Summary
ويحدد هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء نموذج عنصر محدود مكانياً مفصلة من بنية داخل الخلايا من كارديوميوسيتيس من المجهر الإلكتروني وصور مجهرية [كنفوكل]. ويتجلى السلطة من هذا الطراز مفصلة مكانياً باستخدام دراسات الحالة في إشارات الكالسيوم والاستقلاب.
Abstract
مع ظهور تقنيات التصوير (3D) ثلاثي الأبعاد مثل التصوير المقطعي الإلكترون، المسلسل-كتلة-وجه المسح الميكروسكوب الإلكتروني والميكروسكوب [كنفوكل]، يتحمل المجتمع العلمي لم يسبق لها مثيل من الوصول إلى قواعد البيانات الكبيرة في ميكرومتر الفرعية القرار التي تتسم بها يعيد البناء المعماري الذي يرافق التغيرات في وظيفة كارديوميوسيتي في الصحة والمرض. بيد أن هذه مجموعات البيانات كانت غير مستغلة للتحقيق في دور إعادة عرض البنية الخلوية في الدالة كارديوميوسيتي. والغرض من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية إنشاء نموذج عنصر محدود دقيقة من كارديوميوسيتي استخدام الميكروسكوب الإلكتروني عالية الدقة وصور مجهرية [كنفوكل]. نموذج مفصل ودقيق للبنية الخلوية إمكانات كبيرة لتقديم رؤى جديدة في الأحياء كارديوميوسيتي، أكثر مما يمكن كسب التجارب وحدها. السلطة من هذا الأسلوب تكمن في قدرته لالصمامات حسابياً معلومات من اثنين من طرائق التصوير المتباينة من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي لوضع نموذج موحد ومفصل واحد كارديوميوسيتي. هذا البروتوكول يحدد خطوات لإدماج التصوير المقطعي الإلكترون وصور مجهرية [كنفوكل] cardiomyocytes الفئران ويستار (اسم لسلالة معينة من الفئران ألبينو) الذكور الكبار لوضع نموذج عنصر محدود ساركومير النصف كارديوميوسيتي. الإجراء بإنشاء نموذج عنصر محدود ثلاثي الأبعاد يحتوي تصوير عالية الجودة والدقة (حدود ~ 35 نانومتر) لتوزيع الميتوكوندريا، ميوفيبريلس ومجموعات مستقبلات ريانوديني أن الإفراج عن الكالسيوم اللازمة كارديوميوسيتي تقلص من شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic (ريال) في ميوفيبريل وحجرة سيتوسوليك. النموذج التي تم إنشاؤها هنا كمثال لا تتضمن تفاصيل بنية أنبوب عرضية أو شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic وبالتالي فهو نموذج الحد أدنى كارديوميوسيتي. ومع ذلك، يمكن فعلا تطبيق النموذج في التحقيقات على أساس المحاكاة في الدور هيكل الخلية في الاستقلاب إرسال الإشارات والمتقدريه الكالسيوم، الذي يتضح وتناقش استخدام اثنين من دراسات الحالة التي ترد بعد البروتوكول مفصلاً.
Introduction
اقتران الإثارة--انكماش (ECC) في القلب يشير إلى هامة ومعقدة اقتران بين الإثارة الكهربائية للغشاء كارديوميوسيتي وانكماش الميكانيكية اللاحقة للخلية أثناء كل نبضة. النماذج الرياضية وقد لعبت دوراً رئيسيا في تطوير فهم كمي للعمليات الكيميائية الحيوية المترابطة التي تنظم إمكانية العمل1، سيتوسوليك الكالسيوم مما يشير إلى2،3من الاستقلاب، واللاحقة توليد القوة الهوس. هذه النماذج أيضا بنجاح وتوقع تغييرات لنبضات القلب عند واحد أو العديد من هذه العمليات البيوكيميائية الخضوع للتعديلات4،5. يتزايد الاعتراف أولتراستروكتوري تنظيم درجة عالية من كارديوميوسيتي تلعب دوراً حاسما في الدالة الهوس العادي للخلية والقلب كله. في الواقع، تحدث التغييرات في مورفولوجيا وتنظيم مكونات أولتراستروكتوري القلب بالتوازي مع التغيرات البيوكيميائية في ظروف المرض مثل تضخم6،7من فشل القلب والسكري اعتلال عضلة القلب8. ما إذا كانت هذه التغييرات الهيكلية الردود المرضية البسيطة أو التكيف لتغير الظروف الكيميائية الحيوية لا تزال مجهولة إلى حد بعيد9. اقتران ضيق أصلاً بين الشكل والوظيفة في البيولوجيا يعني أن الدراسات التجريبية وحدها لا يمكن أن يوفر رؤى أعمق من العلاقات المتبادلة بين يعيد البناء الهيكلي والدالة كارديوميوسيتي. جيل جديد من النماذج الرياضية التي يمكن أن تدمج الجمعية الهيكلية من المكونات الفرعية الخلوية، جنبا إلى جنب مع العمليات البيوكيميائية مدروسة، ضرورية لتطوير فهم شامل، والكمي للعلاقة بين هيكل والكيمياء الحيوية والقوة الهوس في cardiomyocytes. هذا البروتوكول توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها لتوليد نماذج عنصر محدود هيكلي دقيقة من كارديوميوسيتيس التي يمكن استخدامها لمثل هذه التحقيقات.
شهد العقد الماضي تقدما ملحوظا في الميكروسكوب الإلكتروني 3D10و [كنفوكل]11مجهرية فائقة القرار12 التي تقدم أفكاراً لم يسبق لها مثيل، والدقة في تجميع نانو النطاق والحجم الصغير مكونات الخلوية دون كارديوميوسيتي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه البيانات لتوليد نماذج حسابية كارديوميوسيتي أولتراستروكتوري13،14،،من1516. استخدام هذه النماذج طريقة محاكاة هندسة راسخة، تسمى طريقة العناصر المحدودة17، لإنشاء عنصر محدد الشبكات الحاسوبية عبر كارديوميوسيتي والعمليات الكيميائية الحيوية التي يمكن محاكاة تقلصات. ومع ذلك، هذه النماذج محدودة بالقرار والتفاصيل التي يمكن أن توفر أسلوب الفحص المجهري في dataset صورة. على سبيل المثال، يمكن أن تولد الميكروسكوب الإلكتروني نانومتر-مستوى من التفصيل لهيكل الخلية، لكن من الصعب تحديد البروتينات المحددة داخل الصورة التي ستكون ضرورية لإنشاء نموذج. من ناحية أخرى، يمكن أن توفر مجهرية بصرية فائقة القرار الصور عالية التباين في قرارات بناء على أمر من 50 نانومتر فقط تحديد عدد قليل الجزيئية مكونات الخلية. إلا من خلال إدماج معلومات تكميلية من هذه الطرائق التصوير يمكن أحد واقعيا استكشاف حساسية الدالة إلى تغييرات في الهيكل. الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني لا يزال غير إجراء روتيني، وأنها سوف لا تزال تعاني الحد أن عدد محدود فقط من مكونات يمكن الملون في رأي الفلورة ويرتبط مع الرأي القائل بالميكروسكوب الإلكتروني.
ويقدم هذا البروتوكول نهج رواية18 يستخدم الأساليب الإحصائية19 لتحليل والصمامات حسابياً المعلومات الخفيفة الميكروسكوب في التوزيع المكاني لقنوات أيون بالميكروسكوب الإلكتروني معلومات عن القلب الأخرى مكونات أولتراستروكتوري، مثل ميوفيبريلس والميتوكوندريا. وهذا ينتج نموذج عنصر محدود التي يمكن استخدامها مع النماذج الفيزيائية للعمليات الكيميائية الحيوية لدراسة دور المنظمة كارديوميوسيتي الخلوية الفرعية على العمليات البيوكيميائية التي تنظم انكماش كارديوميوسيتي. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نماذج من صحية ونماذج myocytes القلب السكري الناجم عن بالستريبتوزوتوسين لدراسة تأثير يعيد البناء الهيكلي في وظيفة القلب الخلية التي يتم ملاحظتها في الحيوان السكري8. ميزة إضافية للطبيعة الإحصائية لطريقة عرض تتجلى أيضا في البروتوكول: الأسلوب يمكن إنشاء مثيلات متعددة من الهندسات العناصر المحدودة التي تحاكي عن كثب التغيرات الملحوظة تجريبيا في هيكل الخلية.
كنظرة عامة، تشمل الخطوات البروتوكول: (ط) إعداد الأنسجة القلبية الميكروسكوب الإلكتروني توليد صور ثلاثية الأبعاد مع القرار كافية والتباين؛ (ثانيا) إعادة الإعمار وتجزئة من مداخن صورة ثلاثية الأبعاد من البيانات الميكروسكوب الإلكتروني باستخدام برنامج تحليل الصور والتعمير الميكروسكوب الإلكتروني 3D دعا إيمود20؛ (ثالثا) باستخدام iso2mesh21 لتوليد شبكة عناصر محددة باستخدام بيانات مجزأة كمدخلات؛ (رابعا) باستخدام خوارزمية جديدة ورموز لخريطة توزيع قنوات أيون على شبكة العناصر المحددة.
الفرضية من النهج المتبع في كل خطوة ويرد ضمن البروتوكول، ويتم توفير نتائج الممثل في الأرقام المصاحبة لها. نظرة عامة حول يرد تحديد كيف يمكن استخدام نماذج مفصلة مكانياً الذي تم إنشاؤه لدراسة ديناميات المكانية من الكالسيوم خلال رعاية الطفولة المبكرة، فضلا عن الاستقلاب المتقدرية. مناقشة لبعض القيود المفروضة حاليا على البروتوكول، فضلا عن التطورات الجديدة التي تجري حاليا للتغلب عليها، والمضي قدما إلى فهم كمي لدور هيكل الخلية لنظم القلب بيولوجيا. ويتناول أيضا كيف يمكن تعميم هذه الأساليب لإنشاء نماذج العناصر المحدودة لأنواع أخرى من الخلايا.
المستخدمين لهذا البروتوكول قد تخطي الخطوة 1 والجزء التعمير من الخطوة 2 إذا كان لديهم الوصول إلى كومة صورة الميكروسكوب الإلكتروني موجودة من قبل. ولعل المستخدمين الذين يعتزمون الحصول على البيانات الخاصة بهم بالتعاون مع ميكروسكوبيستس الإلكترون أكثر خبرة لمناقشة ومقارنة بالتثبيت وإجراءات المصبوغة في الخطوة 1 مع الخبير لتحديد وضع بروتوكول أمثل لاقتناء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة أوكلاند الحيوان لجنة الأخلاقيات وجامعة كاليفورنيا في سان دييغو مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة، حيث وضعت أصلاً بروتوكول الأنسجة.
1-إعداد التجريبية
- إعداد حلول الأسهم الصوديوم 0.15 و 0.3 متر مربع مخازن كاكوديلاتي على درجة الحموضة 7.4 وفقا الجدول 1.
-
إعداد مثبت جلوتارالديهيدي (حمض التانيك 0.2% في م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت على درجة الحموضة 7.4 + 2% بارافورمالدهيد (PFA) + 2.5 ٪ glutaraldehyde) باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1.
- حل 2 غ مسحوق منهاج عمل بيجين في 20 مل ماء المقطر عند 60 درجة مئوية في هوتبلت مع التحريك المستمر.
- إضافة حل هيدروكسيد الصوديوم 1 م حتى الحل الواضح.
- انتظر حتى درجة الحرارة من أن الحل أقل من 40 درجة مئوية، ثم أضف 10 مل من جلوتارالديهيدي و 20 مل من كاكوديلاتي الصوديوم 0.3 متر.
- إضافة 0.2 جم حامض التانيك وتذوب في الحل.
- إضافة 50 مل كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر.
- تخزين 20 مل التﻷلؤ قنينة ثلاثة أو أربعة من مثبت في الثلاجة عند درجة 4 مئوية، أو على الجليد إذا ما استخدمت في نفس اليوم.
- إعداد الحل تيرودي مع 20 مم 2، 3-بوتانيديوني مونوكسيمي (متخذي قرارات العمل)، ووفقا للوصفة في الجدول 1.
-
بناء جهاز لانجيندورف داخل خزانة الأبخرة.
- المشبك أنابيب بلاستيكية حقنه 100 مل اثنين إلى اثنين المعوجة مختلفة تقف، عالية من قاعدة احتياطية حوالي 70 سم.
- قم بتوصيل أنابيب بلاستيكية حقنه وأنبوب موصل باستخدام 3 مم-الداخلية-قطر الأنبوب ومحبس الحنفية الثلاثية كما هو مبين في الشكل 1.
- تناسب قنية قطر خارجي 3 مم إلى الجزء السفلي من الموصل بالأنابيب، حيث سيكون مرتبطاً القلب للتثبيت التروية.
-
ملء الأنابيب المحاقن مع تيرودي للحل والحلول مثبت عند 37 درجة مئوية.
- إزالة فقاعات الهواء داخل الأنبوب بتمرير الحلول حقنه من خلالهم.
2-الحصول على بيانات المجهر الإلكتروني من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي
- إعداد الحيوان للختان والتثبيت الكيميائية من القلب.
ملاحظة: هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات لمعالجة البالغين الذكور ويستار (اسم لسلالة معينة من الفئران ألبينو) الفئران القلب الأنسجة. البروتوكول قد تتطلب تعديلات عند مصدرها أنسجة القلب الأنواع الأخرى.- تخدير الحيوان بعلاج الفئران (200-250 غم من وزن الجسم) مع 0.5 مل من 250 يو/مليلتر الهيبارين عن طريق الحقن داخل. انتظر لمدة 10 دقائق، ثم علاج الفئران بحقن داخل بينتوباربيتال (210 ملغ/كغ وزن الجسم).
- تأكيد درجة ملائمة من التخدير باختبار منعكس قرصه أخمص القدمين.
- Euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم.
- حصاد قلب استخدام إجراءات تشريح مماثل للمقالات جوف المنشورة سابقا22،23، ثم ضعه في المياه المالحة المثلج.
- عزل الشريان الاورطي تصاعدي وكانولاتي. تأكد من أن طرف القنية يجلس فقط فوق صمام شبه القمري، حيث الشرايين التاجية فرع. ربط مؤشر ترابط محكم حول الشريان الاورطي تصاعدي.
- قم بتوصيل القنية الجهاز لانجيندورف يحركها الجاذبية تعمل في ~ 70 سم فوق قاعدة للنظام (الشكل 1).
- تطور في محبس الحنفية على النظام لانجيندورف نتخلل القلب مع الحل تيرودي، بما في ذلك 20 مم متخذي قرارات العمل (مثبط الميوسين) لمدة 2-3 دقائق.
- تطور محبس الحنفية البدء التروية مع مثبت بارافورمالدهيد 2%، جلوتارالديهيدي 2.5%، وحمض التانيك 0.2% في 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إذا نجحت، سوف تتحول براون شاحب القلب وتصبح قاسية ومطاطي.
- باستخدام شفرة حلاقة، تفتيت كتل الأنسجة من الجدار الحر (الأفقي) البطين الأيسر والحصول على كتل الأنسجة حوالي 1 ملم3 في الحجم.
- تخزين العينات في تبريد قبل 20 مل التﻷلؤ قنينة من مثبت نفسه على الجليد ل 2 حاء تخزين عينات أكبر عدد ممكن في القنينات، وضمان أن العينات مغمورة في الحل.
تنبيه: من المهم الاحتفاظ بعينات الباردة حتى بعد الجفاف 100% الخطوة أدناه.
- المزيد من التثبيت وتلطيخ العينات للمجهر الإلكتروني.
- من أجل 100 مل م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت في كوب زجاج وبارد على الجليد.
- إعداد كميات متساوية من 4% أكسيد الازميوم و 0.3 م الصوديوم كاكوديلاتي، تليها إضافة ز 0.08 من فيروسيانيد البوتاسيوم لجعل حل وصمة عار معادن الثقيلة التي تتضمن فيروسيانيد البوتاسيوم 2% في كاكوديلاتي الصوديوم أكسيد الازميوم وم 0.15 2%. بارد الحل على الجليد.
- "الماصة؛" مثبت عليها واستبدالها بما يكفي الباردة م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت إلى غمر العينات في القنينات. وضع في قنينة على الجليد لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة 2.2.3 أربع مرات أكثر مع 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم لإزالة الزائدة مثبت.
تحذير: لا تستخدم الماصات الزجاجية لأن شظايا صغيرة يمكن أن يحصل في العينة، ويمكن أن تدمر السكاكين الماس أثناء تقطيع كتلة الأنسجة. من المهم قبل تبرد جميع الحلول على الجليد قبل إضافتها إلى النموذج. من المهم أيضا أن العينة لا تزال مغطاة بحل كل الوقت (فترات قصيرة جداً من تغطية جزئية دائمة لا يزيد عن بضع ثوان قد بإيجاز التغاضي خلال التبادلات الحل). عند الغسيل أو الاستعاضة عن الحلول، إضافة الحل الجديد بسرعة بعد إزالة الحل السابق. الاحتفاظ بقارورة التﻷلؤ على الجليد بين يغسل. علما بأن هذه الخطوة لا الوقت الحساسة، يمكن غسلها كتل الأنسجة أطول قليلاً، إذا لزم الأمر. - استبدال الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت مع الحل وصمة عار المثلج المعادن الثقيلة وتخزينها على الجليد بين عشية وضحاها. ضمان أن فيروسيانيد يختلط جيدا التي تهز القنينة باليد؛ وينبغي إيقاف الحل الأسود.
تنبيه: العمل في غطاء الدخان عند تنفيذ هذه الخطوة لأن أوزميوم السامة. - تمييع 4% مائي خلات (UA) الأسهم اليورانيل (الجدول 1) إلى % 2 باستخدام كميات متساوية من الأسهم حل تعميم الوصول إلى الخدمات، والماء المقطر مزدوجة، وتبرد بالثلج.
- تحل محل المعادن الثقيلة وصمة عار مع المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر تبريد الثلج، واسمحوا العينة احتضانها لمدة 5 دقائق على الجليد.
- كرر الخطوة 2.2.7 أربع مرات أكثر على الجليد شطف أي حل وصمة عار المعادن الثقيلة الزائدة.
- شطف العينات أربع مرات، مع فترة انتظار 2-دقيقة بينهما في تنقية المياه (المقطر مزدوجة غير كافية).
- استبدال الماء المنقي المثلج 2% احتضان تعميم الوصول إلى الخدمات، والسماح العينة لمدة 60-120 دقيقة على الجليد.
- تهدئة خمسة 20 مل التﻷلؤ قنينة من الإيثانول (ما يكفي لغمر العينات) على الجليد التي سيتم استخدامها في الخطوة الجفاف. قارورة الست بنسب متزايدة من الإيثانول في الماء المقطر: 20%، 50%، 70%، 90% و 100%.
- صب الأسيتون النقي في آخر 20 مل التﻷلؤ القنينة وباردة على الجليد جنبا إلى جنب مع قنينة الإيثانول.
- شطف عينات في تنقية المياه أربع مرات مع فترات الانتظار 2 دقيقة على الجليد لغسل الزائد تعميم الوصول إلى الخدمات.
- يذوي عينات في الإيثانول.
- يذوي في السلسلة الباردة الإيثانول بالاستعاضة تباعا عن الحل داخل القنينة عينة كما يلي، على الجليد: الإيثانول 20% لمدة 10 دقائق؛ الإيثانول 50% لمدة 10 دقائق؛ إيثانول 70% لمدة 10 دقائق؛ الإيثانول 90% لمدة 10 دقائق؛ ثم مرتين في الإيثانول 100% لمدة 10 دقائق.
- الانتقال عينة لدرجة حرارة الغرفة بالاستعاضة عن الإيثانول 100% النهائي مع تبريد الأسيتون النقي ومكان القنينة عينة على مقعد مختبر في درجة حرارة غرفة لمدة 10 دقائق.
- أداء الغسيل 10 دقيقة أكثر واحد في الأسيتون النقي في درجة حرارة الغرفة لإزالة التكثيف الذي يمكن ملاحظته داخل القنينات. حين تفرخ، تشكل الحلول الأسيتون/الراتنج.
- استبدال الأسيتون النقي في القنينات مع الراتنج الأسيتون والايبوكسي نقية 50: 50 (مع نسب لمكونات الراتنج الإيبوكسي كما ورد من الشركة المصنعة). استخدام كافة المكونات من نفس الدفعة. ترك قنينة مملوءة راتينج عينة بين عشية وضحاها في دوار.
- تضمين عينات في الراتنج.
- استبدال راتنج 50: 50 مع الراتنج 75% (25% الأسيتون) واحتضانها ح 3، تليها زيادة الاحتضان/التسلل إلى 100 ٪ راتنج ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال الراتنج 100% مع الطازجة 100 ٪ راتنج، وترك قنينات العينات بين عشية وضحاها لاختراق أعمق من الراتنج في عينات الأنسجة.
- أخذ عينات من القنينات ووضعها في حاويات ملائمة للفرن ولها قاعدة ثابتة؛ الألومنيوم أو الفضة رقائق الخبز أكواب يمكن استخدامها لهذا الغرض، على سبيل المثال.
- بلطف من أجل (لتجنب التشريد عينات) الطازجة الراتنج على العينات (وبالتالي تضمين عينات في الراتنج) وبلمره الراتنج والعينات في فرن عند 60 درجة مئوية ح 48.
- إعادة توجيه كتل الراتنج للخلايا الصورة في المقطع العرضي.
- الحصول على 1 ميكرومتر أقسام الاختبار سميكة من كتل الراتنج استخدام أولتراميكروتومي بسكين زجاج لتقييم خلية التوجه24.
- وصمة عار أقسام اختبار سميكة ل 20 ثانية مع التولوين 1% أزرق والحفر 1%.
- دراسة اتجاه الخلية العضلات تحت مجهر حقل مشرق.
- استناداً إلى التوجه الاستدلال من الصور لأقسام الاختبار الملون، إعادة توجيه طوليا أو منحرف الموجهة (مشابه الرقم 2 ألف) لراتنج القطع للتأكد من أن الخلايا تتعرض للسكين الزجاج حيث أن أنها ستخفض في المقطع العرضي ( مشابه الرقم 2).
- الصورة أقسام الأنسجة باستخدام التصوير المقطعي الإلكترون.
- الحصول على أبواب شبه رقيقة (~ 300 نانومتر) الأنسجة توجيه سكين القطع باستخدام الماس ونقل المقاطع إلى شبكات النحاس25.
- وصمة عار الفروع سميكة مع 2% تعميم الوصول إلى الخدمات وساتو الرصاص25.
- تطبيق جزيئات الذهب الغروية على كلا الجانبين من المقاطع25.
- الحصول على مجموعات من الميل المزدوج-محور واحد أو سلسلة من الصور المسقطة من-70 ° إلى + 70 °25.
- استخدام إيمود20 لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد المكدس (سلسلة من الصور ثنائية الأبعاد التي توفر معلومات ثلاثية الأبعاد لقسم التصوير المقطعي إلكترون واحد) من الخلية. سيتم تقسيم هذا المكدس أعيد بناؤها في الخطوة التالية.
3-الجزء ميوفيبريلس ومناطق الميتوكوندريا من Dataset صورة 3D م
- تنفيذ البرنامج إيمود "3dmod".
- ضمن واجهة المستخدم الرسومية 3dmod، قم بإدخال عنوان ".rec" أو ".mrc" الملف الذي يحتوي على 3D بناؤها dataset صورة للخلية (التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.7) في مربع إدخال المسمى "صورة الملف (الملفات):"، ثم اضغط "موافق".
- ضمن القائمة "ملف"، حدد "النموذج الجديد"، ثم حفظ الملف باسم مناسب باستخدام "حفظ نموذج ك".. بند القائمة "ملف".
ملاحظة: يمكن أن تحتوي على كائن في إيمود عبارة عن مجموعة من المكونات المقسمة التي تقوم بإنشاء "كائن". بشكل افتراضي، يحتوي نموذج جديد على كائن جديد بمعرف "#1". - ضمن القائمة "خاص"، حدد "أدوات الرسم". سيؤدي هذا إلى فتح شريط الأدوات جديد يماثل ما هو مبين في الشكل 3 ألف.
ملاحظة: هناك العديد من الأدوات التي يمكن استخدامها لإنشاء معالم حول حدود عضية مختلفة. يمكن الاطلاع على مزيد من التعليمات حول كيفية استخدام هذه الأدوات في وثائق20 إيمود. - اختر الخيار "نحت" في قائمة "أدوات الرسم"، وحرك الماوس إلى إطار الصورة؛ سوف تظهر محيط دائري تركزت على مؤشر الماوس.
- بالضغط على زر الماوس الأوسط باستمرار على ميتوكندريا (المناطق الأغمق من ملفات الصور، كما يتضح من ترسيم مع الخطوط الكنتورية الخضراء في الشكل 3 ألف)، اسحب محيط محيط الدائرة إلى شكل حدودها.
- بمجرد اكتمال الكنتوري الحدود ميتوكندريا، حرر الزر الأوسط وكرر الخطوات من 3.6 لكل ميتوكندريا في البيانات. سيتم تلقائياً الاعتراف كل كفاف من إيمود كمحيط جديد داخل نفس الكائن.
- إطار "تحرير | كائن "القائمة، حدد" جديد "لإنشاء كائن جديد. وهذا تلقائياً زيادة العدد الإجمالي للكائنات بواسطة واحدة وتعيين هذا الرقم للكائن الجديد.
- كرر الخطوات من 3.6 و 3.7 الجزء وحفظ معالم ميوفيبريل.
- كرر الخطوة 3، 8، تليها الخطوة 3، 6، الجزء حدود الخلية، كذلك.
- حفظ ملف نموذج ضمن القائمة "ملف".
- تنفيذ الأوامر التالية في نافذة سطر أوامر لتحويل كل كائن تجميع في قناع ثنائي كما هو موضح في الشكل 4أ-ج.
- استخراج كائن معين من نموذج "إيموديكستراكت الكائن موديلفيلي أووتبوتموديلفيلي" حيث هو "كائن" الرقم للكائن الذي تريد استخراجه.
- إنشاء قناع لهذا الكائن: إيمودموب-outputmask.mrc imagefile أووتبوتموديلفيلي القناع 255
- تحويل الملف إلى كدسة tif:-s mrc2tif outputmask.mrc outputmask.tif
4-إنشاء شبكة عنصر محدد من عناصر مجزأة
- Iso2mesh برنامج MATLAB متاحة بحرية لتحويل رصات الصور TIFF إلى تنسجم الحجمي هرمي ثلاثي العناصر المحدودة. قم بتحميل وإضافة iso2mesh إلى مسار MATLAB من iso2mesh.sourceforge.net.
- تحميل رموز المصدر والبيانات لمحاكاة الكتل RyR على الشبكة من https://github.com/CellSMB/RyR-simulator موقع github.
- بدء تشغيل التطبيق MATLAB كاردياكسيلميشجينيراتور (الشكل 5).
- تحميل أقنعة مكون عضية مختلفة في MATLAB باستخدام ثلاثة أزرار الضغط في الجانب العلوي الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية.
- إنشاء مكدس الصورة الثنائية آخر أنه فىالوقت الفجوات بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا كما هو موضح في الشكل 6A.
- افتح إيماجيج.
- استخدام الملف | فتح مربع الحوار، وتحميل رزمة المشاجرة myofibrils والميتوكوندريا في البرنامج.
- بدء البرنامج المساعد إضافة صورة عن طريق تحديد "عملية | آلة حاسبة بالإضافة إلى ".
- حدد المكدس الصورة ميوفيبريل ك i1، الميتوكوندريا الصورة المكدس ك i2، واختيار المشغل "إضافة". انقر فوق "موافق".
- بعد ظهور كومة صورة جديدة تمثل نتيجة 4.5.4، حدد "تحرير | عكس "لإنتاج رصة صور مشابهة الشكل 6A.
- تحميل ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية للفجوات القائمة بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا بالضغط على زر "ريرجابسفيلي" في برنامج كاردياكسيلميشجينيراتور.
- دفع "إنشاء شبكة" في واجهة المستخدم الرسومية. وهذا سوف يؤدي إلى v2m الأمر iso2mesh مع الخيار 'كجالميش' لإنشاء شبكة هرمي ثلاثي مماثل الشكل 4E. ستكون ثلاثة ملفات الإخراج في نهاية هذه الخطوة: ملف.ele وملف.face وملف.node الذي يحتوي على قائمة العقد التي تشكل العناصر، العقد التي تشكل الوجوه، واحداثيات العقد ، على التوالي.
5-رياضيا خريطة كثافة القنوات الأيونية للاهتمام على شبكة عنصر محدود مكانياً متفاوتة.
-
توليد المدخلات اللازمة للمحاكاة-RyR بالضغط على الزر المسمى توليد RyR-محاكاة المدخلات في واجهة المستخدم الرسومية.
ملاحظة: سوف يؤدي الزر دالة generateRyRsimulatorInputs.m، الذي يستخدم المعلومات التالية من الخطوة 4 لإنشاء المدخلات:
(1) أووتدير: موقع ملفات الإخراج التي ضرورية لمحاكاة الكتلة RyR.
(2) إيمريس: القرار بكسل في اتجاهات ثلاث رصات الصور.
(3) myofibril_file: الملف الذي يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 4 باء.
(4) sarcolemma_file: ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 4A.
(5) ryrgaps_file: ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 5 ألف.- بعد تنفيذ هذه المهمة، تحقق من أنه تم إنشاء الملفات التالية في الدليل المحدد كمسار أووتدير:
- d_axial_micron.txt، الذي يمثل المسافة المحورية بين موقف z-القرص وما تبقى من البيكسلات في الصورة المكدس.
- d_radial_micron.txt، الذي يمثل مسافة إقليدية (باستثناء عنصر محوري) من كل بكسل في مجموعة المواقع الكتلة RyR المحتملة إلى بكسل على متن الطائرة z-القرص.
- W_micron.txt، الذي يمثل قائمة الإحداثيات المكانية لجميع المناصب المتوفرة لمجموعات RyR أن يكون حاضرا.
- تتضمن الملفات المتبقية في المجلد 3 اللاحقة "_pixel" بدلاً من "_micron" للدلالة على أن القيم الموجودة في هذه الملفات قد كتب في شكل تنسيق بكسل.
-
محاكاة RyR الكتلة التوزيعات على المكدس الصورة الثنائية من ميوفيبريلس.
- تضغط على الزر المسمى "محاكي RyR المفتوحة في البحث والتطوير" الشروع في برنامج البحث والتطوير.
- R-واجهة المستخدم الرسومية، حدد "ملف | فتح "والعثور على الملف" إعدادات. R "ضمن حزمة محاكي RyR (RyR-محاكاة/المصدر/إعدادات. R).
- كما فتح ملف ryr-المحاكاة-الموازية. R (الموجود في RyR-محاكاة/المصدر/ryr-محاكاة-التوازي. R)-البيئات مثل رستوديو (https://www.rstudio.com) أو واجهة سطر الأوامر عادي يمكن استخدامها، مثلاً باستخدام الأمر R64 في نافذة الأوامر أو قذيفة.
- تغيير المعلمات في الإعدادات. R الملف كما هو مفصل أدناه:
- تعيين Path2 إلى عنوان المجلد الذي يحتوي على الملفات المدرجة في 5.1.2 رصة صور [كنفوكل] تجريبيا مكتسبة من مجموعات RyR وميوفيبريلس.
ملاحظة: github مستودع المجلد الإدخال--الملفات/الماجستير-الخلية/يحتوي بالفعل على الملفات التي تم إنشاؤها لكومة صورة التي تم جمعها سابقا. - تعيين Path4 إلى عنوان مجلد حيث يتم تخزين الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.1.2.
- تعيين نقطة Path3 إلى مجلد حيث يريد المستخدم مواقع الكتلة RyR محاكاة ليتم حفظها.
- مجموعة N إلى عدد الكتل RyR محاكاة في النموذج (عادة في المجموعة من 200 إلى 300).
- تعيين أتول، تسامح الإعداد للفرق بين التوزيع المكاني المقاسة تجريبيا لمجموعات RyR ونموذج محاكاة التوزيع المكاني لمجموعات RyR.
- تعيين نوميتير وضع حد لعدد محاولات ينبغي أن RyR--جهاز محاكاة العثور على نقش كتلة RyR محاكاة الذي يفي بقيمة أتول.
ملاحظة: تم تعيين قيم أتول ونوميتير إلى القيم النموذجية ضمن الإعدادات. ملف البحث والتطوير. - تعيين نومباتيرنس إلى العدد من مختلف أنماط الكتلة RyR التي يريد المستخدم لمحاكاة (عادة، ممارسة مفيدة محاكاة أنماط 99 للثقة الإحصائية).
- تعيين نومكوريس لتمكين استخدام وحدة المعالجة المركزية العديد من المواضيع (النوى) للمعالجة مع البحث والتطوير لمحاكاة أنماط نقطة المتوازية أسرع.
- تعيين Path2 إلى عنوان المجلد الذي يحتوي على الملفات المدرجة في 5.1.2 رصة صور [كنفوكل] تجريبيا مكتسبة من مجموعات RyR وميوفيبريلس.
- تحقق من أن الحزم التالية مثبتة باستخدام مثبت حزمة واجهة المستخدم الرسومية في r: الثلج، دوسنوو، دوباراليل، foreach، المكررات، ورجل.
- تنفيذ المحاكاة عن طريق إدخال الأمر التالي في نافذة الأوامر R: المصدر (' الطريق إلى ryr-محاكاة-الموازية. R '، chdir = TRUE)
ملاحظة: إخراج برنامج محاكاة RyR هو قائمة بملفات.txt (سيتم إنشاء ملف نومباتيرنس) التي تحتوي على تنسيق القوائم في الصفوف N ومحاكاة 3 أعمدة، التي تمثل x و y، و z إحداثيات N المجموعات RyR.
-
خريطة النقاط الكثافة المكانية على نموذج حسابية باستخدام في كاردياكسيلميشجينيراتور.
- عن طريق تحديد الزر المسمى "حدد ملف نقاط RyR"، اختر ملف نصي توزيع كتلة RyR محاكاة من تلك التي كانت المخرجات التي RyR--جهاز محاكاة.
- تنفيذ "مخطط كثافة RyR" في واجهة المستخدم الرسومية في MATLAB. هذا سوف تعيين المواقع المكانية الكتل RyR المحاكاة في ملف.txt في خطوة 5.3.1 على شبكة العناصر المحددة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.8 باستخدام أسلوب يسمى نواة كروية كثافة مقدر أسلوب26.
ملاحظة: الإخراج من هذه الخطوة هو ملف مع الملحق.txt يحتوي على قائمة قيم الكثافة العددية لايون-قناة لكل وحدة حجم كروية في كل من عقد الشبكة الحاسوبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 2 إلى الرقم 7 توفر نتائج تمثيلية للعديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول: (ط) تصور وإعادة توجيه كتل الأنسجة لآراء مستعرضة المجهر الإلكتروني؛ (ثانيا) إنشاء كومة صورة 3D مجهر الإلكتروني؛ (ثالثا) بتجزئة أولتراستروكتوري الخلوية الفرعية العضيات اهتمام؛ (رابعا) جيل شبكة العناصر المحددة باستخدام iso2mesh؛ (ت) محاكاة واقعية توزيع مجموعات RyR على الشبكة؛ (سادسا) متبوعاً بتعيين هذا التوزيع المكاني ككثافة مكانية عبر الشبكة الحاسوبية.
الشكل 2 يعرض الحقل مشرق النموذجية الصور التي تظهر كيف تظهر الخلايا عند المنحى طوليا (الشكل 2A، وصفت L)، منحرف (الشكل 2A، المسمى س) وكروسسيكتيونالي (الشكل 2) فيما يتعلق قطع الطائرة. معرض عينات منحرف وتوجه طوليا التصدعات، بينما لا يحمل عينات كروسسيكتيونالي المنحى التصدعات. كما تظهر الشعيرات الدموية أكثر تعميما في الآراء مستعرضة من الآراء منحرف.
ويبين الشكل 3 ألف صورة تمثيلية لكومة توموجرام النوعية الجيدة التي يمكن الحصول عليها عندما يتم اتباع البروتوكول إعداد الأنسجة في الخطوة 1. يجب توخي الحذر عند تنفيذ إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من سلسلة إمالة صورة مجهر. تتبع غير صحيحة لجزيئات الذهب الغرواني، أو عدم وجود جزيئات الذهب كافية يمكن أن يؤثر على النوعية – صورة التركيز وعلى النقيض من الصورة – من توموجرام إلى حد كبير. وهذا يؤثر على القدرة على الجزء هياكل مختلفة إلى حد كبير. الرعاية وخبرة ضرورية لضمان أن كتل الأنسجة ملطخة بما فيه الكفاية، وأن هناك توزيعاً حتى جزيئات الذهب الغرواني من خلال حجم الأنسجة. إذا كنت في شك، قد يكون من المفيد التشاور مع أخصائي مختبر أو مرفق في المؤسسات المحلية. إذا كان الجيل النموذجي هو حاول مع التباين المنخفض أو استعادة البيانات بشكل غير صحيح، قد لا يزال يتم إنشاء نماذج لكن قد تكون المراسلات لنمذجة النتائج مع خصائص النظم البيولوجية محاكاة الفقراء. ويبين الشكل 3B صورة تمثيلية لما يشبه نموذج مجزأة myofibrils والميتوكوندريا.
ويبين 4E الشكل عرض ثلاثي الأبعاد مش هرمي ثلاثي التي يتم إنتاجها بواسطة iso2mesh. طالما المهام المكدس وتجزئة الصورة الأصلية من نوعية جيدة، إلا أن هذه الخطوة قوية إلى حد ما. الشكل 6B و الشكل 6 إظهار توزيع كتلة RyR نموذجي (باللون الأحمر) ضمن الطبولوجيا الخلوية ثلاثية الأبعاد. في هذه المرحلة، لا مش نفسه الإدخال في محاكاة RyR. رصة صور حدود الخلية، والفجوات بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا – المتولدة من الصور مجزأة في الشكل 4 – تشكل مدخلات رئيسية في محاكاة RyR. ويجب الحرص على الجزء حدود myofibrils والميتوكوندريا على أدق وجه ممكن؛ سيؤدي إلى الانقسامات غير دقيقة تمثيل غير دقيقة من الطوبولوجيا خلية في البيانات، والتي ستؤثر على التالي موضع RyR ضمن الشبكة. وهذا سيؤثر على ثم الزمانية ديناميات الكالسيوم إشارات في كارديوميوسيتي (التطبيق 1).
يبين الشكل 7 مش 3 حالات محاكاة RyR الكتل على نفس طبولوجيا بعد استخدام خوارزمية مقدر كثافة نواة كروية. لاحظ الاختلاف في تنظيم مجموعات RyR. تم قياس هذه الاختلافات ضمن التغيرات التي عثر عليها في بيانات تجريبية18. ويجب الحرص في اختيار نصف قطر المجال نواة وحجم الخطوة التي عينات النواة كثافة الكتلة RyR. يؤثر هذان العاملان كيف حادا أو تصطبغ سوف يصور تمثيل لكثافة الكتل RyR على الشبكة. تحليلاً لتأثير القيم المختلفة لهذه المعلمات سوف يساعد على تضييق على اختيارات المعلمة لشبكة معقولة.
مش الناتجة من التكتلات و myofibrils الميتوكوندريا RyR نموذج الحد أدنى من بنية كارديوميوسيتي. تم تطبيق هذه الشبكة، فضلا عن الاختلافات لأنها مستمدة من بيانات البنية الخلوية الأخرى، لدراسة ديناميات الكالسيوم والاستقلاب. ويرد أدناه لمحة عامة عن هذه التطبيقات اثنين لتوضيح السلطة من نمذجة العناصر المحدودة من هيكل الخلية في إعطاء رؤى بشأن هيكل-وظيفة علاقات.
التطبيق 1 18 : إطلاق ديناميات الزمانية المكانية للكالسيوم في كارديوميوسيتيس- وقد استخدمت هذا النموذج دراسة دور التوزيع غير المتجانس RyR التكتلات، ميوفيبريلس، والميتوكوندريا على إشارات الكالسيوم. يبين الشكل 8 ديناميات الزمانية المكانية من الكالسيوم سيتوسوليك أثناء مرحلة ارتفاع عابر عند محاكاة على طبولوجيا الشبكة التي تم إنشاؤها من هذا البروتوكول. ويظهر 8B الشكل الكالسيوم الحرة غير متجانسة وتركيز الكالسيوم-فلوروفوري-منضم على مر الزمن. تشير الأسهم إلى بقع صغيرة من الكالسيوم عالية نظراً لكثافة أعلى من مجموعات RyR أو الميتوكوندريا في تلك المناطق. ويبين الشكل 8 محاكاة الخط-مسح الصور التي يمكن مقارنتها بالصور خط المسح الضوئي التجريبي لديناميات الكالسيوم التي يتم جمعها عادة استخدام حية مجهرية [كنفوكل]. المحاكاة النموذجية عرضاً كثير أعلى قرار لعدم تجانس المكانية من الكالسيوم من صورة التجربة مكتسبة. وعلاوة على ذلك، نظراً لنموذج مستمدة من بيانات الفحص المجهري الهيكلية، إبطال عدد الكتل يجب أن تبقى (~ 4-6) بعد التنشيط الكهربائي للتغاير تحدث في صورة خط المسح الضوئي [كنفوكل] يمكن تحديد دقة. ولوحظت التغاير مماثلة في صور خط المسح الضوئي التجربة المكتسبة من ديناميات الكالسيوم في نماذج حيوانية لفشل القلب18
تطبيق 2 27 : ديناميات الزمانية المكانية الاستقلاب المتقدرية في cardiomyocytes- هدف الأسمى من هذا العمل دراسة العلاقة بين ديناميات الكالسيوم والاستقلاب mitochondrial وتقلص العضلات. كخطوة أولى، تم إجراء محاكاة الفسفرة المتقدرية في عزلة داخل كارديوميوسيتي. على هذا النحو، ليست هناك حاجة توزيع مجموعات RyR، ويمكن للمرء ببساطة استخدام الشبكة في الخطوة 3.4. كتطبيق أكثر تعقيداً، يمكن أن يقترن الاستقلاب (تطبيق 2) مع ديناميات الكالسيوم (التطبيق 1) في نموذج يستخدم كافة المكونات التي نظرت في مش والبناء النموذجي، أي من الميتوكوندريا وميوفيبريلس وريانوديني مستقبلات.
ويمثل الرقم 9 النتائج من هذه المحاكاة الأيض المكانية عبر مناطق مختلفة من الشبكة التي تم إنشاؤها باستخدام الخطوة 3.4. يصور الشكل 9 ألف تركيز الأكسجين في جميع أنحاء الخلية المقطع العرضي، بينما يوضح الشكل 9B تركيز ADP فقط في حجرة ميوفيبريل الخلية. ويصور الشكل 9 توزيع غشاء الميتوكوندريا المحتملة عبر الشبكة المتقدرية. وهذه الأرقام تكشف عن التوزيع غير موحدة الميتوكوندريا وميوفيبريلس في المقطع العرضي الخلية. كما أنها تكشف عن المناظر الطبيعية متنافرة الأيضية الناتجة عن هذا أولتراستروكتوري غير موحدة. وهذا يدل على قوة البيانات مجهرية على أساس المحاكاة العناصر المحدودة لإعطاء رؤى بشأن علاقات بنية الدالة التي يصعب الحصول عليها من خلال الأساليب التجريبية وحدها.
رقم 1: إعداد لانجيندورف من القلب للتثبيت الكيميائي- (أ) التخطيطي جهاز نضح لانجيندورف. محبس الحنفية تحتوي على صمام للتبديل بين تيرودي في وحلول مثبت. الكأس في القاعدة تستخدم لصيد الحلول التي نتخلل عن طريق القلب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دراسة اتجاه الخلية تحت مجهر الحقل مشرق. (أ) عرض الحقل مشرق قسم التولوين الأزرق الملون سميكة من أنسجة القلب التي توضح الخلايا طوليا الموجه (L) و (س) منحرف المنحى فيما يتعلق بالطائرة التصوير؛ ملاحظة التصدعات في الخلية طوليا موجهة، على سبيل المثال. (ب) عرض الحقل مشرق قسم الأنسجة يحتوي على شريحة عرضية، من الخلية محاذاة مع الطائرة التصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تجزئة البيانات الميكروسكوب الإلكتروني. (أ) لقطة من تجزئة اليدوي باستخدام أداة نحت الميتوكوندريا. (ب) رأي 3D كاملة يدوياً مجزأة الميتوكوندريا وميوفيبريلس (في مجموعة متنوعة من الألوان) وساركوليما (باللون الوردي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحويل الصورة الثنائية مكدسات شبكة هرمي ثلاثي الأبعاد الثلاثية- (أ-ج) أقنعة ثنائي ساركوليما وميوفيبريلس والميتوكوندريا، على التوالي. (د) ممزوج عرض أقنعة ثنائي ميوفيبريلس (باللون الأحمر) والميتوكوندريا (باللون الأخضر). (ه) ممثل هرمي ثلاثي شبكة تم إنشاؤها من المكدس الصورة في (د) باستخدام iso2mesh. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: كاردياكسيلميشجينيراتور- لقطة من واجهة المستخدم الرسومية التي ترافق هذا المنشور البروتوكول للمستخدمين بتنفيذ الخطوات 4 و 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: محاكاة توزيع كتلة RyR واقعية على كومة صورة مجزأة الميكروسكوب الإلكتروني للقلب أولتراستروكتوري. (A) بصورة ثنائية المكدس يصور الفجوات بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا، التي تمثل المجموعة من كل بكسل حيث يمكن العثور على مجموعات RyR. (ب) 3D التقديم (عدم الانتباه إلى حجم الصورة) واحدة من RyR محاكاة الكتلة توزيعات (كما هو موضح مجالات حمراء) داخل هندسة 3D صورت في المكدس صورة ثلاثية الأبعاد؛ وتمثل الأسطح الخضراء الميتوكوندريا في المكدس الصورة. (ج) أعلى التكبير (وبالتالي جزء صغير هو خفض خارج المقطع العرضي خلية في الحدود) عرض تراكب من RyR مجموعات من الخطوة 4 ومش الحسابية من الخطوة 3 على شريحة واحدة من المكدس صورة التصوير المقطعي الإلكترون 3D. (ب) و (ج) تم تعديلها من وائل وآخرون. 18 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التوزيع المكاني للكثافة العددية RyR مجموعات من ثلاثة محاكاة أنماط الكتلة RyR. جميع مش العقد لوناً مميزاً من الأبيض للكثافة العددية 0.0 RyR مجموعات/ميكرون3 إلى اللون الأحمر لكثافة عددية أقصى 0.99 RyR ميكرومتر المجموعات/3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: التباين المكاني في [Ca2 +[i أثناء مرحلة ارتفاع من Ca2 + العابرة. (أ) متوسط سيتوسوليك نشرها بحرية [Ca2 +]أنا (يسار) وقطع-4 ملزمة Ca2 +, [F4Ca]أنا (يمين). (ب) و (ج) إظهار لقطات الوقت الفاصل بين بحرية نشر Ca2 + و F4Ca في z-القرص، الطائرة عرضية؛ السهام السوداء علامة مناطق عالية [Ca2 +]أنا بسبب تجميع المتقدرية؛ الأسهم الحمراء علامة المناطق عالية [Ca2 +[i بسبب عدة مجموعات RyR على مقربة. (ج) محاكاة خط المسح الضوئي من [Ca2 +]أنا (الأوسط) [F4Ca]أنا (يمين). موضع الخط يظهر في المقطع العرضي الخلية إلى اليسار. تم توفير البعد الأفقي للمقطع العرضي الخلية كمؤشر للنطاق المكاني في المقاطع العرضية للصورة. وقد تم تعديل هذا الرقم من وائل وآخرون. 18 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: التوزيع المكاني لنواتج الأيض وغشاء الميتوكوندريا المحتملة المتولدة من محاكاة المكانية من الأيض الطاقة القلب. (أ) تركيز الأكسجين في جميع أنحاء الخلية المقطع العرضي في وحدات ميكرومتر، تركيز ADP (ب) فقط في الجزء ميوفيبريل من الخلية الموجودة في وحدات ميكرومتر. (ج) توزيع غشاء الميتوكوندريا المحتملة عبر الميتوكوندريا شبكة وحدات من السيارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: التصور الكتلة RyR محاكاة النقطة نمط على الحزمة R-إحصائيات- تظهر هذه النافذة عند اختتام عمليات المحاكاة RyR الكتل، تصور أولى أنماط المحاكاة نقطة. يمكن استخدام هذا كمؤشر على أن RyR--جهاز محاكاة أبرمت كذلك، ويجوز استجواب نوعية أنماط المحاكاة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المواد الكيميائية | كميات |
| 0.2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 مل |
| الماء المقطر | 20 مل |
| م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزون الاحتياطي | |
| كاكوديلاتي الصوديوم | ز 32.1 [3 ح2س] |
| 0.2 N HCl | 25 مل |
| يشكلون 1 لتر بالماء المقطر | |
| الرقم الهيدروجيني 7.4 | |
| 0.3 المخزون الاحتياطي كاكوديلاتي الصوديوم M | |
| كاكوديلاتي الصوديوم | ز 64.2 [3 ح2س] |
| 0.2 N HCl | 25 مل |
| يشكلون 1 لتر بالماء المقطر | |
| الرقم الهيدروجيني 7.4 | |
| تكوين الحل تيرودي | |
| كلوريد الصوديوم | 139 مم |
| بوكل | 3 مم |
| كاكل2 | 3 مم |
| مجكل2 | 1 مم |
| الجلوكوز | 12 مم |
| ناكو3 | 17 ملم |
| البروبينسيد | 1 مم |
| متخذي قرارات العمل | 20 مم |
| كلوريد الصوديوم/بوكل/ناكو3 ل 1 الحل | |
| كلوريد الصوديوم (g/mol 58.44 الوزن الجزيئي) | ز 81.2 |
| بوكل (الوزن الجزيئي 74.55 غ/مول) | ز 2.24 |
| NaHCO3 (الوزن الجزيئي 84.01 غ/مول) | ز 14.28 |
| تذوب في الماء 1 ل المقطر | |
| مجكل2/CaCl2 1 لتر الحل | |
| CaCl2 (2H2O) (الوزن الجزيئي 147 g/mol) | ز 1.764 |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | ز 0.814 |
| تذوب في الماء 1 ل المقطر | |
| 1 م الجلوكوز 200 مل الحل | |
| سكر العنب (الوزن الجزيئي 180.16 غ/مول) | ز 36.03 |
| تذوب في الماء المقطر مزدوجة 200 مل | |
| تيرودي حل 500 مل الحل | |
| كلوريد الصوديوم/بوكل/ناكو3 | 50 مل |
| الجلوكوز | مل 6 |
| الماء المقطر مزدوجة | 400 مل |
| فقاعة الأكسجين في الحل لمدة 5 دقائق | |
| 2% منهاج عمل بيجين + 2.5 ٪ Glutaraldehyde +0.2% التانيك حمض مثبت في 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم | |
| بارافورمالدهيد مسحوق (PFA) | 0% |
| حمض التانيك | ز 0.2 |
| الماء المقطر | 20 مل |
| 25 ٪ glutaraldehyde | 10 مل |
| 0.3 كاكوديلاتي الصوديوم M | 20 مل |
| 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم | 50 مل |
| 1 N هيدروكسيد الصوديوم | ز 4 هيدروكسيد الصوديوم 100 مل ماء مقطر |
| 4 ٪ خلات اليورانيل الأسهم | |
| خلات اليورانيل | ز 4 |
| قرب الغليان مزدوجة الماء المقطر | مل 96 |
| حل تعميم الوصول إلى الخدمات في المياه بالقرب من بيولينج باستخدام محرض في فوميهود. | |
| تصفية تعميم الوصول إلى الخدمات من خلال عامل تصفية Whatman #1 في زجاجة 200 مل البنى لحماية خفيفة | |
| كاب محكم والتسمية، وتخزين عند 4 درجة مئوية | |
الجدول 1: الكواشف والكميات لإعداد الأنسجة للمجهر الإلكتروني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد البروتوكول أعلاه الخطوات الأساسية لإنشاء نموذج عنصر محدود رواية هندسية من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي. الأسلوب يتيح طرائق الانصهار الحسابية للفحص المجهري مختلفة (أو، من حيث المبدأ، بيانات أخرى) لوضع نموذج حسابية أكثر شمولاً لديناميات كارديوميوسيتي الذي يتضمن تفاصيل عن العمارة خلية المكانية. لا يوجد حاليا لا بروتوكول الأخرى المتاحة لإنشاء نموذج من هذا القبيل من كارديوميوسيتي.
الخطوة 1 يحدد بروتوكول لتثبيت التروية. وبدلاً من ذلك، القلب يمكن أن يكون اقتطعت وتشريح إلى أجزاء أصغر ومنغمسين في مثبت. ومع ذلك، هذه العملية ما ينبغي القيام به بسرعة ويمكن أن تختلف النتائج، تبعاً لحجم العينات. في الخبرة أصحاب، يضمن نضح شامل تسلل مثبت إلى الأنسجة والخلايا. الكتاب قد perfused سابقا أيضا القلب مع كريبس-هينسيليت حل لجعل القلب فاز قبل التثبيت. ومكن هذا القياسات في قلب العمل قبل التثبيت.
خطوات المعالجة الميكروسكوب الإلكتروني في الخطوة 2 نموذجية للتصوير المقطعي الإلكترون. وقد تختلف كميات حل تجهيز، لا سيما من حلول المصبوغة، وتوقيت عند استخدام تقنيات التصوير الأخرى مثل المسلسل-كتلة-وجه المسح الضوئي المجهر الإلكتروني أو تركيز أيون-شعاع مجهرية28. يجب تقسيم صور المجهر الإلكتروني المكتسبة إلى مناطق عضية مختلفة، مثل الميتوكوندريا، وميوفيبريلس، والأنابيب عرضية. ويمكن إجراء ذلك يدوياً أو بطريقة إليه. التباين في المكدس الصورة مرهون بنجاح البروتوكول المصبوغة جزئيا، ولكن يتم فقدان بعض من هذا التباين عند إجراء التصوير المقطعي. ويصف هذا البروتوكول الخطوات اليدوية لتجزئة هياكل مختلفة، على الرغم من أن أساليب جديدة لتنفيذ تجزئة التلقائي29 سيكون أكثر إيجابية بصورة عامة لتحسين سرعة نقل البيانات.
أهم الصفات لدراسة في dataset الميكروسكوب الإلكتروني هي الحفاظ على التباين وهيكل الصورة. قد وصفه المصبوغة والراتنج التضمين الخلائط في هذا البروتوكول المكرر للتباين العالي بين myofibrils، الميتوكوندريا، و z-أقراص الخلية القلبية. على سبيل المثال، المؤلفين سابقا استخدمت كلوريد الكالسيوم بدلاً من حمض التانيك في الخطوة 1.2 برسم حدود الشبكة شبكي sarcoplasmic. وساعد هذا بتحديد الحدود الخارجية لحزم ميوفيبريل خلال تجزئة عضية. كما يمكن استخدام مكونات كيميائية إضافية المصبوغة وأوقات لتصور الهياكل الغشاء، مثل الشبكة شبكية أو الأنابيب عرضية-المحوري30.
ويجب أيضا دراسة الصور للتدهور الهيكلي. يمكن أن تؤدي رداءة نوعية التثبيت أو المجهر الإلكتروني وتجهيز خسارة فادحة في mitochondrial cristae، ونسبة عالية من الميتوكوندريا المزاحة أو متورمة، وتفكك أجزاء من غشاء الخلية (ساركوليما). دراسة متأنية وأوثق قد تظهر أيضا فقدان تي أنبوبي والأغشية ريال، ولكنها أقل وضوحاً للعين غير المدربة. وتشمل الحلول لهذه المشكلة: (ط) ضمان نضح شامل؛ (ثانيا) تشريح الأنسجة إلى عينات صغيرة تضمن أيضا اختراق عميق مثبت والبقع؛ (ثالثا) ضمان أن تجهيز الميكروسكوب الإلكتروني يتم في حلول البرد أو على الجليد أينما المحددة؛ و (رابعا) ضمان التقيد الصارم بأن التوقيت لتلطيخ والجفاف (جفاف خاصة).
كارديوميوسيتي نموذجي هو ~ 20 ميكرومتر في القطر العرضي و ~ 100 ميكرومتر في الطول. وهذا يجعل خلايا القلب كامل التصوير يشكل تحديا كبيرا. وعلاوة على ذلك، تغير اتجاه الألياف العضلية داخل القلب31 كذلك تعقيد الحصول على حجم الصورة المحاور التي تتماشى مع محاور عرضية وطولية من خلية فائدة. تمكين برامج تحليل الصور مثل إيمود الاصطناعية إعادة محاذاة البيانات في اتجاه المطلوب. التقدم الذي أحرز مؤخرا في مواجهة كتلة المسلسل المسح الضوئي المجهر الإلكتروني28 ومعالجة خوارزميات29 أيضا الصور المرتبطة بها المساعدة في حل هذه المسائل. ومع ذلك، دراسة متأنية لأبواب سميكة تحت المجهر الخفيفة وبعد ذلك إعادة توجيه كتلة (الخطوة 2، 5) سوف تزيد من احتمال تصوير الخلايا بمحاذاة معقولة من محاور الطولي والعرضي مع التصوير المحاور. هذا يضمن أنه سيتم القبض على معظم حجم الخلية داخل مجال الرؤية.
الخطوات 3 و 4 و 5 من البروتوكول تتطلب البرامج المسرودة في الجدول للمواد بحيث يتم تثبيتها. وقد إيمود R-إحصائيات الحزمة، iso2mesh وفيجي (نسخة إيماجيج للبيانات مجهرية) عددا كبيرا من الوثائق والبرامج التعليمية على كيفية استخدامها. كاردياكسيلميشجينيراتور هو تطبيق MATLAB الذي تم تطويره لجعله أسهل بالنسبة للمستخدم لبناء النموذج في سير عمل بسيط. يمكن المستخدمين تحميل التعليمات البرمجية المصدر بالكامل، وتطبيق حزمة من ارتباط مستودع محاكاة RyR-github (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). يمكن تثبيت التطبيق، CardiacCellMeshGenerator.miappinstall، في MATLAB كتطبيق. المدخلات للشبكة التي تم إنشاؤها في هذا البروتوكول يمكن العثور على داخل RyR-محاكاة/المدخلات--الملفات/-تومو-الخلية المستهدفة/، بينما مدخلات إضافية يمكن الاطلاع على محاكاة RyR-الكتلة داخل RyR-محاكاة/المدخلات--الملفات/ماجستير-خلية/. قبل البدء في التطبيق، المستخدمين يجب التأكد من أن المجلد iso2mesh المثبتة والمجلدات الفرعية الخاصة به قد أضيفت إلى مسار MATLAB. وبالمثل، التأكد من أنه تم أيضا تثبيت الضرورية R-الحزم (جدول المواد) لمحاكاة الكتلة داخل ر.
شريط تقدم قد أدرج في التطبيق عند إنشاء الشبكة، عند إنشاء مدخلات لمحاكاة الكتلة RyR، وعند تعيين كثافة الكتلة RyR على الشبكة باستخدام مخطط كثافة RyR؛ التطبيق سيجعل شبكة ثلاثية الأبعاد في واجهة المستخدم الرسومية عند الخطوة الجيل مش خلص. عند الانتهاء من المحاكاة الكتلة RyR على واجهة المستخدم بالبحث والتطوير، سوف تظهر نافذة رسومية (الشكل 10)، يصور واحد من RyR 3D محاكاة أنماط نقطة الكتلة.
الزر "إنشاء شبكة" في واجهة المستخدم الرسومية مشغلات الدالة iso2mesh لإنشاء شبكة هرمي ثلاثي. ويمكن تعديل القرار النموذجي بتعيين "معلمات iso2mesh" في واجهة المستخدم الرسومية بضبط طول الصوت وحافة عنصر هرمي ثلاثي الحد الأقصى. ويميز البرنامج حاليا العناصر التي تشكل منطقة ميوفيبريل ومنطقة الميتوكوندريا؛ سيتم توسيع هذه الميزة تشمل المكونات الأخرى للخلية في المستقبل.
يمكن للمستخدمين استخدام عرض ثلاثي الأبعاد للشبكة ومجموعات RyR لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه الخطوات. إعدادات محاكاة الكتلة RyR وأتول ونوميتير، داخل الإعدادات. R يؤثر على دقة المحاكاة الكتلة RyR؛ تحديد هذين المعيارين عندما ينهي محاكاة نمط مجموعة RyR. يمكن تعديل هذه المعلمات عند التفتيش لتوزيع مجموعات RyR في إطار البحث والتطوير (الشكل 10) التأكد من أن: (ط) تقترب من كل المجموعات z-الأقراص؛ و (ثانيا) والمجموعات التي تنتشر عبر المقطع العرضي كامل بدلاً من تجميع في أي منطقة واحدة. يمكن إجراء تحليل حساسية المخصص لعمليات المحاكاة لهذين المعيارين لتحديد مجموعة مناسبة من أتول ونوميتير.
مقدر كثافة نواة كروية في الخطوة 5 يستخدم نطاق القطر الذي تم اختياره كنواة, التي يتم تمريرها عبر حجم الفائدة (نموذج ثلاثي الأبعاد المكانية في هذا السياق). ويمكن تعديل هذه المعلمات لهذا تنعيم الخوارزمية في واجهة المستخدم الرسومية في الشكل 5: r_sphere (1) يحدد نصف قطر نواة كروية التنعيم؛ (2) هفال يحدد حجم الخطوة المكانية تكرارية أكثر مما نواة كروية يجب تكراري تمرير عبر وحدة التخزين.
نهج بسيط تحديد ما إذا كانت المعلمات الكثافة المكانية الكافية لفحص توزيع قيم كثافة الكتلة RyR كما هو موضح في الشكل 7. وينبغي توزيع قيم الكثافة يكون الحي لقيم الكثافة العالية بحجم مماثل لحجم كتلة RyR في بيانات الفحص المجهري.
وتنتج البروتوكول الحالي نموذج عنصر محدود فقط يحتوي على توزيع واقعية myofibrils، الميتوكوندريا، ومجموعات RyR. سيكون امتداداً لهذه الخطوة لمحاكاة توزيع أيون-القنوات الأخرى التي تلعب دوراً في رعاية الطفولة المبكرة، مثل مضخات شركة ساركو اندوبلاسميك الكالسيوم شبكي (SERCA2a)، ومبادلات الصوديوم-الكالسيوم (نك) ومضخات الكالسيوم ساركوليمال. المفتاح لهذه الملحقات يتم تحليل التوزيع المكاني لقنوات أيون من البيانات الفلورة. على سبيل المثال، تم قياس القنوات نككس إلى توزع شكل موحد عبر الأغشية أنبوبي تي في تباعد متوسط من 0.67 ميكرومتر، ولكن علاقتهما بمجموعات RyR ليست واضحة حتى32. من ناحية أخرى، SERCA2a استهداف الأجسام المضادة قد استخدمت سابقا لوضع علامة ريال33، ولكن لم تبلغ عن كثافة SERCA2a المكانية في الأدب. ولذلك، في هذه المرحلة، يمكن افتراض توزيع موحدة 2A سيركا عبر الشبكة ريال ونك على t-الأنابيب بحذر.
كما يتبين من نتائج الممثل، شبكة العناصر المحدودة الناتجة يمكن استخدامها مع عنصر محدود يحلون34 لمحاكاة العمليات الكيميائية الحيوية مثل الكالسيوم مما يشير إلى18 والاستقلاب27 كرد فعل-نشر العمليات. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم تمثيل أيون-قنوات كمواقع رد الفعل في العقد داخل طبولوجيا شبكة. مواقع رد الفعل تعمل كمصادر أو مصارف مختلفة الأنواع الكيميائية لتمثيل تدفق الأنواع الكيميائية من خلال هذه القنوات الأيونية في أماكن مختلفة من الخلية. RyR كثافة الملفات من هذا البروتوكول ومش الإخراج، يمكن استخدام مع أي من integrator أخرى، أو في أي بيئة أخرى، شريطة أن البرنامج يحتوي على ميزة الاعتراف بهذه الملفات النصية. الملفات النصية يمكن التلاعب بها أيضا بالبرامج النصية أو طرف ثالث البرمجيات لتلبية متطلبات تنسيق ملف إدخال البيئة في الاختيار. التطبيق الأولى على ديناميات الكالسيوم فقط يوضح مدى فائدة هذا النموذج بالنسبة أوبستروكي الكالسيوم ولكن هذا لا يعني أنه لا يمكن استخدام الشبكة لفترات زمنية أطول. يمكن استخدامها كثافة شبكة والكتلة لمحاكاة متعددة دورات الكالسيوم، مع الحفاظ على التوازن والاستقرار تعتمد فقط على solver العناصر المحدودة التي يتم استخدامها.
طويل الأجل يهدف إلى تحسين هذه الأنابيب من طراز بناء لتجعل من السهل لخلق نماذج دقيقة هيكلياً العناصر المحدودة كارديوميوسيتيس وأنواع الخلايا الأخرى. تم تطوير خوارزمية تجزئة الآلي في الآونة الأخيرة، التي يمكن تطبيقها على البيانات الميكروسكوب الإلكتروني المسح التسلسلي-كتلة-الوجه من كارديوميوسيتيس لإنشاء نموذج لتوزيع ميوفيبريلس والميتوكوندريا في الخلية بأكملها مع المستخدم الحد الأدنى 29من الإدخال. سيتم توسيع هذا الأسلوب الجزء أنبوب t وريال غشاء الشبكات في المستقبل. نسخة معممة أكثر من خوارزمية محاكاة RyR-التي سوف تمكن المستخدمين من تحليل ومحاكاة مواقع مشتركة بين العضيات وأيون-القناة، وكذلك بين أنواع مختلفة أيون-القناة، بطريقة إنتاجية عالية أيضا قيد التطوير. بروتوكول سلس لبناء نموذج كامل للخلية سوف تمكن العلماء من إجراء اختبارات الفرضيات المستندة إلى النموذج على العلاقة بين هيكل الخلية ووظيفة الخلية بصورة روتينية مما هو ممكن حاليا مع النهج التجريبي وحدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
كان يدعمها هذا العمل الملكية المجتمع من نيوزيلندا مارسدن سريعة بدء المنحة 11-أوا-184 ومنح "العلم الحدود البشرية برنامج البحوث" RGP0027-2013 والاسترالية البحث اكتشاف المشروع مجلس DP170101358 منحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
