Summary
Этот протокол описывает Роман метод для создания пространственно подробные конечно-элементной модели внутриклеточных архитектуры кардиомиоцитов из электронной микроскопии и confocal микроскопии изображений. Сила этой пространственно подробные модели показано с помощью тематических исследований в сигнализации кальция и биоэнергетика.
Abstract
С появлением трехмерных (3D) изображения технологии, такие как электронная томография серийный блок лицо сканирующей электронной микроскопии и конфокальная микроскопия, научное сообщество имеет беспрецедентный доступ к большим наборам данных в суб микрометра резолюции, которые характеризуют архитектурных ремоделирования, что сопровождает изменения в функции cardiomyocyte в здоровье и болезни. Однако эти наборы данных были использованы для изучения роли сотовой архитектуры ремоделирования cardiomyocyte функции. Целью настоящего Протокола является наметить способы создания точной конечно-элементной модели cardiomyocyte с помощью электронной микроскопии высокого разрешения и confocal микроскопии изображений. Подробную и точную модель сотовой архитектуры имеет значительный потенциал для обеспечить новое понимание cardiomyocyte биологии, больше, чем только эксперименты можно набрать. Сила этого метода заключается в его способности вычислительно предохранитель информацию от двух разнородных изображений условия ультраструктуры cardiomyocyte развивать одной единой и подробные модели cardiomyocyte. Этот протокол описывает шаги для интеграции электронная томография и confocal микроскопии изображений взрослых мужчин кардиомиоцитов крыс Wistar (имя для конкретной породы альбинос крысы) разработать половину Саркомер элементную модель cardiomyocyte. Процедура создает 3D элементную модель, содержащую точные, с высоким разрешением изображения (порядка ~ 35 Нм) распределения митохондрий, миофибрилл и рианодиновыми рецептор кластеры выпустить необходимые кальций для cardiomyocyte сокращение от sarcoplasmic ретикулярной сети (SR) в Миофибриллы и цитозольной отсек. Модель, созданная здесь, как иллюстрации не включать детали архитектуры поперечно трубочка или sarcoplasmic сети ретикулярные и поэтому является минимальным модель cardiomyocyte. Тем не менее, модель может применяться уже в на основе моделирования расследование роли клеточной структуры в сигнализации и митохондриальной Биоэнергетика кальция, который иллюстрируется и обсудили с помощью двух тематических исследований, которые представлены после подробный протокол.
Introduction
Муфта (ECC) возбуждения сокращение в самом сердце относится к важной и сложной муфты между электрического возбуждения cardiomyocyte мембраны и последующих механическое сокращение ячейки во время каждого сердцебиение. Математические модели играют ключевую роль в разработке количественных понимания взаимосвязанных биохимических процессов, которые регулируют потенциал действия1, цитозольной кальция, сигнализации2, биоэнергетика3и последующие поколение сократительной силы. Такие модели также успешно предсказал изменения пульса, когда один или несколько из этих биохимических процессов претерпевают изменения4,5. Все было признано высоко организованной Ультраструктура cardiomyocyte играть критически важную роль в нормальной сократительной функции клетки и всем сердцем. Действительно изменения морфологии и организации компонентов сердечной ультраструктуры происходят параллельно биохимические изменения в условиях заболевания как гипертрофия6, сердечной недостаточности7и8Диабетическая кардиомиопатия. Ли эти структурные изменения являются незначительными, адаптивной или патологических ответы на изменение биохимических условий по-прежнему во многом неизвестным9. По своей сути тесную связь между формой и функцией в биологии означает, что экспериментальные исследования самостоятельно не может обеспечить более глубокое понимание чем корреляции между структурной реконструкции и cardiomyocyte функции. Новое поколение математических моделей, которые могут включать структурные Ассамблея субклеточном компонентов, а также хорошо изучены биохимические процессы, являются необходимыми для разработки всеобъемлющей, количественное понимание взаимосвязи между структурой, биохимии и сократительной силы кардиомиоцитов. Этот протокол описывает методы, которые могут использоваться для создания структурно точных конечных элементов модели кардиомиоцитов, который может использоваться для таких расследований.
В последнее десятилетие наблюдается значительный прогресс в 3D электронной микроскопии10, конфокальная11и микроскопии суперразрешением12 , которые обеспечивают беспрецедентное, с высоким разрешением понимание нано- и микро масштабе Ассамблеи субклеточном компоненты cardiomyocyte. Недавно эти наборы данных были использованы для создания вычислительных моделей cardiomyocyte Ультраструктура13,14,,1516. Эти модели использовать налаженные инженерного моделирования метод, называемый метод конечных элементов17, для создания конечных элементов вычислительной сетки над какие биохимические процессы и cardiomyocyte схватки могут быть смоделированы. Однако эти модели ограничены резолюции и подробно, что микроскопии метод может предоставить в наборе данных изображения. К примеру электронной микроскопии может генерировать нанометрового уровня детализации структуры клеток, но это трудно определить специфических белков в пределах изображения, которые будут необходимы для создания модели. С другой стороны, супер резолюции оптической микроскопии могут обеспечить высокий контраст изображения с разрешением порядка 50 Нм только выбрать несколько молекулярных компонентов клетки. Только путем включения дополнительной информации от этих изображений форм можно один реально изучить чувствительность функции изменения в структуре. Корреляционные света и электронной микроскопии до сих пор не является обычной процедурой и она по-прежнему будет страдать ограничение что только ограниченное число компонентов могут витражи в представлении иммунофлюоресценции и коррелирует с видом электронной микроскопии.
Этот протокол представляет новый подход18 , которая использует19 статистические методы для анализа и вычислений предохранитель световой микроскопии информации на пространственное распределение каналов иона с электронной микроскопии информацию о других сердечных Ультраструктура компоненты, такие как миофибрилл и митохондрии. Это производит элементную модель, которая может использоваться с биофизические модели биохимических процессов для изучения роли cardiomyocyte субклеточном Организации на биохимические процессы, которые регулируют cardiomyocyte сужением. Например этот протокол может использоваться для создания моделей из здоровых и Стрептозотоцин индуцированной сахарным диабетом культивировании для изучения влияния структурной реконструкции на функции сердечной клетки, которая наблюдается в диабетической животных моделей8. Дополнительным преимуществом статистического характера представленных метода также иллюстрируется в протоколе: метод может генерировать несколько экземпляров конечных элементов геометрии, которые тесно имитировать экспериментально наблюдаемого изменения клеточной структуры.
Как обзор, протокол шаги включают: (i) подготовка сердечной ткани для электронной микроскопии для создания 3D изображения с достаточным разрешением и контрастностью; (ii) восстановления и сегментация 3D изображения стеков данных электронной микроскопии с помощью реконструкции 3D электронная микроскопия и анализ изображений программное обеспечение под названием IMOD20; (iii) использование iso2mesh21 для генерации сетки конечных элементов, используя сегментирована данные в качестве входных данных; (iv) использование Роман алгоритм и коды для картирования распределения ионных каналов на сетки конечных элементов.
Посылка подхода к каждый шаг описан в рамках протокола, и представитель результаты предоставляются в сопутствующих данных. Обзор приводится указание, как созданный пространственно подробные модели могут использоваться для изучения пространственной динамики кальция во время ECC, а также митохондриальной биоэнергетики. Обсуждаются некоторые из текущих ограничений протокола, а также новые события, которые идут по их преодолению и дальнейшего продвижения количественное понимание роли клеточной структуры к биологии сердечной системы. Рассматривается также как эти методы могут быть обобщены для создания модели конечных элементов других типов клеток.
Пользователи этого протокола может пропустить шаг 1 и реконструкции частью шаг 2, если они имеют доступ к ранее существовавших стек изображений электронной микроскопии. Пользователи, которые намерены приобретать их данных в сотрудничестве с более опытными microscopists электрон, возможно, пожелает обсудить и сравнить фиксации и окраски процедуры на шаге 1 с экспертом, чтобы определить оптимальный протокол для приобретения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены университета Окленда животных по этике и Калифорнийского университета Сан-Диего институционального ухода за животными и использования Комитета, где был первоначально разработан протокол ткани.
1. Экспериментальная подготовка
- Подготовка решения штока 0,15 и 0,3 М натрия cacodylate буферов при рН 7,4 согласно таблице 1.
-
Подготовить глютаральдегид фиксатором (2% параформальдегида (PFA) + 2,5% глютаральдегид дубильной кислоты 0,2% в 0,15 М натрия cacodylate buffer, рН 7,4) с использованием компонентов, перечисленных в таблице 1.
- Растворите 2 g порошка ПФА в 20 мл дистиллированной воды при температуре 60 ° C на конфорку при постоянном перемешивании.
- Добавьте 1 М растворе NaOH до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
- Подождите, пока температура раствора не ниже 40 ° C, а затем добавить 10 мл в низкотемпературном растворе глютаральдегида и 20 мл 0,3 М натрия cacodylate.
- Добавить 0,2 г дубильной кислоты и растворить его в решение.
- Добавьте 50 мл cacodylate натрия 0,15 М.
- Хранить три или четыре 20 мл флаконов сцинтилляционные фиксатором в холодильнике при температуре 4 ° C, или на льду, если используется в тот же день.
- Готовят раствор Tyrode в с 20 мм 2,3-butanedione monoxime (BDM), по рецепту в таблице 1.
-
Постройте Langendorff аппарат внутри вытяжной шкаф.
- Зажим два 100 мл Пластиковый шприц-тюбиков для двух разных реторты стоит, около 70 см в высоту от подставку.
- Подключите Пластиковый шприц-тюбиков и соединитель трубки с помощью 3 мм внутреннего диаметра труб и трехходовой кран, как показано на рисунке 1.
- Установите канюля наружный диаметр 3 мм в нижней части трубы, где сердце будет связано для перфузии фиксации разъема.
-
Заполните шприц-тюбиков с Tyrode в раствор и фиксирующие решения при 37 ° C.
- Удалите пузырьки воздуха внутри трубы, передавая шприц решения через них.
2. приобретение данных электронной микроскопии ультраструктуры Cardiomyocyte
- Подготовьте животное для обрезания и химической фиксации сердца.
Примечание: Этот протокол подробно описаны шаги для обработки взрослых мужчин крыс Wistar (имя для конкретной породы альбинос крысы) сердечной ткани. Протокол может потребовать изменения, когда сердечной ткани поступает из других видов.- Анестезировать животного, рассматривая крыса (200-250 г по массе тела) с 0,5 мл 250 ед/мл гепарина через внутрибрюшинной инъекции. Подождите 10 минут, а затем лечить Крыса с внутрибрюшинного введения Пентобарбитал (210 мг/кг веса тела).
- Подтвердите надлежащей степени анестезии, тестирование мыс щепотку рефлекс.
- Усыпить животных на шейки матки дислокации.
- Урожай, сердце, с использованием процедур вскрытия похож на ранее опубликованных статей JoVE22,23, затем поместите его в ледяной засолены.
- Изолировать восходящей части аорты и иглу. Убедитесь, что кончик канюлю сидит чуть выше полу лунного клапан, где ветви коронарных артерий. Привяжите нить плотно вокруг восходящей части аорты.
- Подключите канюлю к гравитации инициативе Langendorff аппарат работает на ~ 70 см над основанием системы (рис. 1).
- Поверните кран на системе Langendorff perfuse сердце с Tyrode в решения, в том числе 20 мм БДМ (ингибитор миозина) для 2-3 мин.
- Поверните кран начать перфузии с фиксатором параформальдегида 2%, глютаральдегид 2,5% и 0,2% дубильной кислоты в 0,15 М cacodylate натрия при 37 ° C за 10 мин. В случае успеха, сердце будет повернуть Бледно-коричневый и стать жесткой и резиновой.
- С помощью лезвия бритвы, вскрыть блоков ткани от левого желудочка (боковой) бесплатные стены и получить ткани блокирует около 1 мм3 размер.
- Храните образцы в предварительно охлажденным 20 мл флаконов сцинтилляционные же фиксатором на льду 2 h. хранить столько образцов максимально во флаконах и убедитесь, что образцы погружали в решении.
Предупреждение: Важно сохранить образцы холодного до и после 100% обезвоживания шаг ниже.
- Дальнейшей фиксации и окрашивания образцов для электронной микроскопии.
- Залить 100 мл 0,15 М натрия cacodylate буфера в стеклянный стакан и остудить на льду.
- Подготовьте равных объемах 4% осмия тетраоксид и 0,3 М cacodylate натрия, с последующим добавлением 0,08 г Ферроцианид калия сделать метал пятно раствор, содержащий 2% Ферроцианид калия в 2% осмия тетраоксид и 0,15 М натрия cacodylate. Прохладный решение на льду.
- Пипетка фиксатор и заменить его на достаточно холодные 0,15 М натрия cacodylate буфер погружаться проб в пробирки. Место флаконов на льду на 5 мин.
- Повторите шаг 2.2.3 еще четыре раза с 0,15 М cacodylate натрия для удаления избыточных фиксатором.
Предостережение: Не используйте Пипетки стеклянные потому что крошечные осколки могут попасть в выборку и может испортить Ножи алмазные при резании блока ткани. Это важно для предварительного охлаждения всех решений на льду перед их добавлением в образце. Важно также, что образец остается покрыта решения все время (очень короткие периоды частичного покрытия, продолжительностью не более чем на несколько секунд может кратко переносится во время решения обменов). При мытье или замене решения, добавьте новое решение быстро после удаления предыдущего решения. Держите сцинтилляционные флаконов на льду между моет. Обратите внимание, что этот шаг не является время чувствительной, блоков ткани могут быть вымыты немного дольше, если это необходимо. - Заменить натрия cacodylate буфер с ледяной хэви-метал пятно раствором и хранить его на льду на ночь. Убедитесь, что Ферроцианид смешивается хорошо встряхнув флакона вручную; решение должно черным.
Предупреждение: Работа в вытяжной шкаф при выполнении этот шаг, потому что осмий является токсичным. - Разбавляют 4% водный уранила ацетат (UA) раствор (Таблица 1) до 2%, с использованием равных объемах запасов UA решения и двойной дистиллированной воды и охладить его на льду.
- Замените охлаждают льдом 0,15 М натрия cacodylate буфер пятно хэви-метал и пусть образца Инкубируйте 5 мин на льду.
- Повторите шаг 2.2.7 еще четыре раза на льду, чтобы смыть пятно решение любой избыток хэви-метал.
- Промойте образцы четыре раза, с периодом ожидания 2-мин между ними в очищенной воде (двойной дистиллированной является достаточно).
- Заменить очищенная вода с ледяной 2% UA и пусть образец Инкубируйте 60-120 мин на льду.
- Остыть 5 ампул сцинтилляционные 20 мл этанола (достаточно, чтобы потопить образцы) на льду, который будет использоваться на шаге обезвоживания. 6 флаконов имеют увеличение доли этанола в дистиллированной воде: 20%, 50%, 70%, 90% и 100%.
- Залейте чистый ацетон в еще один флакон 20 мл сцинтилляции и прохладный на льду вместе с флакона этанолом.
- Промойте образцов в очищенной воде четыре раза с периодами ожидания 2 минут на льду мыть избыток UA.
- Обезвоживает образцов в этиловом спирте.
- Обезвоживает в серии холодного этанола, последовательно заменив решения внутри флакона пример следующим образом, на льду: 20% этанола для 10 мин; 50% этанола для 10 мин; 70% этанол 10 мин; 90% этанола для 10 мин; затем дважды в 100% этанола за 10 мин.
- Переход образца до комнатной температуры, заменив окончательный 100% этанола с охлаждением чистый ацетон и место флакон образца на стенде лаборатории комнатной температуре втечение 10 мин.
- Выполните одно больше 10 мин мыть в чистый ацетон при комнатной температуре для удаления конденсата, что наблюдается в рамках флаконов. Во время инкубации, составляют решения ацетон/смолы.
- Замените чистый ацетон во флаконах 50: 50 чистый ацетон и эпоксидной смолы (с пропорциями для эпоксидной смолы компонентов как указано заводом-изготовителем). Используйте все компоненты из той же партии. Оставьте на ночь смолы заполненный образец флаконов на ротор.
- Внедрите образцы смолы.
- Замените 75% смолы (25% ацетона) 50: 50 смолы и Инкубируйте 3 h, последовали дальнейшие инкубации/проникновения в 100% смолы для 4 ч при комнатной температуре.
- Замените свежей смолой 100% 100% смолы и оставить образец флаконов на ночь для глубокого проникновения смолы в образцах тканей.
- Взять образцы из флаконов и поместить их в контейнеры, которые являются печи чистые и имеют плоское основание; алюминий или серебряная фольга, выпечки чашки может использоваться для этой цели, например.
- Осторожно налить (чтобы избежать перемещения образцов) свежей смолой над образцы (таким образом внедрить образцы смолы) и полимеризации смолы и образцов в духовке при 60 ° C в течение 48 часов.
- Переориентировать смолы блоков ячеек изображения в поперечном сечении.
- Получите 1 мкм секции толщиной теста с использованием ultramicrotome с ножом стекла для оценки ориентации клетки24блоков смолы.
- Пятно толщиной испытания секций для 20 s с 1% толуола синий и 1% буры.
- Изучите мышечных клеток ориентации под микроскопом светлые области.
- Основываясь на ориентацию, выведено из образов разделов цветного теста, переориентировать продольно или косо ориентированных (аналогично рис. 2A) смолы блоки, чтобы обеспечить, что клетки подвергаются нож стекла так, что они будут сокращены в поперечном ( Аналогично Рисунок 2B).
- Разделах ткани изображения с помощью томографии электрона.
- Получить тонкий секции (~ 300 Нм) переориентирована ткани блоков с помощью алмаза нож и передачи секции на медной сетки25.
- Пятно толстые секции с 2% UA и Сато свинец25.
- Примените коллоидных частиц золота на обеих сторонах разделы25.
- Получите наборы серии единого или двойного оси наклона проецируемого изображения от-70 ° до + 70 °25.
- Для реконструкции стека 3D изображений (серия 2D изображения, которые обеспечивают 3D-информацию в разделе томография одного электрона) использовать IMOD20 клеток. Этот реконструированный стек будет дробиться на следующем шаге.
3. сегмент миофибрилл и митохондрий регионов из набора данных 3D изображения EM
- Выполните программу IMOD «3dmod».
- В рамках 3dmod графический интерфейс пользователя, введите адрес «.rec» или «.mrc» файл, который содержит 3D реконструкции изображений набора данных ячейки (созданного на шаге 2.7) в поле с надписью «изображение файл(ы):», затем нажмите «OK».
- В меню «Файл», выберите пункт Новая модель, а затем сохраните файл с соответствующим именем, с помощью «Сохранить модель как»... пункт меню «Файл».
Примечание: Объект в IMOD может содержать коллекцию сегментирована компонентов, которые составляют «объект». По умолчанию новая модель содержит новый объект с идентификатором «#1». - Под «Специальных» меню выберите «Инструменты рисования». Это откроет новую панель инструментов, аналогичный показанному на рисунке 3A.
Примечание: Существует несколько инструментов, которые могут быть использованы для создания контуров вокруг границ различных органеллы. Дополнительная помощь по пути использования этих инструментов можно найти в документации по20 IMOD. - Выберите параметр «Лепить» в меню «Инструменты рисования» и наведите указатель мыши в окне изображения; круговой контур, сосредоточены на указателя мыши появится.
- Удерживая среднюю кнопку мыши над митохондрий (тёмные файлов изображений, как показано по демаркации с зеленым контурных линий на рисунке 3A), перетащите периметр круга контура в форме его границы.
- После того, как завершится оконтуривание границы митохондрий, отпустите среднюю кнопку и повторите шаги 3.6 для каждого митохондрий в данных. Каждый контур будет автоматически распознаваться IMOD как новый контур в том же объекте.
- Под «Edit | Объект «меню, выберите «Новый» для создания нового объекта. Это будет автоматически увеличить общее количество объектов на один и присвоить этот номер в новый объект.
- Повторите шаги, 3,6 и 3,7 сегмента и сохранять контуры миофибриллы.
- Повторите шаг 3,8, последовал шаг 3,6, сегмент границы ячейки также.
- Сохраните файл модели в меню «Файл».
- Выполните следующие команды в окне командной строки для преобразования каждого объекта, группировка в двоичный маски, как показано на рисунке 4A-C.
- Извлечение объекта из модели «imodextract объект modelfile outputmodelfile» где «объект» — номер объекта, чтобы извлечь.
- Создать маску для этого объекта: imodmop-маска 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Преобразуйте файл в tif стека: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. Создание сетки конечных элементов с сегментированным компонентов
- Iso2mesh-это свободно распространяемая программа MATLAB преобразовать TIFF стеки изображений в объемный четырехгранный конечных элементов сетки. Скачать и добавьте iso2mesh в MATLAB путь от iso2mesh.sourceforge.net.
- Скачайте исходные коды и данных для моделирования RyR кластеров на сетку из https://github.com/CellSMB/RyR-simulator сайт github.
- Запустите приложение CardiacCellMeshGenerator MATLAB (рис. 5).
- Загрузите компонент маски различные органеллы в MATLAB, используя три кнопки на верхней левой стороне GUI.
- Создайте еще один двоичный образ стека, который разграничивает пробелы между миофибрилл и митохондрий как показано на рисунке 6A.
- Откройте ImageJ.
- С помощью файла | Открыть диалоговое окно, нагрузки tiff стеки миофибрилл и митохондрий в программу.
- Инициировать плагин добавлением изображения, выбрав «процесс | Калькулятор плюс».
- Выберите стек изображений Миофибриллы i1, митохондрии изображение стека как i2 и выбрать «Добавить» оператора. Нажмите кнопку «ОК».
- После того, как новый стек изображений, представляющий результат 4.5.4 появляется, выберите «Редактировать | Инвертировать» для создания стека изображений похож на рисунке 6A.
- Загрузите файл, содержащий двоичное изображение стека разрывов между миофибрилл и митохондрии, нажав на кнопку «RyRGapsFile» по программе CardiacCellMeshGenerator.
- Нажимаем «Создать сетку» на GUI. Это вызовет iso2mesh команды v2m с параметром «cgalmesh» для создания тетраэдрической сетки похож на рисунке 4E. Три файла будет выводиться в конце этого шага: файл .ele, файл .face и .node файл, который будет содержать список узлов, которые составляют элементы, узлы, которые составляют лица и координаты узлов , соответственно.
5. математически карта пространственно различной плотности ионных каналов интерес на сетки конечных элементов.
-
Генерировать необходимые материалы для RyR-симулятор, нажав кнопку с надписью создать RyR-симулятор входов на GUI.
Примечание: Кнопка будет вызывать функцию generateRyRsimulatorInputs.m, которая использует следующие данные из шага 4 для создания входы:
(1) outDir: расположение выходных файлов, которые необходимы для моделирования RyR кластера.
(2) imres: пикселей в трех направлениях стеки изображений.
(3) myofibril_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на Рисунок 4B.
(4) sarcolemma_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на Рисунок 4A.
(5) ryrgaps_file: файл, содержащий двоичное изображение стека как показано на рис 5A.- После выполнения этой функции, проверьте, что были созданы следующие файлы в каталог, указанный как outDir путь:
- d_axial_micron.txt, который представляет осевое расстояние между позицией z-диска и остальная часть пикселов в стек изображений.
- d_radial_micron.txt, который представляет евклидово расстояние (за исключением осевой компонент) от каждого пикселя в наборе возможных мест RyR кластера точек на плоскости z диска.
- W_micron.txt, который представляет список пространственных координат всех доступных позиций для RyR кластеров присутствовать.
- Оставшиеся 3 файлы в папке содержат суффикс «_pixel» вместо «_micron» для обозначения, что значения в этих файлах были написаны в виде координат пиксела.
-
Имитировать RyR кластера распределений в стеке бинарного образа миофибрилл.
- Нажмите кнопку с надписью «Open RyR симулятор в R» инициировать программу R.
- На R-gui, выберите «файл | Open» и найдите файл «параметры. R» в пакете RyR-тренажер (RyR-симулятор / / параметры источника. R).
- Также откройте файл ryr симулятор параллель. R, (расположен в RyR-симулятор/источник/ryr симулятор параллель. R). сред, как Rstudio (https://www.rstudio.com) или простой интерфейс командной строки может использоваться, например с помощью команды R64 в окне оболочки или команды.
- Измените параметры в настройках. R файл как описано ниже:
- Установить адрес папки, содержащей файлы, перечисленные в 5.1.2 для экспериментально полученных конфокальное изображение стека RyR кластеров и миофибрилл Path2.
Примечание: Github хранилища папки ввода файлы/мастер ячейка уже содержит файлы, которые были созданы для стека ранее собранные изображения. - Задать Path4 в адрес папки, где хранятся файлы, которые были созданы на шаге 5.1.2.
- Установите точку Path3 в папку, где пользователь хочет имитируемых места RyR кластера должен быть сохранен.
- Значение N количество кластеров RyR, чтобы быть смоделированы в модели (обычно в диапазоне от 200 до 300).
- Установите etol, терпимости, Настройка, разница между экспериментально измеренная пространственного распределения RyR кластеров и модель моделировать пространственное распределение RyR кластеров.
- Задать numIter, чтобы ограничить количество попыток, которые RyR-симулятор следует принять, чтобы найти шаблон имитируемых кластера RyR, который удовлетворяет etol значение.
Примечание: Значения для etol и numIter установлены типичные значения параметров. R файла. - Установить количество различных моделей кластеров RyR, которые пользователь хочет, чтобы имитировать numPatterns (как правило, это полезная практика имитации 99 шаблоны для статистических доверия).
- Задать numCores возможность использования нескольких потоков ЦП (ядра) для быстрее параллельной обработки с R для имитации точки модели.
- Установить адрес папки, содержащей файлы, перечисленные в 5.1.2 для экспериментально полученных конфокальное изображение стека RyR кластеров и миофибрилл Path2.
- Проверьте, что следующие пакеты устанавливаются с помощью пакетов установщика gui в снег, doSNOW, doparallel, foreach, итераторы и rgl R:.
- Выполнение симулятор, введя следующую команду в окне командной R: источник (' путь к ryr симулятор параллель. R', chdir = TRUE)
Примечание: RyR-симулятор программы выводится список файлов .txt (будет создан файл numPatterns), которые содержат списки координат в N строк и 3 столбцов, которые представляют x, y и z координаты N моделировать RyR кластеров.
-
Карта как пространственной плотности на вычислительные модели с помощью CardiacCellMeshGenerator.
- Выбрав кнопку с надписью «Выберите файл точек RyR», выбрать имитируемых RyR кластера распределения текстовый файл от тех, которые были производства по RyR-симулятор.
- Выполните «RyR плотность Mapper» на GUI в MATLAB. Это будет карта пространственного расположения имитируемых RyR кластеров в txt-файл в шаге 5.3.1 на сетки конечных элементов, который был создан в шаге с помощью метода, называемого сферической ядра интенсивности оценщик метод264.8.
Примечание: Результатом этого шага является файл с расширением .txt, который содержит список значений для числовых плотности ионного канала на единицу объема сферических на каждом из узлов вычислительной сетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 через Рисунок 7 обеспечивают представитель результаты нескольких ключевых шагов в настоящем протоколе: (i) визуализации и переориентации блоков ткани для поперечного сечения электронной микроскопии просмотров; (ii) создание стека изображений 3D электронной микроскопии; (iii) сегментации субклеточном Ультраструктура для органеллы интерес; (iv) создание сетки конечных элементов с помощью iso2mesh; (v) имитация реалистичные распределения RyR кластеров на сетки; (vi) после сопоставления этого пространственного распределения как пространственная плотность над вычислительной сетки.
Рисунок 2 показывает типичный светлые области изображения, которые показывают, как клетки появляются когда продольно ориентированных (рис. 2A, маркировку L), косо (рис. 2A, помечены O) и всеобьемлюще (рис. 2B) в связи с секущей плоскости. Косые и продольно ориентированных образцы экспонат страт, в то время как отруб ориентированной образцы не проявляют страт. Капилляров также появляются более круглую поперечного сечения взглядов, чем в косые взгляды.
На рисунке 3A показывает представитель изображение стека томограммы хорошего качества, которые могут быть приобретены, когда применяется протокол подготовки ткани на шаге 1. Будьте внимательны при выполнении 3D реконструкции из серии наклона изображения микроскопа. Неправильные отслеживания коллоидных частиц золота, или отсутствие достаточных золотые частицы могут повлиять на качество — изображения контрастность и изображения фокус — из томограммы значительно. Это влияет на возможность сегментировать различные структуры значительно. Уход и опыт необходимы для обеспечения достаточно окрашенных блоков ткани и что существует равномерное распределение коллоидных частиц золота через объем тканей. Если вы сомневаетесь, это может быть полезно проконсультироваться с специалист лаборатории или объекта на местные учреждения. Если модель поколения предпринимается попытка с низкой контрастностью или неправильно реконструированы данных, модели все еще может быть создан, но соответствие результатов моделирования с свойства биологических систем, чтобы имитировать может быть бедным. Рисунок 3B показывает представитель изображение выглядит сегментированной модели миофибрилл и митохондрии.
4E рисунок показывает 3D-рендеринга тетраэдрической сетки, которая производится iso2mesh. До тех пор, как оригинальные задачи стека и сегментация изображения имеют хорошее качество, этот шаг является достаточно надежным. Рисунок 6B и Рисунок 6 c показывают типичный дистрибутив RyR кластера (в красном) в 3D сотовой топологии. На данном этапе mesh, сам не является ввод в RyR симулятор. Стек изображений границы ячейки и разрывов между миофибрилл и митохондрий — генерируется из сегментированной изображений на рис. 4 — форма основных входов в RyR симулятор. Необходимо позаботиться сегмента границы миофибрилл и митохондрий как точно, как можно скорее; неточные segmentations приведет к неточное представление топологии ячейки данных, который будет, следовательно, влияющим на RyR размещение внутри сетки. Затем это скажется на пространственно временной динамики кальция сигнализации в cardiomyocyte (приложение 1).
Рисунок 7 показывает 3 экземпляров имитируемых RyR кластеров на той же сетки топология после использования алгоритма оценщик интенсивности сферических ядра. Обратите внимание на различия в Организации RyR кластеров. Эти варианты были измерены в изменчивость, которая была найдена в экспериментальных данных18. Будьте внимательны в выборе сферы радиуса ядра и размер шага, над которой ядро образцы кластера плотность RyR. Эти два фактора влияют на как резко или диффузно представление о плотности RyR кластеров будет изображен на сетку. Анализ влияния различных значений для этих параметров поможет сузить выбор параметра для разумной сетки.
Результате mesh RyR кластеров, миофибрилл, и митохондриях является минимальным модель структуры cardiomyocyte. Эта сетка была применена, а также варианты, которые были получены от других сотовой структуры данных, для изучения динамики кальция и биоэнергетика. Ниже приводится обзор этих двух приложений для иллюстрации власть элементного моделирования структуры клеток в давая идеи на функция структуры отношений.
Приложение 1 18 : Пространственно-временных динамика кальция релиз в кардиомиоцитов. Эта модель использовалась для изучения роли гетерогенных распределения кластеров RyR, миофибрилл и митохондрии на сигнализацию кальция. На рисунке 8 показана динамика пространственно-временных цитозольной кальция рост на этапе переходного процесса при моделировании на топологии сетки, созданные из настоящего Протокола. Рисунок 8B показывает гетерогенных свободного кальция и концентрации Флюорофор прыгните кальция с течением времени. Стрелки указывают на небольшие пятна высокого кальция за счет более высокой плотности RyR кластеров или митохондрий в этих регионах. Рисунок 8 c показано имитируемых линии сканирование изображений, которые можно сравнить с экспериментальной линии сканирование изображений динамики кальция, которые обычно собираются с помощью живой confocal микроскопии. Моделирование модель обеспечивает намного выше резолюции представление пространственная неоднородность кальция чем экспериментально полученные изображения. Кроме того из-за модели, производный от микроскопии структурных данных, количество кластеров, которые должны оставаться инактивированных (~ 4-6) после того, как электрические активации для неоднородностей происходят в конфокальный линия скан изображения может быть точно определено. Подобные неоднородностей наблюдаются в экспериментально полученные строки сканирование изображений динамики кальция в животных моделях сердечной недостаточности18
Приложение 2 27 : Пространственно-временных динамика митохондриальной биоэнергетики в кардиомиоцитов. Главной целью этой работы является изучение взаимосвязи между динамикой кальция, митохондриальных биоэнергетики и мышц. В качестве первого шага было проведено моделирование митохондриальной окислительного фосфорилирования в изоляции в течение cardiomyocyte. Таким образом распределение RyR кластеров не требуется, и можно просто использовать сетки на шаге 3.4. Как более сложное приложение биоэнергетика (приложение 2) может сочетаться с динамикой кальция (приложение 1) в модель, использующая всех компонентов, которые считаются в сетку построения модели, т.е. митохондрии, миофибрилл и рианодиновыми рецепторы.
Рисунок 9 представляет результаты моделирования пространственных метаболизм различных регионах сетки с помощью шаг 3.4. Рис. 9A изображает концентрация кислорода на протяжении поперечного сечения ячейки, в то время как Рисунок 9B показывает концентрацию ADP только в отсеке Миофибриллы ячейки. 9C рисунок изображает распределение митохондриальной мембраны потенциальных митохондриальной сети. Эти цифры показывают неравномерное распределение митохондрии и миофибрилл в сечении ячейки. Они также показывают неоднородных метаболических пейзаж, вытекающие из этой неоднородной Ультраструктура. Это свидетельствует, что власть микроскопии данных на основе моделирования методом конечных элементов для придания идеи на функция структуры отношений, которые в противном случае трудно получить через экспериментальные методы только.
Рисунок 1: подготовка Langendorff сердца для химической фиксации. (A) схема аппарата Langendorff перфузии. Запорный клапан для переключения между Tyrode содержит и фиксирующие решения. Стакан на базе используется для перехвата решения, которые perfuse через сердце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: изучение клеток ориентации под светлые области микроскопии. (A) яркий поле зрения толуол синий окрашенных толстые секции сердечной ткани, иллюстрирующие клетки, которые являются продольно ориентированной (L) и косо ориентированной (O) относительно плоскости изображения; Обратите внимание на страты продольно ориентированных на ячейку, например. (B) яркие поля вид ткани раздел, который имеет поперечные, сечение ячейки, в соответствие с плоскостью изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сегментация данных микроскопии. (A) снимок ручной сегментации митохондрий, используя средство лепить. (B) 3D вид полный вручную сегментирована митохондрий, миофибрилл (в различных цветах) и сарколеммы (в розовом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: преобразование стеки двоичных изображений в 3D тетраэдрической сетки. (A-C) Двоичные маски сарколеммы, миофибрилл и митохондрии, соответственно. (D) Merged просмотра двоичных масок миофибрилл (в красном) и митохондриях (в зеленом). (E) представитель тетраэдрической сетки, созданным из стека изображений в (D) с помощью iso2mesh. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: CardiacCellMeshGenerator. Скриншот графического пользовательского интерфейса, который сопровождает этот Протокол публикации для пользователей выполнять шаги 4 и 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Имитация реалистичные RyR кластера распределения стек сегментирована электронной микроскопии изображений сердца ультраструктуры. (A) A двоичное изображение стека с изображением разрывов между миофибрилл и митохондрий, которые представляют собой совокупность всех точек, где можно найти RyR кластеры. (B) 3D рендеринга (изображение не обращается к шкале) одной из моделируемых RyR кластера дистрибутивов (показано как красные сферы) в рамках 3D геометрии, изображенные в стеке 3D изображения; зеленой поверхности представляют собой митохондрий в стек изображений. (C) A-увеличение (таким образом небольшая часть вырезается из клеток сечения на границах) вид наложения RyR кластеров из шага 4 и вычислительной сетки из шага 3 на один фрагмент стека изображений томография 3D электронов. (B) и (C) были изменены от Раджагопала и др. 18 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: пространственное распределение числовых плотности RyR кластеров от трех имитации моделей кластера RyR. Все узлы сетки являются цветом от белого для числовых плотность 0.0 RyR кластеры/мкм3 красный для максимальной плотностью числовой 0.99 RyR кластеры/мкм3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: Пространственная неоднородность в [Ca2 +]i стадии роста Ca2 + переходных. (A) средний цитозольной свободно диффундирующих [Ca2 +],я (слева) и Fluo-4 связаны Ca2 +, [F4Ca]я (справа). (B) и (C) показывают покадровой снимки свободно диффундирующих Ca2 + и F4Ca на z диска, поперечной плоскости; черные стрелки Марк регионах высоких [Ca2 +]я благодаря митохондриальной кластеризации; красные стрелки Марк регионах высоких [Ca2 +]i из-за нескольких кластеров RyR в непосредственной близости. (C) имитируемых линии сканирования [Ca2 +]я (среднего) [F4Ca]я (справа). Позиция в строке показана на сечение ячейки слева. Горизонтальный размер поперечного сечения ячейка была оказана как индикатор пространственных масштаба в сечениях изображения. Эта цифра была изменена от Раджагопала и др. 18 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: пространственное распределение метаболитов и митохондриальной мембраны потенциальных генерируется из пространственного моделирования сердечной энергии метаболизма. (A) концентрация кислорода по всему сечению клетки в единицах мкм, (B) концентрация ADP только в Миофибриллы части клетки в единицах мкм. (C) распределение митохондриальной мембраны потенциал через Митохондриальные сеть в единицах mV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: Визуализация моделирования RyR кластера точки шаблона на R-статистика пакета. Это окно появляется в конце RyR кластеры моделирования, с изображением первой модели имитации точки. Это может использоваться в качестве индикатора RyR симулятор заключила также, который может допрашивать качество имитации моделей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Химические вещества | Количества |
| 0,2 HCl N | |
| 1 N HCl | 5 мл |
| Дистиллированная вода | 20 мл |
| 0,15 М натрия cacodylate буферных запасов | |
| Натрия cacodylate | 32.1 g [3H2O] |
| 0,2 HCl N | 25 мл |
| Составляют 1 Л дистиллированной водой | |
| рН 7,4 | |
| 0,3 М натрия cacodylate буферных запасов | |
| Натрия cacodylate | 64.2 g [3H2O] |
| 0,2 HCl N | 25 мл |
| Составляют 1 Л дистиллированной водой | |
| рН 7,4 | |
| Состав раствора Tyrode | |
| NaCl | 139 мм |
| ДКК | 3 мм |
| CaCl2 | 3 мм |
| 2 MgCl | 1 мм |
| Глюкоза | 12 мм |
| NaHCO3 | 17 мм |
| Пробенецид | 1 мм |
| BDM | 20 мм |
| 1 Л раствора NaCl/KCl/NaHCO3 | |
| NaCl (молекулярный вес 58,44 г/моль) | 81,2 g |
| KCl (молекулярная масса 74.55 г/моль) | 2.24 g |
| NaHCO3 (молекулярный вес 84.01 г/моль) | 14.28 g |
| Растворить в 1 Л дистиллированной воды | |
| MgCl2/CaCl2 1 Л раствора | |
| CaCl2 (2H2O) (молекулярный вес 147 г/моль) | 1,764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 г/моль) | 0,814 g |
| Растворить в 1 Л дистиллированной воды | |
| 1 М раствора глюкозы 200 мл | |
| Декстроза (молекулярная масса 180.16 г/моль) | 36.03 g |
| Растворить в 200 мл двойной дистиллированной воды | |
| Tyrode раствор 500 мл раствора | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 мл |
| Глюкоза | 6 мл |
| Двухместный дистиллированной воды | 400 мл |
| Пузырь кислорода в растворе для 5 мин | |
| 2% PFA + 2,5% глютаральдегид 0,2% Танич кислоты фиксатором в 0,15 М натрия cacodylate | |
| Параформальдегида порошок (PFA) | 2 g |
| Танич кислота | 0,2 г |
| Дистиллированная вода | 20 мл |
| 25% глутаровый | 10 мл |
| 0,3 натрия cacodylate М | 20 мл |
| Cacodylate натрия 0,15 М | 50 мл |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 мл дистиллированной воды |
| 4% раствор уранилнитрата ацетат | |
| Уранила ацетат | 4 g |
| Вблизи кипящей двойной дистиллированной воды | 96 мл |
| Растворите UA в вблизи кипящие воды с помощью мешалки в fumehood. | |
| Фильтр UA через фильтр ватман #1 в 200 мл коричневого легкие защиты | |
| Крышка плотно и этикетка, хранить при 4 ° C | |
Таблица 1: Реактивы и количества для подготовки ткани для электронной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вышеупомянутый Протокол описываются ключевые шаги для создания Роман элементного геометрическая модель ультраструктуры cardiomyocyte. Этот метод позволяет вычислительных слияние различных микроскопии (или, в принципе, другие данные) условия для разработки более всеобъемлющей модели вычислений cardiomyocyte динамики, которая включает в себя детали архитектуры пространственных клеток. Существует в настоящее время нет других доступных для создания такой модели cardiomyocyte протокол.
Шаг 1 излагается протокол для фиксации перфузии. В качестве альтернативы сердце может подакцизным, расчлененные на более мелкие куски и погружается в фиксатор. Однако этот процесс необходимо сделать быстро и может различные результаты, в зависимости от размера выборок. В опыте авторов перфузии обеспечивает тщательное проникновение фиксатором в ткани и клетки. Авторы также ранее увлажненную сердце с Кребса-Henseliet решения, чтобы сердце бить до фиксации. Это позволило измерений на рабочей сердце до фиксации.
Шаги обработки электронной микроскопии в шаге 2 являются типичными для электрона томографии. Обработки решения, особенно окрашивание решений и количества тайминги могут отличаться при использовании другие методы обработки изображений, например серийный блок лицо растровая электронная микроскопия или сосредоточены ионно лучевые микроскопии28. Приобретенных электронной микроскопии изображений должны быть сегментируются различные органеллы регионов, таких как митохондрии, миофибрилл и поперечные трубочки. Это может осуществляться вручную или в автоматическом режиме. Контраст в стеке изображения частично зависит успех окрашивания протокола, но некоторые из этот контраст теряется при выполнении томография. Этот протокол описывает действия вручную для сегментирования различных структур, хотя новые методы для выполнения автоматической сегментации29 будет более благоприятной в целом улучшить пропускную способность данных.
Наиболее важные качества для изучения в наборе электронной микроскопии являются сохранение изображения контраст и структура. Окрашивание рецепт и смолы, встраивание смеси в этом протоколе были доработаны для высокой контрастности между миофибрилл, митохондрии и z диски сердечной клетки. Например авторы ранее использовали хлорид кальция вместо дубильной кислоты на шаге 1.2 для демаркации sarcoplasmic ретикулярной сети. Это помогло с определением внешних границ Миофибриллы связки во время органеллы сегментации. Дополнительные окрашивание химических компонентов и время могут также использоваться для визуализации структуры мембраны, например саркоплазматический ретикулум или поперечно осевой трубочки30.
Изображения должны также рассматриваться для структурной деградации. Низкое качество фиксации или электронной микроскопии обработки может привести к тяжелой потери митохондриальной макул, высокая доля выбили или опухшие митохондрий и распад части клеточной мембраны (сарколеммы). Ближе и тщательного изучения могут также показать потери t трубчатые и SR мембраны, но менее очевидным для неопытного глаза. Решения для этой проблемы включают: (i) обеспечение тщательной перфузии; (ii) рассечения тканей в небольшие образцы, которые также обеспечивают глубокое проникновение фиксатором и пятна; (iii) обеспечение того, что обработка электронной микроскопии делается в холодных растворах или на льду везде, где задан; и (iv) обеспечение того, что строго соблюдаются временные интервалы для окрашивания и дегидратация (обезвоживание в частности).
Типичная cardiomyocyte-~ 20 мкм в диаметре сечения и ~ 100 мкм в длину. Это делает изображений всей сердце клетки значительную проблему. Кроме того изменение ориентации мышечных волокон в сердце31 далее затрудняет приобретение образ тома, чьи осей выравниваются с поперечной и продольной оси клетки интереса. Программы анализа изображений, такие как IMOD включения синтетических повторной выравнивание данных в желаемой ориентации. Последние достижения в последовательный блок лицо, сканирования электронной микроскопии28 и связанные изображения, обработки алгоритмов29 также помочь решить эти проблемы. Тем не менее тщательного изучения толстые разделов под микроскопом света и последующего повторного ориентацией блока (шаг 2,5) увеличит вероятность визуализации ячейки с разумной выравнивание продольной и поперечной осей с изображениями осей. Это будет гарантировать, что большая часть объема клетки будет захвачен в поле зрения.
Протокол шаги 3, 4 и 5 требует программного обеспечения, перечисленные в Таблице материалы для установки. IMOD, пакет R-статистика, iso2mesh и Фиджи (версия ImageJ для микроскопии данных) имеют обширную документацию и руководства о том, как их использовать. CardiacCellMeshGenerator представляет собой приложение MATLAB, который был разработан, чтобы сделать его проще для пользователя построить модель в простой рабочий процесс. Пользователи могут загрузить весь исходный код и пакет приложений по RyR симулятор github хранилище ссылке (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). Приложение, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, может устанавливаться в MATLAB как приложение. Входные данные для сетки, созданные в этом протоколе можно найти внутри RyR симулятор/ввода файлы/цель Томо клеток /, а дополнительные материалы для симулятор RyR кластера можно найти внутри RyR симулятор/ввода файлы/мастер клеток /. Перед запуском приложения, пользователи должны убедиться, что установленные iso2mesh папку и ее вложенные папки были добавлены в папку MATLAB. Аналогичным образом убедитесь, что необходимые R-пакеты (Таблица материалов) для кластера симулятор также были установлены в пределах р.
Индикатор был включен в приложение при генерации сетки, когда создания входы для кластера симулятор RyR и при сопоставлении RyR кластера плотность сетки с помощью картографа плотности RyR; app будет оказывать 3D-сетку в GUI, когда шаг сетки поколения заключил. После завершения моделирования кластера RyR в интерфейсе пользователя R, появится графическое окно (рис. 10), с изображением один из имитации 3D RyR кластера точки шаблонов.
«Создавать сетки» кнопка на GUI вызывает функцию iso2mesh для создания тетраэдрической сетки. Разрешение модели может быть отрегулирован параметры «iso2mesh» на GUI, что отрегулировать длину максимальная четырехгранный элемент тома и краем. В настоящее время программа распознает элементы, которые составляют Миофибриллы региона и митохондрии регионов; Эта функция будет расширена для включения других компонентов клетки в будущем.
Пользователи могут использовать 3D-рендеринга сетка и RyR блоков для устранения этих шагов. RyR моделирование параметров кластера, etol и numIter, внутри настройки. R влияет на точность моделирования RyR кластера; Эти два параметра определяют, когда RyR моделирования модель кластера прекращается. Эти параметры могут корректироваться после осмотра распределения RyR кластеров в окне R (рис. 10) для обеспечения того, чтобы: (i) все кластеры близки к z диски; и (ii) кластеры разбросаны по всему сечению, вместо того, чтобы агрегирования в любом одном регионе. Ad hoc анализ чувствительности моделей для этих двух параметров могут проводиться для определения надлежащего сочетания etol и numIter.
Оценщик интенсивности сферических ядра в шаге 5 использует выбранный диаметром как ядра, который передается через объем интерес (3D пространственной модели в этом контексте). Эти параметры могут быть скорректированы для этого сглаживания алгоритм на GUI на рисунке 5: r_sphere (1) определяет радиус сферической ядра сглаживания; (2) принадлежат определяет размер итеративного шага пространственной, над которым сферических ядра необходимо итеративно передали тома.
Простой подход, чтобы определить, достаточны ли параметры пространственная плотность должна проверить распределение значений плотности кластера RyR как показано на рисунке 7. Значения плотности должны быть распределены таким образом, что окрестности высокой плотности значений является аналогичного размера к размеру кластера RyR в данных микроскопии.
Текущий протокол производит элементную модель, которая содержит только реалистичные распределение миофибрилл, митохондрии и RyR кластеров. Расширение к этому шагу будет моделировать распределение других ионные каналы, которые играют определенную роль в ECC, например Сарко эндоплазматического ретикулярной кальция (SERCA2a), натриево кальциевые теплообменники (NCX) и sarcolemmal кальция насосов. Ключом к этих расширений является анализ пространственного распределения каналов иона от иммунофлюоресценции данных. Например чтобы быть равномерно распределены по t трубчатые мембраны в среднем интервал 0,67 мкм были измерены NCX каналы, но их отношения к RyR кластеров является не настолько ясно,32. С другой стороны определение антител SERCA2a ранее были использованы для обозначения SR33, но пространственная плотность SERCA2a не было сообщено в литературе. Таким образом на данном этапе, равномерное распределение SERCA 2A SR сети и NCX над t трубочки можно предположить с осторожностью.
Как показано в результатах представитель, результирующая элементную сетку может использоваться с методом конечных элементов решателей34 для имитации биохимические процессы, такие как кальций, сигнализации27 18 и биоэнергетике как реакции диффузии процессы. С этой целью каналы иона представлены как реакция сайтов в узлах сетки топологии. Реакция сайты выступать в качестве источников или поглотителей различных химических видов представляют поток химических видов через эти каналы иона на различных отсеков ячейки. Выходной сетки и RyR плотность файлов из этот протокол может использоваться с любой другой интегратором или в любой другой среде, условии, что программное обеспечение имеет функцию, чтобы признать эти текстовые файлы. Текстовые файлы могут также управляться сценариев или стороннего программного обеспечения, чтобы удовлетворить требования к формату входного файла среды выбора. Первое приложение на динамику кальция только демонстрирует полезность этой модели для кальция (рубильный) станок, но это не означает, что сетка не может использоваться для больше шкалы времени. Плотность сетки и кластер может использоваться для имитации нескольких циклов кальция, поддержание гомеостаза и стабильности только зависит от конечных элементов решения, которая используется.
Долгосрочной целью является улучшить этот конвейер построения, чтобы сделать его легким для создания моделей структурно точного элементного кардиомиоцитов и другие типы клеток модели. Алгоритм автоматической сегментации была разработана недавно, которые могут быть применены к данным сканирования электронной микроскопии серийный блок лицо кардиомиоцитов для создания модели миофибрилл и митохондрии распределения всей ячейки с минимальными пользователя ввода29. Этот метод будет распространяться на сегмент t трубочку и SR мембраны сетей в будущем. Также разрабатывается более обобщенной версии алгоритма RyR тренажер, который позволит пользователям анализировать и моделировать контакты между ионного канала и органеллы, а также различные Ион-типы каналов, в режиме высокой пропускной способности. Бесшовные протокол для создания полной модели ячейки позволит ученым для выполнения тестов гипотез на основе модели взаимосвязи между клеточной структуры и функции клеток более регулярно, чем это возможно в настоящее время экспериментальные подходы самостоятельно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Королевского общества Новой Зеландии Марсден быстро начать Грант 11-UOA-184, человека границ науки программы исследовательский грант RGP0027/2013 и Австралийский исследовательский совет обнаружения проекта Грант DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
