallene viser ikke-uniform fordeling av mitokondrier og myofibrils i celle tverrsnittet. Avslører de også ikke-homogen metabolske landskapet fra denne ikke-uniform ultrastructure. Dette viser kraften i mikroskopi data basert endelig element simuleringer for å gi innsikt i struktur-funksjon relasjoner som er vanskelig å få gjennom eksperimentelle metoder alene.
Figur 1: Langendorff utarbeidelse av hjertet for kjemiske fiksering. (A) skjematisk av Langendorff perfusjon apparater. Stopcock inneholder en ventil å veksle mellom Tyrodes og etappe, den stabiliserende løsninger. Begeret ved foten til å fange løsninger som perfuse gjennom sentrum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: undersøke celle retning under lysende felt mikroskopi. (A) lyse feltet Vis toluen blå farget tykke delen av hjerte vev illustrerer celler som er langs orientert (L) og skrå orientert (O) med hensyn til tenkelig flyet; Merk striations i langs orientert cellen, for eksempel. (B) lyse feltet Vis for en vev som har transverse, tverrsnitt av cellen linje med imaging flyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: segmentering av elektronmikroskop dataene. (A) øyeblikksbilde av manuell segmentering av mitokondrier ved hjelp av verktøyet skulptur. (B) en 3D-visning på hele segmentert manuelt mitokondrier, myofibrils (i en rekke farger) og sarcolemma (i rosa). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: konvertere binære bildestakker til 3D tetrahedral mesh. (A-C) Binær masker sarcolemma, myofibrils og mitokondrier, henholdsvis. (D) fusjonerte visning av binære maskene av myofibrils (i rødt) og mitokondrier (i grønt). (E) for Representative tetrahedral maske som ble generert fra bildestakk i (D) med iso2mesh. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: CardiacCellMeshGenerator. Et skjermbilde av det grafiske brukergrensesnittet som følger protokollen publikasjonen for brukere å utføre trinn 4 og 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: simulere en realistisk RyR klyngen distribusjon på en segmentert elektronmikroskop bildestakk av cardiac ultrastructure. (A) A binære bildestakk viser gapene mellom myofibrils og mitokondrier, som representerer settet av alle bildepunkter der RyR klynger finner. (B) en 3D-gjengivelse (bilde ikke tiltrukket skala) av en av den simulerte RyR klynge distribusjoner (vises som røde kuler) i 3D-modellen i 3D image stabelen. grønne overflater representerer mitokondrier i bildestakk. Høyere (C) en forstørrelse (dermed en liten del er skåret ut av cellen tverrsnittet ved grensene) visning av overlegg av RyR klynger fra trinn 4 og beregningsorientert mesh fra trinn 3 på ett stykke 3D elektron tomografi bildestakk. (B) og (C) har blitt endret fra Rajagopal et al. 18 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: romlige fordelingen av numeriske tetthet av RyR klynger fra tre simulert RyR klyngen mønstre. Alle mesh noder er fargekodet fra hvit for numeriske tetthet 0.0 RyR klynger/µm3 til rødt for en maksimal numeriske tetthet 0,99 RyR klynger/µm3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Romlige heterogenitet i [Ca2 +]jeg i stigende fasen av Ca2 + forbigående. (A) gjennomsnittlige cytosolic fritt spre [Ca2 +]jeg (venstre) og Fluo-4 bundet Ca2 +, [F4Ca]jeg (høyre). (B) og (C) viser time-lapse øyeblikksbilder av fritt spre Ca2 + og F4Ca på z-platen tverrgående fly; svarte piler merke regioner av høy [Ca2 +]jeg på grunn av mitokondrie klynger; røde piler merke regioner av høy [Ca2 +]jeg på grunn av flere RyR-klynger i nærheten. (C) simulert linje skanninger av [Ca2 +]jeg (midten) [F4Ca]jeg (høyre). Linje plasseringen vises i cellen tverrsnitt til venstre. Den vannrette dimensjonen av cellen tverrsnittet er levert som en indikator på romlige skalaen i tverrsnitt av bildet. Dette tallet er endret fra Rajagopal et al. 18 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: romlige fordelingen av metabolitter og mitokondrie membran potensial generert fra romlige simulering av cardiac energi metabolism. (A) oksygen konsentrasjon hele cellen tverrsnitt i enheter av µM, (B) konsentrasjon av ADP bare i den myofibril delen av cellen i enheter av µM. (C) fordeling av mitokondrie membran potensial over den mitokondrie nettverk i enheter av mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: visualisering linje med en simulert RyR klyngen på R-statistikk pakken. Dette vinduet vises når RyR klynger simuleringer, viser først simulert punkt mønstre. Dette kan brukes som en indikator som RyR-simulatoren har avsluttet også, og kan forhøre kvaliteten på den simulerte mønsteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kjemikalier | Antall |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Destillert vann | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate reservelager | |
| Natrium cacodylate | 32.1 g [3t2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Utgjør 1 L med destillert vann | |
| pH 7.4 | |
| 0,3 M natrium cacodylate reservelager | |
| Natrium cacodylate | 64.2 g [3t2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Utgjør 1 L med destillert vann | |
| pH 7.4 | |
| Tyrode løsning sammensetning | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glukose | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenecid | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| NaCl/KCl/NaHCO3 1 L-løsning | |
| NaCl (molekylvekt 58.44 g/mol) | 81.2 g |
| KCl (molekylvekt 74.55 g/mol) | 2.24 g |
| NaHCO3 (molekylvekt 84.01 g/mol) | 14.28 g |
| Oppløse i 1 L destillert vann | |
| MgCl2/CaCl2 1 L løsning | |
| CaCl2 (2H2O) (molekylvekt 147 g/mol) | 1.764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0.814 g |
| Oppløse i 1 L destillert vann | |
| 1 M glukose 200 mL løsning | |
| Druesukker (molekylvekt 180.16 g/mol) | 36.03 g |
| Oppløse i 200 mL dobbel destillert vann | |
| Tyrode løsning 500 mL løsning | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glukose | 6 mL |
| Dobbel destillert vann | 400 mL |
| Boble oksygen i løsning for 5 min | |
| 2% PFA + 2,5% Glutaraldehyde +0.2% tanic acid bindemiddel i 0,15 M natrium cacodylate | |
| Paraformaldehyde pulver (PFA) | 2 g |
| Tanic syre | 0.2 g |
| Destillert vann | 20 mL |
| 25% glutaraldehyde | 10 mL |
| 0,3 M natrium cacodylate | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL destillert vann |
| 4% uranyl Acetate lagerløsning | |
| Uranyl Acetate | 4 g |
| Nær kokende dobbel destillert vann | 96 mL |
| Oppløse UA i nær bioling vann med en rørestang i en fumehood. | |
| Filtrere UA gjennom en Whatman #1 i 200 mL brun flaske for lett beskyttelse | |
| Cap tett og etiketten, lagre på 4 ° C | |
Tabell 1: Reagenser og antall for vev forberedelse for elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Over protokollen beskriver viktige trinn for å generere en roman endelig element geometriske modell av cardiomyocyte ultrastructure. Metoden gjør det mulig for beregningsorientert blanding av forskjellige mikroskopi (eller, i prinsippet andre data) modaliteter å utvikle en mer omfattende beregningsorientert modellen cardiomyocyte dynamics som inneholder informasjon om romlige celle arkitektur. Det er for øyeblikket ingen andre protokoll til å opprette slik modell av en cardiomyocyte.
Trinn 1 skisserer en protokoll for perfusjon fiksering. Alternativt kan hjertet være forbrukeravgift deles opp i mindre biter og midt i bindemiddel. Men denne prosessen må gjøres raskt og kan ha varierte resultater, avhengig av prøvene. I forfatternes erfaring sikrer perfusjon grundig infiltrasjon av bindemiddel i vev og celler. Forfatterne har også tidligere perfused hjertet med Krebs-Henseliet løsning for å gjøre hjertet slo før fiksering. Dette aktivert målene på arbeider hjertet før fiksering.
Elektronmikroskop behandlingstrinnene i trinn 2 er typisk elektron stengte. Behandling løsning antallene, spesielt av flekker løsninger og timing kan variere når du bruker andre Bildeteknikker som føljetong-blokk-ansikt skanning elektronmikroskop eller fokusert ion-beam mikroskopi28. Ervervet elektronmikroskop bildene må segmenteres inn forskjellige organelle områder, for eksempel mitokondrier, myofibrils og transverse tubuli. Dette kan utføres manuelt eller i et automatisert mote. Kontrasten i bildet stakken er delvis avhengig av suksessen til fargeprotokoll, men noen av denne kontrast går tapt når du utfører tomografi. Denne protokollen beskriver Manuell fremgangsmåte for å segmentere de ulike strukturene, selv om nye metoder for å utføre automatisk segmentering29 vil være mer gunstig generelt å forbedre datagjennomstrømning.
De viktigste egenskapene til å undersøke i elektronmikroskop datasettet er image kontrast og struktur bevaring. Farging oppskriften og harpiks innebygging blandinger i denne protokollen er raffinert høy kontrast mellom myofibrils og mitokondrier z-platene i cardiac cellen. For eksempel har forfatterne tidligere brukt veisalt i stedet for garvesyre i trinn 1.2 til å avgrense sarcoplasmic reticular nettverket. Dette hjalp identifisere ytre grenser myofibril pakker under organelle segmentering. Ekstra flekker kjemiske komponenter og tider kan også brukes for å visualisere membran strukturer, for eksempel sarcoplasmic retikulum eller tverrgående-aksiale tubuli30.
Bildene må også undersøkes for strukturelle degradering. Dårlig kvalitet fiksering eller elektronmikroskop behandling kan føre til alvorlige tap av mitokondrie cristae, høy andel av forskyves eller hovne mitokondrier og oppløsningen av deler av cellemembranen (sarcolemma). En nærmere og nøye undersøkelse kan også vise tap av t-rørformede og SR membraner, men er mindre opplagt til utrente øyet. Løsninger for dette problemet omfatter: (i) å sikre grundig perfusjon; (ii) dissekere vevet i små utvalg som også sikrer dyp gjennomtrenging av bindemiddel og flekker; (iii) sikrer at elektronmikroskop behandling er gjort i kalde løsninger eller på isen hvor angitt. og (iv) at tidsberegningen for flekker og dehydrering (dehydrering spesielt) følges strengt.
En typisk cardiomyocyte er ~ 20 µm i tverrsnitt diameter og ~ 100 µm i lengde. Dette gjør tenkelig hele hjerteceller en betydelig utfordring. Videre, endre retningen til muskelfibre i hjertet31 ytterligere kompliserer oppkjøpet av et bilde volum som akser justeres med transverse og langsgående aksene av en celle rundt. Bildet analyse programmer som IMOD aktiverer syntetiske re-justering av dataene i en ønsket retning. Nylige fremskritt innen føljetong blokk-ansikt skanning elektronmikroskop28 og tilknyttede image bearbeiding algoritmer29 også bidra til å løse disse problemene. Likevel vil nøye undersøkelse om tykke snitt under lys mikroskop og påfølgende re-orientering av blokken (trinn 2.5) øke sannsynligheten for imaging celler med rimelig justering av langsgående og tverrgående aksene med avbilding akser. Dette vil sikre at mesteparten av cellen volumet vil bli fanget i synsfeltet.
Protokollen trinn 3, 4 og 5 krever programvaren som er oppført i Tabellen for materiale som skal installeres. IMOD, R-statistikk pakken, iso2mesh og FiJi (en versjon av ImageJ mikroskopi data) har omfattende dokumentasjon og veiledninger om hvordan du bruker dem. CardiacCellMeshGenerator er et MATLAB-program som er utviklet for å gjøre det enklere for brukeren å bygge modell i en enkel arbeidsflyt. Brukere kan laste ned hele kildekoden, og programpakke fra github RyR-simulator oppbevaringssted link (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). Programmet, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, kan installeres i MATLAB som en app. Innganger for mesh generert i denne protokollen kan finnes i RyR-simulator/input-filer/mål-tomo-celle /, mens ytterligere innganger for RyR-klynge simulatoren finner RyR-simulator/input-filer/master-celle /. Før du starter programmet, må brukere kontrollere at installert iso2mesh mappen og dens undermapper har lagt å MATLAB banen. Likeledes sikre at den R-pakker er nødvendig (Tabell for materiale) for klyngen simulatoren også er installert i R.
En fremdriftsindikator er inkludert i programmet når du genererer mesh, når du genererer innganger for RyR klynger simulator, og når kartlegging RyR klyngen tettheter på nettet ved hjelp av RyR tetthet mapper; programmet vil gjengi 3D-nett i GUI når mesh generasjon trinn er avsluttet. Ved fullført RyR klyngen simuleringene på R-brukergrensesnitt, vises et grafisk vindu (Figur 10), som viser en simulert 3D RyR klyngen punkt mønstre.
Knappen "Generere Mesh" på GUI utløser iso2mesh funksjonen for å generere en tetrahedral maske. Modell oppløsningen kan justeres ved å sette "iso2mesh parametere" på GUI som justere maksimalt tetrahedral element volum og kant. Programmet skiller for øyeblikket elementene som utgjør regionen myofibril og mitokondrier regionene; Denne funksjonen vil bli utvidet med andre komponenter i cellen i fremtiden.
Brukere kan bruke 3D-gjengivelse av mesh og RyR klynger feilsøker disse trinnene. RyR klyngen simulering innstillinger, etol og numIter, i innstillinger. R påvirker fargenøyaktigheten RyR klyngen simuleringene; disse to parameterne bestemmer når en RyR klynge mønster simulering avsluttes. Disse parametrene kan justeres når en distribusjon av RyR klynger i vinduet R (Figur 10) for å sikre at: (i) alle klynger er nær z-plater; og (ii) klynger er spredt over hele kanalen tverrsnitt i stedet for å samle i noen én region. En adhoc følsomhet analyse av simuleringene til disse to parametere kan utføres for å finne en passende kombinasjon av etol og numIter.
Sfærisk kjernen intensitet estimator i trinn 5 bruker en sfære av valgte diameter som kjerne, som er gått over volumet av interesse (3D romlige modell i denne sammenheng). Disse parametrene kan justeres for dette jevne algoritmen på GUI i figur 5: (1) r_sphere definerer radius sfærisk kjernen utjevning; (2) hval definerer iterativ romlige trinn størrelsen som sfærisk kjernen må iterativt sendes over volumet.
En enkel tilnærming til å fastslå om romlige tetthet er tilstrekkelig er å undersøke fordelingen av RyR klyngen densitet som vist i figur 7. Tetthet verdiene skal distribueres slik at strøket av høye densitet er en lignende størrelse størrelsen på en RyR klynge mikroskopi data.
Gjeldende protokollen produserer en endelig element modell som bare inneholder realistisk distribusjon av myofibrils og mitokondrier RyR klynger. En utvidelse av dette trinnet vil være å simulere fordelingen av andre ion-kanaler som spiller en rolle i ECC, som sarco-endoplasmic reticular kalsium pumper (SERCA2a), natrium-kalsium vekslere (NCX) og sarcolemmal kalsium pumpene. Nøkkelen til disse utvidelsene er en analyse av den romlige fordelingen av ion kanalene immunofluorescence data. For eksempel NCX kanaler har blitt målt til fordeles jevnt over t-rørformede membraner på en gjennomsnittlig avstand på 0.67 µm, men deres forhold til RyR klynger er ikke så klart32. På den annen side, SERCA2a målretting antistoffer har tidligere blitt brukt til å markere SR33, men romlige tettheten av SERCA2a er ikke rapportert i litteraturen. På dette stadiet, kan derfor en jevn fordeling av SERCA 2A over SR nettverket og NCX over på t-tubuli antas med forsiktighet.
Som vist i representant resultatene, kan resulterende endelig element mesh brukes med begrenset element solvers34 simulere biokjemiske prosesser som kalsium signalering18 og bioenergi27 som reaksjon-diffusjon prosesser. Dette representeres ion-kanaler som reaksjon på nodene innen mesh topologien. Webområdene reaksjon fungere som kilder eller synker ulike kjemiske arter å representere kjemiske arter gjennom disse ion kanalene i ulike deler av cellen. Utgang mesh og RyR tetthet filer fra denne protokollen kan brukes med alle andre integrator eller i eventuelle andre miljøer, forutsatt at programvaren har funksjonen å gjenkjenne disse tekstfiler. Tekstfilene kan også bli manipulert av skript eller tredjeparts programvare å tilfredsstille inndatafilen formatkravene av miljøet valgfrihet. Den første søknaden på kalsium dynamics viser bare nytten av denne modellen for kalsium upstroke, men dette betyr ikke at at nettet ikke kan brukes for lengre tidsskala. Mesh og klynge tettheter kan brukes til å simulere flere kalsium sykluser, med opprettholdelse av homeostase og stabilitet bare avhengig av finite element Problemløseren som brukes.
Et langsiktig mål er å forbedre denne rørledningen modell bygningen for å gjøre det enkelt å lage strukturelt nøyaktig endelig element modeller av cardiomyocytes og andre celletyper. En automatisert segmentering algoritme har blitt utviklet nylig, som kan brukes på serie-blokk-ansikt skanning elektronmikroskop data for cardiomyocytes å opprette en modell for myofibrils og mitokondrier fordelingen i hele cellen med minimal bruker input29. Denne metoden vil bli utvidet for å segmentere t-tubule og SR membran nettverk i fremtiden. En mer generalisert versjon av RyR-simulator algoritmen som kan brukere analysere og simulere co steder mellom ion-kanal og organeller og mellom ulike ion-kanals datatyper i en høy gjennomstrømning mote er også under utvikling. En sømløs protokoll for å bygge en ferdig modell av cellen vil aktivere forskere å utføre modellbasert hypoteser tester på forholdet mellom cellestruktur og celle-funksjonen flere rutinemessig enn er mulig med eksperimentelle metoder alene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Royal Society av New Zealand Marsden raskt starte Grant 11-UOA-184, menneskelige grenser forskning Program grant RGP0027/2013 og australske Research Council Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
