Summary
Denne protokol beskriver en ny metode for at skabe et rumligt detaljerede finite element model af den intracellulære arkitektur af cardiomyocytes fra elektronmikroskopi og konfokal mikroskopi billeder. Kraften i denne rumligt detaljerede model er påvist ved hjælp af casestudier i calcium signalering og bioenergetik.
Abstract
Med fremkomsten af tre-dimensionelle (3D) tænkelig teknologier såsom elektron tomografi, seriel-blok-ansigt scanning Elektron Mikroskopi og konfokal mikroskopi, det videnskabelige samfund har hidtil uset adgang til store datasæt på sub mikrometer opløsningen, der karakteriserer den arkitektoniske remodellering, der ledsager ændringer i cardiomyocyte funktion i sundhed og sygdom. Disse datasæt har dog været underudnyttede for at undersøge rollen i cellulære arkitektur remodeling i cardiomyocyte funktion. Formålet med denne protokol er at skitsere hvordan du opretter en nøjagtig finite element model af en cardiomyocyte ved hjælp af høj opløsning elektronmikroskopi og konfokal mikroskopi billeder. En detaljeret og præcis model af cellulære arkitektur har betydelige muligheder for at give ny indsigt i cardiomyocyte biologi, mere end eksperimenter alene kan samle. Kraften i denne metode ligger i dens evne til at beregningsmæssigt lunte oplysninger fra to forskellige billeddiagnostiske modaliteter af cardiomyocyte ultrastruktur at udvikle en samlet og detaljeret model af cardiomyocyte. Denne protokol beskriver trin for at integrere elektron tomografi og konfokal mikroskopi billeder af voksne mandlige Wistar (navnet efter en bestemt hunderace albino rotte) rotte cardiomyocytes at udvikle en halv-sarkomeret finite element model af cardiomyocyte. Proceduren, der genererer en 3D finite element model, der indeholder en nøjagtig, høj opløsning skildring (størrelsesordenen ~ 35 nm) af fordelingen af mitokondrier, myofibrils og ryanodine receptor klynger, at frigive de nødvendige calcium til cardiomyocyte sammentrækning af sarcoplasmic retikulære netværket (SR) ind i myofibril og cytosole rum. Modellens genereret her som en illustration ikke omfatter oplysninger af den tværgående-tubulus arkitektur eller sarcoplasmic retikulære netværket og er derfor en minimal model af cardiomyocyte. Modellen kan imidlertid allerede anvendes i simulation-baserede undersøgelser til rollen af cellestruktur i calcium signalering og mitokondriel bioenergetik, som er illustreret og drøftet ved hjælp af to casestudier, som præsenteres efter den detaljeret protokol.
Introduction
Excitation-sammentrækning kobling (ECC) i hjertet henviser til den vigtige og indviklede kobling mellem elektrisk excitation af cardiomyocyte membran og efterfølgende mekanisk sammentrækning af cellen under hvert pulsslag. Matematiske modeller har spillet en nøglerolle i at udvikle en kvantitativ forståelse af de indbyrdes forbundne biokemiske processer, der regulerer aktionspotentialet1, cytosole calcium signalering2, bioenergetik3, og efterfølgende kontraktile styrkegenerering. Sådanne modeller har også med succes forudsagt ændringer til hjerteslag når én eller flere af disse biokemiske processer undergå ændringer4,5. Den yderst organiseret ultrastruktur af cardiomyocyte er i stigende grad blevet anerkendt til at spille en afgørende rolle i den normale kontraktile funktion af cellen og hele hjertet. Faktisk sker ændringer til morfologi og organisation af komponenter af cardiac ultrastruktur parallelt til biokemiske ændringer i sygdomstilstande såsom hypertrofi6, hjertesvigt7og diabetisk kardiomyopati8. Om disse strukturelle ændringer er mindre, adaptive eller patologiske svar til de ændrede biokemiske forhold er stadig stort set ukendt9. Den i sagens natur tætte kobling mellem form og funktion i biologi betyder, at eksperimentelle undersøgelser alene ikke giver dybere indsigt end korrelationer mellem strukturelle remodellering og cardiomyocyte funktion. En ny generation af matematiske modeller, der kan optage den strukturelle forsamling af subcellulære komponenter, sammen med de velundersøgte biokemiske processer, er nødvendigt at udvikle en omfattende og kvantitativ forståelse af forholdet mellem struktur, biokemi og kontraktile styrke i cardiomyocytes. Denne protokol beskriver metoder, der kan bruges til at generere strukturelt nøjagtig finite element modeller af cardiomyocytes, der kan bruges til sådanne undersøgelser.
Det sidste tiår er sket betydelige fremskridt i 3D elektronmikroskopi10, Konfokal11og super-resolution mikroskopi12 der giver hidtil uset, høj opløsning indsigt i nano-skala og mikro-skala samling af den subcellulære komponenter af cardiomyocyte. For nylig, disse datasæt har været brugt til at generere beregningsmæssige modeller af cardiomyocyte ultrastruktur13,14,15,16. Disse modeller bruger en veletableret engineering simulation metode, kaldet finite element metoden17, oprette finite element beregningsmæssige masker over, hvilke biokemiske processer og cardiomyocyte kontraktioner kan simuleres. Disse modeller er dog begrænset af opløsning og detaljer, som en mikroskopi metode kan give i et billede datasæt. For eksempel, elektronmikroskopi kan generere nanometer-niveau detalje af cellestruktur, men det er svært at identificere specifikke proteiner inden for det billede, der vil være nødvendigt at oprette en model. På den anden side super-resolution Optisk mikroskopi kan give høj kontrast billeder med opløsninger på rækkefølgen af 50 nm af kun en vælge par molekylære komponenter i cellen. Kun ved at integrere supplerende oplysninger fra disse billeddiagnostiske modaliteter kan man realistisk udforske følsomheden af funktion til ændringer i struktur. Korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi er stadig ikke en rutine fremgangsmåde, og det vil stadig lide den begrænsning, at kun et begrænset antal komponenter kan farves i visningen immunofluorescens og korreleret med visningen Elektron Mikroskopi.
Denne protokol udgør en roman tilgang18 , der anvender statistiske metoder19 til at analysere og beregningsmæssigt fuse lysmikroskopi oplysninger om den geografiske fordeling af ion-kanaler med elektronmikroskopi oplysninger om andre hjertesygdomme ultrastruktur komponenter, såsom myofibrils og mitokondrier. Dette producerer en finite element model, der kan bruges med biofysiske modeller af biokemiske processer til at studere rollen, som cardiomyocyte subcellulære organisation på de biokemiske processer, der regulerer cardiomyocyte sammentrækning. For eksempel, denne protokol kan bruges til at oprette modeller fra sund og streptozotocin-induceret diabetisk hjerte myocytes at studere effekten af strukturelle remodeling på hjerte cellefunktion, der er observeret i diabetisk dyre modeller8. En yderligere fordel ved den statistiske karakter af metoden præsenteres fremgår også i protokollen: metoden, der kan generere flere forekomster af finite element geometrier, der nøje efterligne de eksperimentelt observerede variationer i cellestruktur.
Som overblik, protokol skridt omfatter: (i) forberedelse af hjertets væv til elektronmikroskopi at generere 3D billeder med tilstrækkelig opløsning og kontrast; (ii) genopbygning og segmentering af 3D billedstakke fra elektronmikroskopi data ved hjælp af en 3D elektronmikroskopi genopbygning og billedanalyse software kaldet IMOD20; (iii) ved hjælp af iso2mesh21 til at generere en finite element mesh ved hjælp af segmenterede data som input; (iv) ved hjælp af roman algoritme og koder til at knytte fordelingen af Ionkanaler på finite element mesh.
Udgangspunktet for tilgangen til hvert trin er skitseret i protokollen, og repræsentative resultater findes i de ledsagende figurer. Overblik er skitseret, angive, hvordan de genererede rumligt detaljerede modeller kan bruges til at studere den rumlige ændringer af calcium under ECC, samt mitokondrie bioenergetik. Nogle af de nuværende begrænsninger i protokollen er diskuteret, samt nye udviklinger, der er på vej til at overvinde dem og yderligere fremme en kvantitativ forståelse af rollen af cellestruktur til hjerte systembiologi. Hvordan disse metoder kan generaliseres til at oprette finite element modeller af andre celletyper er også rettet.
Brugere af denne protokol kan springe trin 1 og genopbygning del af trin 2, hvis de har adgang til en eksisterende Elektron Mikroskopi billedstak. Brugere, der har til hensigt at erhverve deres data i samarbejde med mere erfarne elektron microscopists måtte ønske at diskutere og sammenligne fiksering og farvning procedurer i trin 1 med ekspert til at bestemme en optimal protokol for erhvervelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af University of Auckland dyr etiske komité og University of California San Diego institutionelle dyrs pleje og brug udvalget, hvor væv protokol blev oprindelig udviklet.
1. eksperimentel forberedelse
- Forberede stamopløsninger af 0,15 M og 0,3 M natrium cacodylate buffere på pH 7,4 ifølge tabel 1.
-
Forberede glutaraldehyd fiksativ (2% PARAFORMALDEHYD (PFA) + 2,5% Glutaraldehyd + 0,2% garvesyre i 0,15 M natrium cacodylate buffer pH-værdi på 7,4) ved hjælp af komponenterne vises i tabel 1.
- Opløs 2 g af PFA pulver i 20 mL destilleret vand ved 60 ° C på en kogeplade under konstant omrøring.
- Tilføj 1 M NaOH-opløsning, indtil løsningen er klar.
- Vent, indtil temperaturen af løsningen er under 40 ° C, hvorefter der tilsættes 10 mL af glutaraldehyd og 20 mL 0,3 M natrium cacodylate.
- Der tilsættes 0,2 g af garvesyre og opløse den i løsningen.
- Der tilsættes 50 mL af 0,15 M natrium cacodylate.
- Gemme tre eller fire 20 mL scintillationshætteglas af fiksativ i køleskab ved 4 ° C eller på is, hvis de anvendes på samme dag.
- Forberede Tyrodes løsning med 20 mM 2,3-butanedione monoxime (BDM), ifølge opskriften i tabel 1.
-
Konstruere en Langendorff apparater inde i et stinkskab.
- Klemme to 100 mL plastik sprøjte rør til to forskellige svar på tiltale står, ca 70 cm høj fra stå base.
- Tilslut plast sprøjte rør og en tilslutning tube bruger 3 mm indre diameter slanger og en tre-vejs stophane som vist i figur 1.
- Passe en 3 mm ydre diameter kanyle til bunden af stikket slanger, hvor hjertet vil være bundet til perfusion fiksation.
-
Fyld sprøjten rør med Tyrodes løsning og Fikseringsvæske løsninger ved 37 ° C.
- Fjerne luftbobler i slangen ved at passere sprøjte løsninger gennem dem.
2. anskaffe elektronmikroskopi Data af Cardiomyocyte ultrastruktur
- Forberede dyret til excision og kemisk fiksering af hjertet.
Bemærk: Denne protokol detaljer de skridt til at behandle voksne mandlige Wistar (navnet efter en bestemt hunderace albino rotte) rotte hjerte væv. Protokollen kan kræve ændringer, når det hjerte væv er indkøbt fra andre arter.- Bedøver dyret ved at behandle rotte (200-250 g af kropsvægt) med 0,5 mL 250 U/mL heparin via intraperitoneal injektion. Vente i 10 min og derefter behandle rotte med intraperitoneal injektion med pentobarbital (210 mg/kg legemsvægt).
- Bekræfte en passende grad af anæstesi ved at teste tå knivspids refleks.
- Aflive dyret af cervikal dislokation.
- Høst hjertet ved hjælp af dissektion procedurer svarende til tidligere publicerede artikler, JoVE22,23, derefter placere den i iskoldt saltvand.
- Isolere opstigende aorta og kanyleres. Sikre, at spidsen af kanylen sidder lige over den semi-lunar ventil, hvor kranspulsårerne gren. Binde en tråd stramt omkring opstigende aorta.
- Tilslut kanylen til gravity-drevet Langendorff apparatet drives på ~ 70 cm over bunden af systemet (figur 1).
- Twist hanen på Langendorff system til perfuse hjertet med Tyrodes løsning, herunder 20 mM BDM (en myosin hæmmer) for 2-3 min.
- Twist stophane for at starte perfusion med fiksativ 2% PARAFORMALDEHYD, 2,5% glutaraldehyd og 0,2% garvesyre i 0,15 M natrium cacodylate ved 37 ° C i 10 min. Hvis det lykkes, vil hjertet slå lysebrun og blive stiv og gummiagtig.
- Bruge et barberblad, dissekere vævet blokke fra den venstre ventrikel (lateral) gratis væg og få væv blokerer ca 1 mm3 i størrelse.
- Butik prøver i pre afkølede 20 mL scintillationshætteglas af den samme fiksativ på isen for 2 h. gemme så mange prøver som muligt i hætteglassene, og sikre, at prøverne er neddykket i opløsningen.
OBS: Det er vigtigt at holde prøver koldt indtil efter 100% dehydrering trin nedenfor.
- Yderligere fiksering og farvning af prøver for Elektron Mikroskopi.
- Hæld 100 mL 0,15 M natrium cacodylate buffer i et glas bægerglas og cool det på is.
- Forberede lige store mængder af 4% osmium dinitrogentetraoxid og 0,3 M natrium cacodylate, efterfulgt af tilsætning af 0,08 g af kaliumferrocyanid at gøre en heavy metal pletten løsning indeholdende 2% kaliumferrocyanid i 2% osmium dinitrogentetraoxid og 0,15 M natrium cacodylate. Cool løsning på is.
- Pipetteres fiksativ ud og erstatte det med nok koldt 0,15 M natrium cacodylate buffer at dykke prøver i hætteglassene. Placer hætteglassene i isbad i 5 min.
- Gentag trin 2.2.3 fire flere gange med 0,15 M natrium cacodylate til at fjerne overskydende fiksativ.
Forsigtig: Brug ikke glas pipetter, fordi lille skår kan komme ind i prøven og kan ødelægge diamond knive ved væv blok skæring. Det er vigtigt at pre cool alle løsninger på is før du føjer dem til prøven. Det er også vigtigt, at prøven forbliver omfattet af løsning hele tiden (meget korte perioder af delvis dækning varer ikke mere end et par sekunder kan kortvarigt blive tolereret under løsning udveksling). Når vask eller erstatte løsninger, tilføjer den nye løsning hurtigt efter at fjerne den forrige løsning. Holde scintillationshætteglas på isen mellem vasker. Bemærk at dette trin ikke er tid følsomme, væv blokke kan blive vasket lidt længere, hvis det er nødvendigt. - Erstatte natrium cacodylate buffer med iskold heavy metal pletten løsning og gemme det på køl natten over. Sikre at kaliumferrocyanid er godt blandet ved at ryste hætteglasset i hånden; Løsningen skal vende sort.
Forsigtig: Arbejde i stinkskab når du udfører dette trin, fordi osmium er giftigt. - Fortyndes 4% vandig uranyl acetat (UA) stamopløsning (tabel 1) til 2% ved hjælp af lige store mængder af materiel UA løsning og dobbelt destilleret vand, og køle det ned på isen.
- Erstatte heavy metal pletten med ice-køles 0,15 M natrium cacodylate buffer, og lad prøven inkuberes i 5 min på is.
- Gentag trin 2.2.7 fire gange på isen for at skylle overskydende heavy metal pletten løsning.
- Skyl prøverne fire gange, med en 2-minutters vente-periode i mellem i renset vand (dobbeltdestilleret er tilstrækkelig).
- Erstatte renset vand med iskold 2% UA og lad prøven Inkuber i 60-120 min. på is.
- Køle ned fem 20 mL scintillationshætteglas ethanol (nok til at oversvømme prøver) på is, der vil blive brugt i trinnet dehydrering. Seks hætteglas har stigende procenter af ethanol i destilleret vand: 20%, 50%, 70%, 90% og 100%.
- Hæld ren acetone i en anden 20 mL scintillation hætteglas og cool på isen sammen med ethanol hætteglas.
- Skyl prøver i renset vand fire gange med 2 min ventetider på is at vaske overskydende UA.
- Dehydrere prøver i ethanol.
- Dehydrere i kolde ethanol serie af successivt erstatter løsning inden for prøven hætteglasset som følger på is: 20% ethanol i 10 min; 50% ethanol i 10 min; 70% ethanol i 10 min; 90% ethanol i 10 min; derefter to gange i 100% ethanol i 10 min.
- Overgang prøven til stuetemperatur ved at erstatte den endelige 100% ethanol med afkølet ren acetone og sted prøve hætteglasset på en stuetemperatur lab bænk i 10 min.
- Udføre en mere 10 min vask i ren acetone ved stuetemperatur til at fjerne kondens, der kan iagttages i hætteglassene. Mens inkubere, udgør acetone/harpiks løsninger.
- Erstatte den ren acetone i hætteglassene med 50/50 ren acetone og epoxy harpiks (med proportioner for epoxy harpiks komponenter som angivet af fabrikanten). Brug alle komponenter fra samme parti. Lad harpiks-fyldt prøve hætteglas natten på en rotor.
- Integrere prøver i harpiks.
- Erstatte 50/50 harpiks med 75% resin (25% acetone) og Inkuber i 3 timer, efterfulgt af yderligere inkubation/infiltration i 100% resin i 4 timer ved stuetemperatur.
- Erstat 100% resin med friske 100% resin, og forlader prøven hætteglas natten for dybere penetration af harpiks i vævsprøver.
- Udtage prøver af hætteglassene og placere dem i containere, der er ovn-venlige og har en flad base; aluminium eller sølvfolie bagning kopper kan bruges til dette formål, f.eks.
- Forsigtigt hældes (for at undgå fortrængning af prøverne) frisk harpiks over prøverne (dermed indlejring prøver i harpiks) og polymerisere harpiks og prøver i en ovn ved 60 ° C for 48 h.
- Nyorientere harpiks blokke til billede celler i tværsnit.
- Få 1 µm tykt test sektioner fra harpiks blokke ved hjælp af en ultramicrotome med et glas kniv til at vurdere celle orientering24.
- Pletten afsnittene tyk test for 20 s med 1% toluen blå og 1% borax.
- Undersøge muskel celle orientering under lysfelt mikroskop.
- Baseret på orientering udledes fra billeder af sektionerne farves test, nyorientere på langs eller skråt orienteret (svarende til figur 2A) harpiks blokke for at sikre at cellerne er udsat for glas kniv, således at de vil blive skåret i tværsnit ( svarende til figur 2B).
- Billede væv sektioner ved hjælp af elektron tomografi.
- Få semi-tynde sektioner (~ 300 nm) af omlagt væv blokke ved hjælp af en diamant kniv og overføre sektioner på kobber gitre25.
- Plette de tykke sektioner med 2% UA og Sato bly25.
- Anvende kolloid guld partikler på begge sider af afsnit25.
- Få sæt af enkelt eller dobbelt-akse tilt serie af projekterede billeder fra-70 ° til + 70 °25.
- Bruge IMOD20 at rekonstruere 3D billede stack (en række 2D-billeder, der giver 3D-oplysninger i en enkelt elektron tomografi afdeling) af cellen. Denne rekonstruerede stak vil segmenteres i næste trin.
3. segment Myofibrils og mitokondrier regioner fra EM 3D billede datasæt
- Kør programmet IMOD "3dmod".
- Inden for den grafiske brugergrænseflade 3dmod indtaste adressen på ".rec" eller ".mrc" fil, der indeholder 3D rekonstrueret image datasæt i cellen (genereret i trin 2.7) i boksen mærket "Image fil (er):", tryk derefter på "OK".
- Under menuen "Filer", vælge ny Model, så Gem filen med et passende navn ved hjælp af "Gem Model som"... menupunktet under "Fil".
Bemærk: Et objekt i IMOD kan indeholde en samling af segmenterede komponenter, der udgør "object". En ny model indeholder som standard et nyt objekt med id'et "#1". - Vælg "Tegnefunktioner" under menuen "Special". Dette vil åbne en ny værktøj bar samme som vist i figur 3A.
Bemærk: Der er flere værktøjer, der kan bruges til at oprette konturer rundt om de forskellige organelle grænser. Mere hjælp på måder at bruge disse værktøjer findes i dokumentationen til IMOD20 . - Vælg indstillingen "Sculpt" i menuen "Tegnefunktioner", og Flyt musen over til vinduet image; en cirkulær contour centreret om musemarkøren vil vises.
- Ved at holde den midterste museknap over en mitochondriet (de mørkere områder af billedfiler, som illustreret af proveniensregioner med grønne højdekurver i figur 3A), skal du trække omkredsen af cirkel konturen i form af sin grænse.
- Når tilretning af mitochondriet grænsen er færdig, frigive den midterste knap og Gentag trin 3.6 for hver mitochondriet i data. Hver contour genkendes automatisk af IMOD som en ny profil inden for det samme objekt.
- Under den "Rediger | Objektet "menuen, Vælg"Ny"for at oprette et nyt objekt. Dette vil automatisk stiger det samlede antal objekter med én og tildele dette tal til det nye objekt.
- Gentag trin 3.6 og 3.7 at segmentere og gemme myofibril konturer.
- Gentag trin 3.8, efterfulgt af trin 3.6, at segmentere celle grænsen så godt.
- Gem modellen under menuen "Filer".
- Udfør disse kommandoer i kommandolinjevinduet konvertere hver objekt gruppering i en binær maske, som illustreret i figur 4A-C.
- Udtrække et specifikt objekt fra den model "imodextract objekt modelfile outputmodelfile" hvor "objekt" er antallet af objektet, der skal udvindes.
- Oprette en maske for det pågældende objekt: imodmop-maske 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Konverter filen til en tif stack: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. Opret en Finite Element Mesh fra segmenterede komponenter
- Iso2mesh er en frit tilgængelig MATLAB program til at konvertere TIFF billedstakke til volumetriske tetrahedrale finite element masker. Download og Tilføj iso2mesh til MATLAB sti fra iso2mesh.sourceforge.net.
- Dataoverføre den kilde kode og data at simulere RyR klynger på trådnet fra github hjemmeside https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
- Start programmet CardiacCellMeshGenerator MATLAB (figur 5).
- Indlæse forskellige organelle komponent masker i MATLAB ved hjælp af de tre knapper i øverste venstre side af GUI.
- Oprette en anden binær billedstak, der afgrænser huller mellem myofibrils og mitokondrier som vist i figur 6A.
- Åbn ImageJ.
- Ved hjælp af filen | Åbn dialogboksen, indlæse myofibrils og mitokondrier tiff stakkene i programmet.
- Indlede billede tilføjelse plugin ved at vælge "processen | Regnemaskine Plus ".
- Vælg myofibril billedstak som i1, mitokondrier billede stak som i2, og vælg "Tilføj" operatør. Klik på "OK".
- Efter en ny billedstak repræsenterer resultatet af 4.5.4 vises, skal du vælge "Rediger | Invertere"for at producere en billedstak svarende til figur 6A.
- Indlæse filer der indeholder de binære billedstak huller mellem myofibrils og mitokondrier ved at trykke på knappen "RyRGapsFile" på CardiacCellMeshGenerator programmet.
- Tryk "Generere Mesh" på GUI. Dette vil udløse iso2mesh kommando v2m med parameteren 'cgalmesh' til at generere en tetrahedrale mesh svarende til figur 4E. Tre filer vil være output i slutningen af dette trin: en .ele fil, en .face fil, og en .node-fil, der indeholder notering af noder, der udgør elementerne, de noder, der udgør ansigterne og koordinaterne for noder , henholdsvis.
5. matematisk kort den rumligt varierende tæthed af Ion-kanaler af interesse på Finite Element Mesh.
-
Generere de nødvendige indgange til RyR-Simulator ved at trykke på knappen mærket generere RyR-Simulator indgange på GUI.
Bemærk: Knappen vil udløse en funktion generateRyRsimulatorInputs.m, som bruger følgende oplysninger fra trin 4 til at generere indgangene:
(1) outDir: placering til output-filer, der er nødvendige for RyR klynge simulering.
(2) imres: pixel opløsning i de tre retninger af billedstakke.
(3) myofibril_file: den fil, der indeholder de binære billedstak som vist i figur 4B.
(4) sarcolemma_file: den fil, der indeholder de binære billedstak som vist i figur 4A.
(5) ryrgaps_file: den fil, der indeholder de binære billedstak som vist i figur 5A.- Når denne funktion udfører, skal du kontrollere, at følgende filer er blevet oprettet i den mappe, der er angivet en sti i outDir:
- d_axial_micron.txt, som repræsenterer aksial afstanden mellem placeringen af z-disc og resten af pixels i billedet stakken.
- d_radial_micron.txt, som repræsenterer den euklidiske afstand (undtagen den aksiale komponent) fra hver pixel i sæt af mulige RyR klynge placeringer til pixel i z-disc flyet.
- W_micron.txt, der udgør listen over rumlige koordinater for alle ledige stillinger for RyR klynger for at være til stede.
- De resterende 3 filer i mappen indeholder suffikset "_pixel" frem for "_micron" til at betegne, at værdier inden for disse filer er blevet skrevet i pixel koordinere form.
-
Simulere RyR klynge distributioner i binært billede stakken af myofibrils.
- Tryk på knappen mærket "Åben RyR-simulator i R" at indlede programmet Rasmussen.
- R-gui, Vælg "fil | Open"og finde filen"indstillinger. R"inden for pakken RyR-Simulator (RyR-Simulator/kilde/indstillinger. R).
- Også åbne filen ryr-simulator-parallel. Rasmussen (beliggende i RyR-Simulator/kilde/ryr-simulator-parallel. Rasmussen). miljøer som Rstudio (https://www.rstudio.com) eller en almindelig kommando linie interface kan bruges, fx ved hjælp af kommandoen R64 i en shell eller kommando vindue.
- Ændre parametrene i indstillinger. R filen som beskrevet nedenfor:
- Indstil sti2 til Mappeadressen, der indeholder filer, der er anført i 5.1.2 for en eksperimentelt erhvervede Konfokal billedstak af RyR klynger og myofibrils.
Bemærk: Github repository mappe input-filer/master-cellen / allerede indeholder filer, der blev genereret af en tidligere indsamlede billedstak. - Angive Path4 til en mappeadresse hvor de filer, der blev genereret i trin 5.1.2 er gemt.
- Sæt sti3 punkt til en mappe, hvor brugeren ønsker de simulerede RyR klynge placeringer gemmes.
- Sæt N antallet af RyR klynger til simuleres i model (typisk i størrelsesordenen 200 til 300).
- Indstille etol, en tolerance fastsættelse for forskellen mellem den eksperimentelt målte rumlige fordeling af RyR klynger og model simuleret rumlige fordeling af RyR klynger.
- Sæt numIter til at begrænse antallet af forsøg på, at RyR-Simulator skal tage for at finde en simuleret RyR klynge mønster, der opfylder etol værdi.
Bemærk: Værdier for etol og numIter har været indstillet til typiske værdier i indstillinger. R fil. - Indstil numPatterns til antallet forskellige RyR klynge mønstre, som brugeren ønsker at simulere (typisk, det er nyttig praksis simulerer 99 mønstre for statistiske tillid).
- Sæt numCores til at aktivere brugen af flere CPU tråde (kerner) til hurtigere parallel behandling med R for at simulere punkt mønstre.
- Indstil sti2 til Mappeadressen, der indeholder filer, der er anført i 5.1.2 for en eksperimentelt erhvervede Konfokal billedstak af RyR klynger og myofibrils.
- Kontroller, at følgende pakker er installeret ved hjælp af pakkeinstallationsprogrammet gui i R: sne, doSNOW, doparallel, foreach, Iteratorer og rgl.
- Effektuere simulatoren ved at indtaste følgende kommando i vinduet Rasmussen-kommando: kilde (' sti til ryr-simulator-parallel. R', chdir = TRUE)
Bemærk: Output af RyR-Simulator program er en liste over .txt filer (en numPatterns fil vil blive genereret), der indeholder koordinere lister i N rækker og 3 kolonner, der repræsenterer x, y og z koordinater n simuleret RyR klynger.
-
Kort punkter som rumlige tætheder på beregningsmæssige model ved hjælp af CardiacCellMeshGenerator.
- Ved at vælge knappen mærket "Vælg RyR point fil", skal du vælge en simuleret RyR klynge distribution tekstfil fra dem, der var output af RyR-Simulator.
- Udføre "RyR tæthed Mapper" på GUI i MATLAB. Dette vil kortlægge de rumlige steder de simulerede RyR klynger i .txt-filen i trin 5.3.1 på finite element mesh, der blev oprettet i trin 4.8 ved hjælp af en metode, der kaldes en sfærisk kerne intensitet estimator metode26.
Bemærk: Output fra dette trin er en fil hos .txt forlængelse, der indeholder en liste over værdier for den numeriske tæthed af ion-kanal pr. sfæriske rumfang på hver af de beregningsmæssige mesh noder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 gennem figur 7 give repræsentative resultater af flere vigtige skridt i denne protokol: (i) visualisere og omlægge væv blokke for tværsnits elektronmikroskopi synspunkter; (ii) genererer en 3D elektronmikroskopi billedstak; (iii) segmentering subcellulære ultrastruktur for organeller af interesse; (iv) generation af en finite element mesh ved hjælp af iso2mesh; (v) simulerer en realistisk fordeling af RyR klynger på trådnet; (vi) efterfulgt af kortlægning denne rumlige fordeling som en rumlige tæthed over den beregningsmæssige mesh.
Figur 2 viser typiske lysfelt billeder, der viser, hvordan cellerne vises når orienteret på langs (figur 2A, mærket L), skråt (figur 2A, mærket O) og cross-sectionally (figur 2B) med hensyn til den beskæringsplanet. Skrå og på langs orienteret prøver udstille riller, mens cross-sectionally orienteret prøver ikke udviser riller. Kapillærerne vises også mere cirkulære i tværsnits synspunkter end i skrå visninger.
Figur 3A viser et repræsentativt billede af en god kvalitet tomogram stak, som kan erhverves når væv forberedelse protokol i trin 1 er fulgt. Skal udvises forsigtighed, når du udfører 3D rekonstruktion fra mikroskop billede tilt serien. Forkert sporing af kolloid guld partikler, eller mangel på tilstrækkelig guld partikler kan påvirke kvaliteten — billede kontrast og billed fokus — af tomogram betydeligt. Dette påvirker evnen til at segmentere forskellige strukturer betydeligt. Pleje og erfaring er nødvendig for at sikre, at væv blokke farves tilstrækkeligt og at der er en jævn fordeling af kolloid guld partikler gennem væv volumen. Hvis du er i tvivl, kan det være nyttigt at konsultere en specialist laboratorium eller facilitet på den lokale institution. Hvis model generation er forsøgt med lav kontrast eller forkert rekonstrueret data, modeller kan stadig blive genereret men korrespondance i modellering resultater med egenskaberne for de biologiske systemer til simuleres kan være dårlig. Figur 3B viser et repræsentativt billede af hvad en segmenteret model af myofibrils og mitokondrierne ligner.
Figur 4E viser en 3D-gengivelse af de tetrahedrale mesh, der er produceret af iso2mesh. Så længe de oprindelige billede stak og segmentering opgaver er af god kvalitet, er dette trin ret robust. Figur 6B og 6 c figur viser en typisk RyR klynge distribution (i rødt) inden for den 3D cellulære topologi. På nuværende tidspunkt er trådnet, selv ikke input i RyR simulator. En billedstak celle grænse og huller mellem myofibrils og mitokondrier — genereret fra segmenterede billeder i figur 4 — form de større indgange til RyR simulator. Skal sørges for at segmentere grænser af myofibrils og mitokondrier så nøjagtigt som muligt; unøjagtige segmenter ville medføre et unøjagtigt repræsentation af celle topologi i de data, som derfor vil påvirke RyR placering i masken. Dette ville derefter påvirker spatio-temporale dynamikken i calcium signalering i cardiomyocyte (program 1).
Figur 7 viser 3 forekomster af simulerede RyR klynger på samme mesh topologi efter brug af sfæriske kerne intensitet estimator algoritme. Bemærk variationen i organisationen af RyR klynger. Disse variationer er blevet målt til at være inden for den variation, der blev fundet i eksperimentelle data18. Skal udvises forsigtighed med at vælge kerne kuglens radius og den skridt nummer som kernen prøver RyR klynge tæthed. Disse to faktorer påvirker hvor skarpt eller diffust en repræsentation af tætheden af RyR klynger vil blive afbildet på trådnet. En analyse af effekten af forskellige værdier for disse parametre vil bidrage til at indsnævre på parameter valg for en rimelig mesh.
Den resulterende mesh RyR klynger, myofibrils og mitokondrier er en minimal model af cardiomyocyte struktur. Denne maske har været anvendt, samt variationer af det, der var afledt af andre cellestruktur data, at studere calcium dynamics og bioenergetik. En oversigt over disse to programmer er beskrevet nedenfor til at illustrere magt finite element modellering af cellestruktur i giver indsigt på struktur-funktion relationer.
Program 1 18 : Spatiotemporelle dynamics af calcium udsætning i cardiomyocytes. Denne model er blevet brugt til at undersøge rollen for heterogen fordeling af RyR klynger, myofibrils og mitokondrier på calcium signalering. Figur 8 viser cytosole calcium spatiotemporelle dynamik i den stigende fase af forbigående når simuleret på den trådnet topologi genereret fra denne protokol. Figur 8 viser heterogene gratis calcium og fluorophore-bundet-calcium koncentration over tid. Pilene peger på små pletter af høj calcium på grund af en højere tæthed af RyR klynger eller mitokondrier i disse regioner. Figur 8 c viser simulerede linje-scanne billeder, der kan sammenlignes med eksperimentelle linje-scanne billeder af calcium dynamics, der typisk indsamles ved hjælp af live Konfokal mikroskopi. Model simulering giver en meget højere opløsning visning af den rumlige heterogenitet af calcium end et eksperimentelt erhvervede billede. Desuden, på grund af den model, der er afledt af strukturelle mikroskopi data, antallet af klynger, der skal forblive inaktiveret (~ 4-6) efter elektrisk aktivering for heterogeneities at forekomme i Konfokal linje-scan billedet kunne bestemmes nøjagtigt. Lignende heterogeneities er observeret i eksperimentelt erhvervede linje-scanne billeder af calcium dynamics i dyremodeller for hjertesvigt18
Program 2 27 : Spatiotemporelle dynamics af mitokondrie bioenergetik i cardiomyocytes. Et overordnet mål for dette arbejde er at studere forholdet mellem calcium dynamics, mitokondrie bioenergetik og muskelsammentrækning. Som et første skridt, er blevet gennemført simuleringer af mitokondrie oxidativ fosforylering i isolation inden for cardiomyocyte. Som sådan, fordelingen af RyR klynger er ikke nødvendig, og man kan blot bruge trådnet på trin 3.4. Som en mere kompleks program, kunne bioenergetik (program 2) være kombineret med calcium dynamics (program 1) i en model, der bruger alle komponenter i mesh og model konstruktion, dvs mitokondrier, myofibrils og ryanodine receptorer.
Figur 9 repræsenterer resultaterne fra disse rumlige stofskifte simuleringer over forskellige regioner med en maskestørrelse, der er genereret ved hjælp af trin 3.4. Figur 9A skildrer iltkoncentrationen i hele cellen tværsnit, mens figur 9B viser koncentrationen af ADP kun i myofibril rum af cellen. Figur 9 c viser fordeling af mitokondrielle membran potentiale på tværs af mitokondrie netværket. Disse tal afslører ikke ensartet fordeling af mitokondrier og myofibrils i celle tværsnit. De afslører også den inhomogene metaboliske landskab som følge af denne ikke-ensartet ultrastruktur. Dette viser kraften i mikroskopi data baseret finite element simuleringer for at give indsigt på struktur-funktion relationer, som ellers er vanskeligt at opnå gennem eksperimentelle metoder alene.
Figur 1: Langendorff forberedelse af hjertet for kemisk fiksering. (A) skematisk af Langendorff perfusion apparater. Hanen indeholder en ventil til at skifte mellem Tyrodes og Fikseringsvæske løsninger. Bægerglas på basen bruges til at fange løsninger, der perfuse gennem hjertet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: undersøge celle orientering under lysfelt mikroskopi. (A) lyse synsfeltet toluen blå farves tykke del af hjertets væv illustrerer celler, der er på langs orienteret (L) og skråt orienteret (O) med hensyn til den billeddiagnostiske flade; Bemærk riller i cellen på langs orienteret, f.eks. (B) lyse synsfeltet væv sektionslinje, der har den tværgående, tværsnit af cellen på linje med billedbehandling planet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: segmentering af elektronmikroskopi data. (A) øjebliksbillede af manuel segmentering af mitochondrier ved hjælp af værktøjet sculpt. (B) en 3D-visning af den komplette segmenteret manuelt mitokondrier, myofibrils (i en række farver) og sarcolemma (i pink). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: konvertere binær billedstakke til 3D tetrahedrale mesh. (A-C) Binære masker sarcolemma, myofibrils og mitokondrier, henholdsvis. (D) Sammenflettet visning af binære masker af myofibrils (i rødt) og mitokondrier (i grønt). (E) repræsentative tetrahedrale mesh der blev genereret fra billedstak i (D) ved hjælp af iso2mesh. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: CardiacCellMeshGenerator. Et screenshot af den grafiske brugergrænseflade, der ledsager denne protokol publikation for brugere at udføre trin 4 og 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: simulerer en realistisk RyR klynge distribution en segmenteret Elektron Mikroskopi billede stakken af cardiac ultrastruktur. (A) A binært billedstak skildrer huller mellem myofibrils og mitokondrier, som repræsenterer sæt af alle pixels hvor RyR klynger kunne findes. (B) en 3D rendering (billede ikke draget til skala) af en af de simulerede RyR klynge distributioner (vist som rød kugler) inden for 3D geometri afbildet i 3D billedstak; de grønne overflader repræsenterer mitokondrier i en billedstak. (C) en højere-forstørrelse (således en lille del er skåret ud af cellen tværsnit på grænserne) visning af overlejring af RyR klynger fra trin 4 og den beregningsmæssige mesh fra trin 3 på ét udsnit af 3D elektron tomografi billedstak. (B) og (C) er blevet ændret fra Rie mfl. 18 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: rumlige fordeling af numeriske tæthed af RyR klynger fra tre simuleret RyR klynge mønstre. Alle mesh noder er farvekodede fra hvid til numeriske tæthed af 0.0 RyR klynger/µm3 til rød for en maksimal numeriske tæthed af 0,99 RyR klynger/µm3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Rumlige heterogenitet i [Ca2 +]i stigende fase af Ca2 + forbigående. (A) den gennemsnitlige cytosole frit spreder [Ca2 +]jeg (venstre) og Fluo-4 bundet Ca2 +, [F4Ca]jeg (til højre). (B) og (C) Vis time-lapse snapshots af frit spreder Ca2 + og F4Ca på z-disc, tværplan; sorte pile markere områder af høj [Ca2 +]jeg på grund af mitokondrie-klynger; røde pile markere områder af høj [Ca2 +]jeg på grund af flere RyR klynger i umiddelbar nærhed. (C) simulerede linje scanninger af [Ca2 +]jeg (i midten) [F4Ca]jeg (til højre). Line position er vist på celle tværsnit til venstre. Den horisontale dimension af celle tværsnit er blevet leveret som en indikator for den rumlige skala i tværsnit af billedet. Dette tal er blevet ændret fra Rie mfl. 18 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: rumlige fordeling af metabolitter og mitokondrielle membran potentiale genereret fra den rumlige simulering af hjertets energimetabolisme. (A) iltkoncentrationen i hele cellen tværsnit i enheder af µM, (B) koncentration af ADP kun i myofibril del af cellen i enheder af µM. (C) Distribution af mitokondrielle membran potentiale på tværs af de mitokondrielle netværk i enheder af mV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: visualisering af en simuleret RyR klynge punkt mønster på R-statistik pakke. Dette vindue vises ved afslutningen af RyR klynger simuleringer, skildrer først af de simulerede punkt mønstre. Dette kan bruges som en indikator at RyR-simulator har indgået så godt, og kan afhøre kvaliteten af de simulerede mønstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kemikalier | Mængder |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Destilleret vand | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate stødpudelager | |
| Natrium cacodylate | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Udgør 1 L med destilleret vand | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 M natrium cacodylate stødpudelager | |
| Natrium cacodylate | 64,2 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Udgør 1 L med destilleret vand | |
| pH 7,4 | |
| Tyrode løsning sammensætning | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glukose | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenecid | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| NaCl/KCl/NaHCO3 1 L opløsning | |
| NaCl (molekylvægt 58.44 g/mol) | 81.2 g |
| KCl (molekylvægt 74.55 g/mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (molekylvægt 84.01 g/mol) | 14,28 g |
| Opløses i 1 L destilleret vand | |
| MgCl2/CaCl2 1 L opløsning | |
| CaCl2 (2H2O) (molekylvægt 147 g/mol) | 1.764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0.814 g |
| Opløses i 1 L destilleret vand | |
| 1 M glucose 200 mL opløsning | |
| Dextrose (molekylvægt 180.16 g/mol) | 36.03 g |
| Opløses i 200 mL dobbeltdestilleret vand | |
| Tyrode løsning 500 mL opløsning | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glukose | 6 mL |
| Dobbelt destilleret vand | 400 mL |
| Boble ilt i løsning for 5 min | |
| 2% PFA + 2,5% Glutaraldehyd + 0,2% tanic syre fiksativ i 0,15 M natrium cacodylate | |
| PARAFORMALDEHYD pulver (PFA) | 2 g |
| Tanic syre | 0,2 g |
| Destilleret vand | 20 mL |
| 25% glutaraldehyd | 10 mL |
| 0,3 M natrium cacodylate | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL destilleret vand |
| 4% uranyl acetat stamopløsning | |
| Uranyl acetat | 4 g |
| I nærheden af kogende dobbelt destilleret vand | 96 mL |
| Opløse UA i nærheden af bioling vand ved hjælp af en omrører i en fumehood. | |
| Filtrer UA gennem et filter, Whatman #1 i 200 mL brun flaske for let beskyttelse | |
| Cap stramt og label, opbevares ved 4 ° C | |
Tabel 1: Reagenser og mængder for væv forberedelse for Elektron Mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovennævnte protokol beskriver vigtige trin for at generere en roman finite element geometriske model af cardiomyocyte ultrastruktur. Metoden gør det muligt for computational fusion af forskellige mikroskopi (eller i princippet, andre data) metoder til at udvikle en mere omfattende computational model af cardiomyocyte dynamik, der omfatter detaljer af rumlige celle arkitektur. Der er i øjeblikket ingen anden protokol til at oprette sådan en model af en cardiomyocyte.
Trin 1 skitserer en protokol for perfusion fiksering. Alternativt, hjertet kan være skåret ud dissekeret i mindre stykker og nedsænket i fiksativ. Men denne proces skal ske hurtigt og kan have forskellige resultater, afhængigt af størrelsen af prøverne. Forfatternes erfaring sikrer perfusion grundig infiltration af fiksativ i væv og celler. Forfatterne har også tidligere perfunderet hjerte med Krebs-Henseliet løsning at gøre hjertet slå før fiksering. Dette muliggjorde målinger på arbejder hjertet før fiksering.
Elektronmikroskopi behandlingstrin i trin 2 er typiske for elektron tomografi. Forarbejdning løsning mængder, især af farvning løsninger og tider kan variere når ved hjælp af andre billeddiagnostiske teknikker såsom seriel-blok-ansigt scanning elektronmikroskopi eller fokuseret ion-beam mikroskopi28. Erhvervede elektronmikroskopi billeder skal opdeles i forskellige organelle regioner, såsom mitokondrier, myofibrils og tværgående tubuli. Dette kan udføres manuelt eller i en automatiseret måde. Kontrasten i en billedstak er dels afhængig af succes i farvnings-protokollen, men nogle af denne kontrast er tabt, når du udfører tomografi. Denne protokol beskriver manuelle trin for segmentering af de forskellige strukturer, selv om nye metoder til at udføre automatiske segmentering29 vil være mere gunstig generelt at forbedre overførselshastigheden.
De vigtigste kvaliteter til at undersøge i elektronmikroskopi datasæt er billede kontrast og struktur bevarelse. Farvning opskriften og harpiks indlejring blandinger i denne protokol har været raffineret for høj kontrast mellem myofibrils, mitokondrier og z-skiver af cellen hjerte. For eksempel, har forfatterne tidligere brugt calciumchlorid i stedet for garvesyre i trin 1.2 for at afgrænse sarcoplasmic retikulære netværket. Dette hjalp med at identificere myofibril bundter yderkanter under organelle segmentering. Yderligere farvning kemiske komponenter og tider kan også bruges til at visualisere membran strukturer, såsom sarcoplasmic reticulum eller tværgående-axial tubuli30.
Billederne skal også undersøges for strukturelle forringelse. Dårlig kvalitet fiksation eller elektronmikroskopi behandling kan resultere i alvorlige tab af mitokondrie cristae, høj andel af forrykke eller hævede mitokondrier, og opløsningen af dele af cellemembranen (sarcolemma). En tættere og omhyggelig undersøgelse viser muligvis også tab af t-rørformede og SR membraner, men er mindre indlysende for det utrænede øje. Løsninger på dette problem omfatter: (i) at sikre grundig perfusion; (ii) dissekere vævet ind i små prøver, der også sikrer dyb indtrængning af fiksativ og pletter; (iii) at sikre, at elektronmikroskopi behandlingen er færdig i kolde løsninger eller på is, hvor det er angivet; og (iv) at sikre, at tidsindstillingerne for farvning og dehydrering (dehydrering i særdeleshed) følges nøje.
En typisk cardiomyocyte er ~ 20 µm i tværsnit diameter og ~ 100 µm i længden. Dette gør imaging hele hjertet celler en betydelig udfordring. Desuden komplicerer skiftende orienteringen af muskelfibre i hjertet31 yderligere erhvervelse af en billede volumen hvis akser er afstemt med de tværgående og langsgående akser i en celle af interesse. Billede analyse programmer som IMOD aktiverer syntetiske omlægningen af dataene i en ønsket retning. Seneste fremskridt inden for serielle blok-ansigt scanning elektronmikroskopi28 og tilknyttede billedbehandling algoritmer29 også hjælpe med at løse disse problemer. Ikke desto mindre vil omhyggelig undersøgelse af tyk sektioner under et lysmikroskop og efterfølgende omlægning af blok (trin 2,5) øge sandsynligheden for imaging celler med rimelig tilpasning af de langsgående og tværgående akser med imaging akser. Dette vil sikre, at de fleste af cellevolumen vil blive fanget i synsfeltet.
Protokollen trin 3, 4 og 5 kræver software, der er anført i Tabel af materialer skal installeres. IMOD, R-statistik pakke, iso2mesh og FiJi (en version af ImageJ for mikroskopi data) har omfattende dokumentation og tutorials om hvordan man bruger dem. CardiacCellMeshGenerator er en MATLAB program, der er blevet udviklet for at gøre det lettere for brugeren at bygge model i en enkel arbejdsgang. Brugernes kunne dataoverføre den hel kildekode og ansøgning pakke fra github RyR-simulator repository link (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). Ansøgningen, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, kan installeres i MATLAB som en app. Indgange til den trådnet genereret i denne protokol kan findes inde i RyR-simulator/input-filer/target-tomo-celle /, mens de yderligere indgange til RyR-cluster simulator kan findes inde i RyR-simulator/input-filer/master-celle /. Før indlede app, skal brugere sikre at den installerede iso2mesh mappe og dens undermapper er blevet føjet til MATLAB sti. Ligeledes, sikre at R-pakker er nødvendige (Table of Materials) for klynge simulator også har været installeret i R.
En statuslinje er medtaget i app, når du genererer trådnet, når du genererer indgange til RyR klynge simulator, og når kortlægning RyR klynge tætheder på den trådnet ved hjælp af RyR tæthed mapper; app vil gengive 3D-maske i GUI når mesh generation trin har indgået. Efter at have afsluttet RyR klynge simuleringer på R-brugergrænsefladen, vises en grafisk vindue (figur 10), skildrer et af simuleret 3D RyR klynge punkt mønstre.
Knappen "Generer Mesh" på GUI udløser funktionen iso2mesh til at generere en tetrahedrale mesh. Model opløsning kan justeres ved at angive parametrene"iso2mesh" på den GUI, at justere den maksimale tetrahedrale element volume og kant længde. Programmet adskiller i øjeblikket elementer, som udgør regionen myofibril og mitochondrier regioner; Denne funktion vil blive udvidet til at omfatte andre komponenter i cellen i fremtiden.
Brugere kan bruge 3D-gengivelse af trådnet og RyR klynger til fejlfinding i forbindelse med disse trin. RyR klynge simulation indstillinger, etol og numIter, inde i indstillinger. F påvirke nøjagtigheden af RyR klynge simuleringer; disse to parametre bestemmer, hvornår en RyR klynge mønster simulation ophører. Disse parametre kan justeres ved eftersyn af fordelingen af RyR klynger i vinduet R (figur 10) for at sikre, at: (i) alle klynger er tæt på z-diske; og (ii) klyngerne er spredt ud over hele tværsnittet i stedet aggregering i alle regioner. En ad hoc- følsomhedsanalyse af simuleringer til disse to parametre kan gennemføres for at bestemme en passende kombination af etol og numIter.
Sfærisk kerne intensitet estimator i trin 5 bruger en kugle med en diameter på valgte som en kerne, der er gået over omfanget af interesse (den 3D rumlige model i denne sammenhæng). Disse parametre kan indstilles for denne udjævning algoritme på GUI i figur 5: (1) r_sphere definerer radius af sfæriske kerne udjævning; (2) hval definerer iterativ rumlige trin størrelse som skal den sfæriske kerne iterativt bestået over mængden.
En enkel metode til at afgøre, om de rumlige tæthed parametre er tilstrækkelig er at undersøge fordelingen af RyR klynge tæthedsværdier, som vist i figur 7. Tæthedsværdier bør fordeles således, at nabolaget af høj densitet værdier er en lignende størrelse til størrelsen af en RyR klynge i mikroskopi data.
Den nuværende protokol producerer en finite element model, der kun indeholder realistiske fordelingen af myofibrils, mitokondrier og RyR klynger. En udvidelse af dette skridt ville være at simulere fordelingen af andre Ionkanaler, der spiller en rolle i ECC, såsom sarco-endoplasmic retikulære calcium pumper (SERCA2a), natrium-calcium vekslere (NCX) og sarcolemmal calcium pumper. Nøglen til disse udvidelser er en analyse af den geografiske fordeling af Ionkanaler fra immunofluorescens data. For eksempel, NCX kanaler er blevet målt til at være fordelt jævnt over t-rørformede membraner på en gennemsnitlig afstand på 0,67 µm, men deres forhold til RyR klynger er ikke så klart32. På den anden side SERCA2a målretning antistoffer har tidligere været brugt til at markere SR33, men den rumlige tæthed af SERCA2a er ikke blevet rapporteret i litteraturen. På dette tidspunkt antages en ensartet fordeling af SERCA 2A over SR-netværket og NCX over t-tubuli derfor med forsigtighed.
Som påvist i de repræsentative resultater, kan den deraf følgende finite element mesh bruges med finite element solvers34 at simulere biokemiske processer såsom calcium signalering18 og bioenergetik27 som reaktion-diffusion processer. Med henblik herpå, er ion-kanaler repræsenteret som reaktion websteder på noder inden for trådnet topologien. Reaktion websteder fungerer som kilder eller dræn på forskellige kemiske arter, der repræsenterer flow af kemiske arter gennem disse Ionkanaler i forskellige rum i cellen. Output mesh og RyR tæthed filer fra denne protokol, kan bruges med alle andre integrator eller i et andet miljø, forudsat at softwaren har funktionen at genkende disse tekstfiler. Tekstfilerne kan også blive manipuleret af scripts eller tredje-parts software at overholde input fil format i miljøet af valg. Den første ansøgning om calcium dynamics kun viser nytten af denne model for calcium upstroke men dette indikerer ikke, at trådnet ikke kan bruges til længere tidsskalaer. De trådnet og klynge tætheder kan bruges til at simulere flere calcium cyklusser, med opretholdelsen af homøostase og stabilitet kun afhængig af den finite element Problemløser, der bruges.
Et langsigtet mål er at forbedre denne rørledning model bygning for at gøre det nemt at oprette strukturelt nøjagtig finite element modeller af cardiomyocytes og andre celletyper. En automatiseret segmentering algoritme er blevet udviklet for nylig, som kan anvendes til seriel-blok-ansigt scanning elektronmikroskopi data af cardiomyocytes at oprette en model af myofibrils og mitokondrier distribution i hele cellen med minimal bruger input29. Denne metode vil blive udvidet for at segmentere t-tubulus og SR membran netværk i fremtiden. En mere generaliseret udgave af RyR-simulator algoritme, der vil muliggøre brugernes hen til analysere og simulere Co steder mellem ion-kanal og organeller og mellem forskellige ion-kanal typer, i en høj overførselshastighed mode er også under udvikling. En problemfri protokol til at bygge en komplet model af cellen ville gøre det muligt forskerne til at udføre model-baserede hypoteser tests på forholdet mellem cellestruktur og cellefunktion mere rutinemæssigt end det er i øjeblikket muligt med eksperimentelle metoder alene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den kongelige samfund i New Zealand Marsden hurtigt starte Grant 11-UOA-184, menneskelige grænser Science Program Research grant RGP0027/2013 og australsk forskning Rådet Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
