Summary
इस प्रोटोकॉल एक उपंयास विधि की रूपरेखा को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों से cardiomyocytes के intracellular वास्तुकला का एक विशेष रूप से विस्तृत परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए । इस स्थानिक विस्तृत मॉडल की शक्ति कैल्शियम संकेतन और ऊर्जा के मामले में अध्ययन का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।
Abstract
तीन के आगमन के साथ आयामी (3 डी) ऐसे इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी, धारावाहिक के रूप में इमेजिंग प्रौद्योगिकियों-ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी, वैज्ञानिक समुदाय के उप में बड़े डेटासेट के लिए अभूतपूर्व पहुंच है-माइक्रोमीटर संकल्प है कि वास्तुकला remodeling है कि cardiomyocyte समारोह में स्वास्थ्य और रोग में परिवर्तन के साथ साथ विशेषताएं । हालांकि, इन डेटासेट के तहत किया गया है cardiomyocyte फ़ंक्शन में सेल्युलर आर्किटेक्चर remodeling की भूमिका की जांच के लिए उपयोग । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग कर एक cardiomyocyte के एक सटीक परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए रूपरेखा है । सेलुलर वास्तुकला का एक विस्तृत और सटीक मॉडल cardiomyocyte जीव विज्ञान में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है, अकेले प्रयोगों से अधिक जुटाने कर सकते हैं । इस विधि की शक्ति अपने को अभिकलनी cardiomyocyte ultrastructure के दो असमान इमेजिंग विधियों से जानकारी के लिए एक एकीकृत और विस्तृत cardiomyocyte के मॉडल को विकसित करने की क्षमता में निहित है । इस प्रोटोकॉल कदम रूपरेखा के लिए इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और वयस्क पुरुष Wistar के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को एकीकृत (albino चूहा की एक विशिष्ट नस्ल के लिए नाम) चूहा cardiomyocytes के लिए एक आधा sarcomere परिमित तत्व cardiomyocyte के मॉडल का विकास । प्रक्रिया एक सटीक, उच्च संकल्प चित्रण (~ ३५ एनएम के आदेश पर) mitochondria, myofibrils और ryanodine रिसेप्टर क्लस्टर के वितरण की है कि cardiomyocyte के लिए आवश्यक कैल्शियम जारी एक 3 डी परिमित तत्व मॉडल उत्पंन करता है myofibril और cytosolic डिब्बे में sarcoplasmic जालीदार नेटवर्क (SR) से संकुचन । एक उदाहरण के रूप में यहां उत्पंन मॉडल अनुप्रस्थ-tubule वास्तुकला या sarcoplasmic जालीदार नेटवर्क के विवरण शामिल नहीं है और इसलिए cardiomyocyte की एक ंयूनतम मॉडल है । फिर भी, मॉडल पहले से ही अनुकरण में लागू किया जा सकता है आधारित जांच में कोशिका संरचना की भूमिका में कैल्शियम संकेतन और mitochondrial है, जो सचित्र है और दो मामलों के अध्ययन का उपयोग कर चर्चा की है कि निंनलिखित प्रस्तुत कर रहे है विस्तृत प्रोटोकॉल ।
Introduction
उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ECC) दिल में cardiomyocyte झिल्ली के विद्युत उत्तेजना और प्रत्येक दिल की धड़कन के दौरान सेल के बाद यांत्रिक संकुचन के बीच महत्वपूर्ण और जटिल युग्मन करने के लिए संदर्भित करता है । गणितीय मॉडल कड़ी जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का एक मात्रात्मक समझ विकसित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि कार्रवाई की क्षमता को विनियमित1, cytosolic कैल्शियम संकेतन2,3ऊर्जा, और बाद में सिकुड़ा बल पीढ़ी । इस तरह के मॉडल भी सफलतापूर्वक दिल की धड़कन में परिवर्तन की भविष्यवाणी की है जब एक या इन जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के कई परिवर्तन4,5से गुजरना । cardiomyocyte के अत्यधिक संगठित ultrastructure को तेजी से प्रकोष्ठ के सामान्य सिकुड़ा समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने और पूरे हृदय को मान्यता दी गई है. दरअसल, कार्डिएक ultrastructure के घटकों की आकृति विज्ञान और संगठन में परिवर्तन अतिवृद्धि6, हृदय विफलता7, और मधुमेह cardiomyopathy8के रूप में रोग की स्थिति में जैव रासायनिक परिवर्तन के समानांतर में होते हैं । क्या इन संरचनात्मक परिवर्तन मामूली, अनुकूली, या बदलते जैव रासायनिक स्थितियों के लिए रोग प्रतिक्रियाओं अभी भी काफी हद तक अज्ञात है9। स्वाभाविक रूप से तंग फार्म और जीव विज्ञान में समारोह के बीच युग्मन का मतलब है कि अकेले प्रयोगात्मक अध्ययन संरचनात्मक remodeling और cardiomyocyte समारोह के बीच सहसंबंध से गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सकते । गणितीय मॉडल है कि उप के संरचनात्मक विधानसभा-सेलुलर घटकों को शामिल कर सकते है की एक नई पीढ़ी, साथ अच्छी तरह से जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन, के लिए एक व्यापक संबंध की मात्रात्मक समझ विकसित करने के लिए आवश्यक हैं cardiomyocytes में संरचना, जैव रसायन, और सिकुड़ा बल के बीच । इस प्रोटोकॉल विधियों कि cardiomyocytes के संरचनात्मक रूप से सटीक परिमित तत्व मॉडल है कि इस तरह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन किया जा सकता का वर्णन ।
पिछले दशक 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी10, फोकल11, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी12 है कि नैनो में अभूतपूर्व, उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान पैमाने पर और सूक्ष्म पैमाने पर विधानसभा में महत्वपूर्ण प्रगति देखा है cardiomyocyte के उप सेलुलर घटकों । हाल ही में, इन datasets cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16की गणनात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है । इन मॉडलों का उपयोग एक अच्छी तरह से स्थापित इंजीनियरिंग सिमुलेशन विधि, परिमित तत्व विधि17कहा जाता है, परिमित तत्व गणना जाल पर बनाने के लिए जो जैव रासायनिक प्रक्रियाओं और cardiomyocyte संकुचन नकली जा सकता है. हालांकि, ये मॉडल रिज़ॉल्यूशन और विस्तार द्वारा सीमित होते है जो एक माइक्रोस्कोपी पद्धति में छवि डेटासेट प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल संरचना के नैनोमीटर स्तर का विस्तार उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन यह एक मॉडल बनाने के लिए आवश्यक होगा कि छवि के भीतर विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए मुश्किल है. दूसरी ओर, सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी केवल एक चुनें सेल के कुछ आणविक घटकों के ५० एनएम के आदेश पर प्रस्तावों पर उच्च विपरीत चित्र प्रदान कर सकते हैं । केवल इन इमेजिंग विधियों से पूरक जानकारी को एकीकृत करके एक वास्तविक संरचना में परिवर्तन करने के लिए समारोह की संवेदनशीलता का पता लगाने कर सकते हैं । Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अभी भी एक नियमित प्रक्रिया नहीं है और यह अभी भी है कि केवल घटकों की एक सीमित संख्या इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृश्य में दाग सकता है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी देखने के साथ संबंधित सीमा को भुगतना होगा ।
इस प्रोटोकॉल एक उपंयास दृष्टिकोण18 है कि सांख्यिकीय तरीके19 का उपयोग करता है विश्लेषण और गणना के लिए आयन के स्थानिक वितरण पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी जानकारी फ्यूज अंय हृदय पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जानकारी के साथ चैनलों ultrastructure घटक, जैसे myofibrils और mitochondria । यह एक परिमित तत्व मॉडल है कि जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के भौतिक मॉडल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं है कि cardiomyocyte संकुचन विनियमित पर cardiomyocyte उप सेलुलर संगठन की भूमिका का अध्ययन करने के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा करता है । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए स्वस्थ और streptozotocin प्रेरित मधुमेह कार्डियक myocytes से मॉडल बनाने के लिए कार्डियक सेल समारोह है कि मधुमेह पशु मॉडल में मनाया जाता है पर संरचनात्मक remodeling के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है8। प्रस्तुत विधि के सांख्यिकीय प्रकृति का एक अतिरिक्त लाभ भी प्रोटोकॉल में सचित्र है: विधि परिमित तत्व geometries के कई उदाहरण है कि बारीकी से सेल संरचना में मनाया बदलाव की नकल उत्पंन कर सकते हैं ।
एक सिंहावलोकन के रूप में, प्रोटोकॉल कदम में शामिल हैं: (i) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त संकल्प और कंट्रास्ट के साथ 3 डी छवियों को उत्पन्न करने के लिए कार्डियक ऊतक की तैयारी; (ii) IMOD20नामक 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पुनर्निर्माण और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा से 3 डी छवि स्टैक का पुनर्निर्माण और विभाजन; (iii) इनपुट के रूप में विभाजित डेटा का उपयोग कर एक परिमित तत्व मेष उत्पन्न करने के लिए iso2mesh21 का उपयोग करना; (iv) उपंयास एल्गोरिथ्म और कोड का उपयोग करने परिमित तत्व मेष पर आयन चैनलों के वितरण नक्शा ।
हर कदम के दृष्टिकोण के आधार प्रोटोकॉल के भीतर उल्लिखित है, और प्रतिनिधि परिणाम के साथ आंकड़े में प्रदान की जाती हैं । एक सिंहावलोकन निर्दिष्ट कैसे उत्पंन स्थानिक विस्तृत मॉडल ECC के दौरान कैल्शियम की स्थानिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ mitochondrial । प्रोटोकॉल की वर्तमान सीमाओं के कुछ चर्चा कर रहे हैं, साथ ही साथ नए घटनाक्रम है कि उंहें दूर करने के लिए चल रहे है और आगे हृदय प्रणालियों जीव विज्ञान के लिए सेल संरचना की भूमिका का एक मात्रात्मक समझ अग्रिम । कैसे इन तरीकों को अंय प्रकार के सेल के परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है भी संबोधित किया है ।
इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ता चरण 1 और चरण 2 के पुनर्निर्माण भाग को छोड़ सकते है यदि वे एक पूर्व मौजूदा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि स्टैक करने के लिए उपयोग किया है । उपयोगकर्ता जो अधिक अनुभवी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहयोग में अपने डेटा प्राप्त करने का इरादा चर्चा और निर्धारण और विशेषज्ञ के साथ चरण 1 में धुंधला प्रक्रियाओं के अधिग्रहण के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल निर्धारित करना चाहते हो सकता है ।
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Protocol
सभी तरीकों यहां वर्णित ऑकलैंड पशु नैतिकता समिति के विश्वविद्यालय और कैलिफोर्निया के सैन डिएगो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, जहां ऊतक प्रोटोकॉल मूल रूप से विकसित किया गया विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. प्रायोगिक तैयारी
- तालिका 1के अनुसार pH ७.४ पर ०.१५ m और ०.३ m सोडियम cacodylate बफ़र्स के स्टॉक समाधानों को तैयार करें ।
-
तालिका 1 में सूचीबद्ध घटकों का उपयोग करके glutaraldehyde निर्धारण (2% paraformaldehyde (पीएफए) + २.५% glutaraldehyde + ०.२% टेनिंग एसिड पीएच ७.४ में ०.१५ एम सोडियम cacodylate बफर) में तैयार करें ।
- लगातार सरगर्मी के साथ एक चूल्हा पर ६० डिग्री सेल्सियस पर आसुत जल के 20 मिलीलीटर में पीएफए पाउडर के 2 जी भंग ।
- समाधान साफ़ होने तक 1 M NaOH समाधान जोड़ें ।
- समाधान का तापमान ४० ° c के नीचे है जब तक रुको, तो glutaraldehyde के 10 मिलीलीटर और ०.३ मीटर सोडियम cacodylate के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
- ०.२ जी को टैनिंग वाले एसिड से जोड़ें और समाधान में इसे भंग कर दीजिये ।
- ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate की ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक ही दिन में इस्तेमाल किया अगर 4 ° c, या बर्फ पर फ्रिज में निर्धारण के तीन या ४ २० मिलीलीटर की शीशियों की दुकान ।
- 20 मिमी 2, 3-butanedione monoxime (BDM) के साथ Tyrode के समाधान तैयार करें, तालिका 1में नुस्खा के अनुसार.
-
एक धुएं अलमारी के अंदर एक Langendorff उपकरण का निर्माण ।
- क्लैंप २ १०० एमएल प्लास्टिक सिरिंज ट्यूबों दो अलग प्रतिक्रिया के लिए खड़ा है, लगभग ७० स्टैंड बेस से सेमी उच्च ।
- प्लास्टिक सिरिंज ट्यूबों और एक संबंधक 3 मिमी-इनर व्यास टयूबिंग और एक तीन तरह टोंटी के रूप में चित्रा 1में दिखाया का उपयोग ट्यूब कनेक्ट करें ।
- कनेक्टर टयूबिंग, जहां दिल छिड़काव निर्धारण के लिए बंधे हो जाएगा के नीचे करने के लिए एक 3 मिमी बाहरी व्यास प्रवेशनी फिट ।
-
३७ डिग्री सेल्सियस पर Tyrode के समाधान और निर्धारण समाधान के साथ सिरिंज ट्यूबों भरें ।
- उन के माध्यम से सिरिंज समाधान गुजर द्वारा टयूबिंग के भीतर हवा के बुलबुले निकालें ।
2. Cardiomyocyte Ultrastructure का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा प्राप्त
- दिल के उत्पाद और रासायनिक निर्धारण के लिए पशु तैयार करते हैं ।
नोट: इस प्रोटोकॉल विवरण कदम वयस्क पुरुष Wistar प्रक्रिया करने के लिए (albino चूहे की एक विशिष्ट नस्ल के लिए नाम) चूहा कार्डियक ऊतक । जब हृदय ऊतक अंय प्रजातियों से sourced है प्रोटोकॉल संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है ।- Anesthetize ने चूहे का इलाज करके पशु को (200-250 ग्राम वजन करके) ०.५ मिलीलीटर की २५० यू/एमएल हेपरिन वाया intraperitoneal इंजेक्शन के साथ किया । 10 मिनट के लिए रुको, तो pentobarbital के intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहे का इलाज (२१० मिलीग्राम/
- पैर की अंगुली चुटकी पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण के एक उचित डिग्री की पुष्टि करें ।
- ग्रीवा विस्थापन द्वारा पशु Euthanize.
- पहले प्रकाशित जौव लेख के समान विच्छेदन प्रक्रियाओं का उपयोग कर दिल हार्वेस्ट22,23, तो यह बर्फ में जगह-ठंडा खारा ।
- आरोही महाधमनी और cannulate को अलग करें । सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी की नोक सिर्फ अर्द्ध चंद्र वाल्व, जहां कोरोनरी धमनियों शाखा से ऊपर बैठता है । आरोही महाधमनी के चारों ओर एक धागा कसकर टाई ।
- प्रवेशनी से कनेक्ट गुरुत्वाकर्षण चालित Langendorff तंत्र के आधार ऊपर ~ ७० सेमी पर संचालित उपकरण (चित्रा 1).
- Langendorff प्रणाली पर टोंटी ट्विस्ट 2-3 मिनट के लिए 20 मिमी BDM (एक मायोसिन अवरोध करनेवाला) सहित Tyrode समाधान, के साथ दिल perfuse ।
- 2% paraformaldehyde, २.५% glutaraldehyde के निर्धारण के साथ छिड़काव शुरू करने के लिए टोंटी मोड़, और ३७ ° c में ०.१५ M सोडियम cacodylate में ०.२% कमाना एसिड 10 मिनट के लिए । यदि सफल, दिल पीला भूरे रंग की बारी है और कठोर और रबर हो जाएगा ।
- एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, बाएं वेंट्रिकुलर (पार्श्व) मुक्त दीवार से काटना ऊतक ब्लॉकों और ऊतक ब्लॉक लगभग 1 मिमी आकार में3 प्राप्त करते हैं ।
- नमूनों को पहले से ठंडा करने के लिए बर्फ पर एक ही निर्धारण के 20 मिलीलीटर की शीशियों में स्टोर 2 एच के लिए शीशियों में संभव के रूप में कई नमूनों के रूप में स्टोर, और सुनिश्चित करें कि नमूनों समाधान में जलमग्न हो रहे हैं.
चेतावनी: यह नमूनों को ठंडा रखने के लिए महत्वपूर्ण है जब तक नीचे १००% निर्जलीकरण कदम के बाद ।
- इसके अलावा निर्धारण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूनों के दाग ।
- एक गिलास चोंच में ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate बफर की १०० मिलीलीटर डालो और बर्फ पर ठंडा ।
- 4% आज़मियम tetroxide और ०.३ मीटर सोडियम cacodylate के बराबर मात्रा तैयार करें, इसके बाद ०.०८ ग्राम की पोटेशियम ferrocyanide के साथ एक भारी धातु दाग समाधान करने के लिए 2% ferrocyanide आज़मियम और ०.१५ एम सोडियम tetroxide में 2% पोटेशियम cacodylate शामिल हैं । बर्फ पर समाधान ठंडा ।
- पिपेट निर्धारण बाहर और यह पर्याप्त ठंड ०.१५ एम सोडियम cacodylate बफर के साथ की जगह शीशियों में नमूनों को जलमग्न । 5 मिनट के लिए बर्फ पर शीशियों प्लेस ।
- अतिरिक्त निर्धारण को दूर करने के लिए ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate के साथ चार और बार 2.2.3 दोहराएँ चरण.
चेतावनी: छोटे ठीकरा नमूने में प्राप्त कर सकते हैं और ऊतक ब्लॉक अनुभाग के दौरान हीरे चाकू बर्बाद कर सकते हैं क्योंकि कांच पिपेट का उपयोग न करें । यह नमूना करने के लिए उन्हें जोड़ने से पहले बर्फ पर सभी समाधान पूर्व शांत करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी महत्वपूर्ण है कि नमूना समाधान सभी समय के द्वारा कवर रहता है (आंशिक कवरेज के बहुत संक्षिप्त समय नहीं कुछ सेकंड से अधिक स्थाई समाधान बाजारों के दौरान सहन किया जा सकता है) । समाधान को धोने या बदलने के बाद, पिछले समाधान को निकालने के बाद जल्दी से नया समाधान जोड़ें । साथ ही धुल की शीशियों को बर्फ पर रखें । ध्यान दें कि इस कदम समय संवेदनशील नहीं है, ऊतक ब्लॉकों थोड़ा अधिक धोया जा सकता है, अगर जरूरत है । - सोडियम cacodylate बफर बर्फ ठंडा भारी धातु दाग समाधान के साथ बदलें और यह रात भर बर्फ पर दुकान । यह सुनिश्चित करें कि ferrocyanide को हाथ से शीशी मिलाकर अच्छी तरह मिलाया जाए; समाधान काले रंग की बारी चाहिए ।
चेतावनी: आज़मियम विषाक्त है क्योंकि इस कदम प्रदर्शन करते समय धुएं डाकू में काम करते हैं । - पतला 4% जलीय uranyl एसीटेट (UA) स्टॉक समाधान (तालिका 1) 2% करने के लिए स्टॉक UA समाधान और डबल आसुत जल के बराबर मात्रा का उपयोग कर, और यह बर्फ पर ठंडा ।
- बर्फ ठंडा ०.१५ एम सोडियम cacodylate बफर के साथ भारी धातु दाग बदलें, और बर्फ पर 5 मिनट के लिए नमूना मशीन चलो ।
- दोहराएँ कदम 2.2.7 बर्फ पर चार अधिक बार किसी भी अतिरिक्त भारी धातु दाग समाधान कुल्ला करने के लिए ।
- कुल्ला नमूने चार बार, एक 2-ंयूनतम प्रतीक्षा-के बीच में अवधि के साथ शुद्ध पानी में (डबल आसुत पर्याप्त है) ।
- बर्फ के साथ शुद्ध पानी की जगह-ठंड 2% UA और दो बर्फ पर 60-120 मिनट के लिए नमूना मशीन चलो ।
- ठंडा (पर्याप्त नमूनों को जलमग्न करने के लिए) बर्फ है कि निर्जलीकरण कदम में इस्तेमाल किया जाएगा पर ५ २० मिलीलीटर जुटाना शीशियों । छह शीशियों आसुत जल में इथेनॉल के प्रतिशत में वृद्धि हुई है: 20%, ५०%, ७०%, ९०%, और १००% ।
- एक और 20 मिलीलीटर की शीशी में शुद्ध एसीटोन डालो और इथेनॉल शीशियों के साथ साथ बर्फ पर ठंडा ।
- शुद्ध पानी में कुल्ला नमूनों के साथ चार बार बर्फ पर 2 मिनट प्रतीक्षा अवधि के लिए अतिरिक्त UA धोने ।
- इथेनॉल में निर्जलीकरण नमूने ।
- इस प्रकार के रूप में नमूना शीशी के भीतर समाधान की जगह क्रमिक द्वारा शीत इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलीकरण, बर्फ पर: 10 मिनट के लिए 20% इथेनॉल; 10 मिनट के लिए ५०% इथेनॉल; 10 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल; 10 मिनट के लिए ९०% इथेनॉल; फिर 10 मिनट के लिए १००% इथेनॉल में दो बार ।
- ठंडा शुद्ध एसीटोन के साथ अंतिम १००% इथेनॉल की जगह और 10 मिनट के लिए एक कमरे तापमान प्रयोगशाला बेंच पर नमूना शीशी जगह से कमरे के तापमान के लिए संक्रमण नमूना ।
- एक और 10 मिनट के तापमान पर शुद्ध एसीटोन में धो प्रदर्शन करने के लिए संघनित्र कि शीशियों के भीतर चौकसी है हटाने । जबकि मशीनिंग, ऊपर एसीटोन/
- 50:50 शुद्ध एसीटोन और epoxy राल के साथ शीशियों में शुद्ध एसीटोन बदलें (निर्माता द्वारा कहा गया के रूप में epoxy राल घटकों के लिए अनुपात के साथ) । एक ही बैच से सभी घटकों का उपयोग करें । एक रोटर पर रात भर राल भरा नमूना शीशियों छोड़ दें ।
- राल में नमूने एंबेड ।
- ७५% राल के साथ 50:50 राल बदलें (25% एसीटोन) और 3 एच के लिए मशीन, आगे की मशीन के द्वारा पीछा किया/4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर १००% राल में घुसपैठ ।
- ताजा १००% राल के साथ १००% राल बदलें, और ऊतक के नमूनों में राल के गहरे प्रवेश के लिए रात भर नमूना शीशियों छोड़ दें ।
- शीशियों से बाहर नमूने ले लो और उंहें कंटेनरों कि ओवन के अनुकूल है और एक फ्लैट आधार है में जगह; एल्यूमीनियम या चांदी पंनी बेकिंग कप उदाहरण के लिए, इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- धीरे डालो (नमूनों के विस्थापन से बचने के लिए) नमूनों पर ताजा राल (इस प्रकार राल में नमूनों embedding) और polymerize राल और नमूनों में एक ओवन में ६० ° c के लिए ४८ h.
- फिर से-ओरिएंट क्रॉस-अनुभाग में छवि कोशिकाओं के लिए राल ब्लॉकों ।
- राल ब्लॉकों से 1 µm मोटी परीक्षण वर्गों प्राप्त करने के लिए सेल अभिविन्यास24का आकलन करने के लिए एक गिलास चाकू के साथ एक ultramicrotome का उपयोग कर.
- 1% टोल्यूनि नीले और 1% बोरेक्रस के साथ 20 एस के लिए मोटी परीक्षण वर्गों दाग ।
- एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत मांसपेशी सेल अभिविन्यास की जाँच करें.
- के आधार पर सना हुआ परीक्षण वर्गों, फिर से ओरिएंट longitudinally या परोक्ष उंमुख की छवियों से आस्थगित अभिविंयास ( चित्रा 2aके समान) राल ब्लॉकों को सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को कांच के चाकू के संपर्क में है ताकि वे पार में कटौती की जाएगी अनुभाग ( चित्र b) के समान ।
- छवि ऊतक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का उपयोग कर वर्गों ।
- अर्द्ध पतले वर्गों (~ ३०० एनएम) एक हीरे चाकू का उपयोग कर उंमुख ऊतक ब्लॉकों के प्राप्त करने और तांबे ग्रिड पर वर्गों के हस्तांतरण25.
- 2% UA और सातो सीसा25के साथ मोटी वर्गों दाग ।
- 25वर्गों के दोनों किनारों पर कोलाइडयन सोने के कण लागू करें ।
- से अनुमानित छवियों की एकल या दोहरे अक्ष झुकाव श्रृंखला के सेट प्राप्त करें-७० ° से + ७० °25।
- IMOD20 का प्रयोग करें 3 डी छवि ढेर (2d छवियों की एक श्रृंखला है कि एक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी खंड के 3 डी जानकारी प्रदान) के पुनर्निर्माण के लिए सेल के । यह खंगाला गया स्टैक अगले चरण में विभाजित किया जाएगा ।
3. खंड Myofibrils और Mitochondria क्षेत्रों से एम 3 डी छवि डेटासेट
- IMOD प्रोग्राम "3dmod" निष्पादित करें ।
- 3dmod ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस के भीतर, ". आरईसी" या ". mrc" फ़ाइल का पता दर्ज करें जिसमें कक्ष का 3d खंगाला गया छवि डेटासेट (चरण २.७ में जेनरेट किया गया) प्रविष्टि बॉक्स में "इमेज फाइल (ओं) को लेबल किया गया है:", फिर "OK" दबाएँ.
- के अंतर्गत "फ़ाइल" मेनू, नए मॉडल का चयन करें, फिर "फ़ाइल" के अंतर्गत "मॉडल के रूप में सहेजें"... मेनू आइटम का उपयोग कर एक उचित नाम के साथ फ़ाइल सहेजें ।
नोट: IMOD में किसी ऑब्जेक्ट को "ऑब्जेक्ट" को बनाने वाले सेगमेंट घटकों का संग्रह हो सकता है । डिफ़ॉल्ट रूप से, एक नया मॉडल id "#1" के साथ एक नया ऑब्जेक्ट होता है । - "विशेष" मेनू के अंतर्गत, "आरेखण उपकरण" का चयन करें । यह एक नया उपकरण है कि चित्रा 3ए में दिखाया के समान बार खुलेगा ।
नोट: कई उपकरण है कि विभिंन organelle सीमाओं के आसपास आकृति बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन उपकरणों का उपयोग करने के तरीकों पर अधिक मदद IMOD20 दस्तावेज़ीकरण में पाया जा सकता है । - "आरेखण उपकरण" मेनू में "मूर्तिकार" विकल्प चुनें, और माउस को छवि विंडो पर ले जाएं; माउस सूचक पर केंद्रित एक गोलाकार समोच्च दिखाई देगा ।
- एक mitochondrion (छवि फ़ाइलों का गहरा क्षेत्रों, के रूप में चित्रा 3ए में हरी समोच्च लाइनों के साथ बंदिशें द्वारा सचित्र) के रूप में मध्य माउस बटन दबाए रखकर, सर्कल समोच्च की परिधि को अपनी सीमा के आकार में खींचें ।
- एक बार mitochondrion सीमा का भ्रमण पूरा हो गया है, मध्य बटन छोड़ें और डेटा में प्रत्येक mitochondrion के लिए चरण ३.६ दोहराएं । प्रत्येक समोच्च स्वचालित रूप से एक ही वस्तु के भीतर एक नए समोच्च के रूप में IMOD द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा ।
- के तहत "संपादित करें । ऑब्जेक्ट "मेनू, कोई नया ऑब्जेक्ट बनाने के लिए" नया "का चयन करें । यह स्वचालित रूप से एक द्वारा ऑब्जेक्ट्स की कुल संख्या में वृद्धि करेगा और यह संख्या नए ऑब्जेक्ट को असाइन करेगी ।
- चरण ३.६ और ३.७ खंड और myofibril आकृति को सहेजने के लिए दोहराएँ ।
- दोहराएँ चरण ३.८, चरण ३.६ के बाद, कक्ष सीमा के रूप में अच्छी तरह से खंड करने के लिए ।
- "फ़ाइल" मेनू के अंतर्गत मॉडल फ़ाइल सहेजें ।
- चित्रा 4a-Cमें illustrated के रूप में एक बाइनरी मास्क में प्रत्येक ऑब्जेक्ट समूहीकरण में कनवर्ट करने के लिए एक आदेश-पंक्ति विंडो में निम्न आदेश निष्पादित करें ।
- किसी विशिष्ट ऑब्जेक्ट को मॉडल से निकालें "imodextract ऑब्जेक्ट modelfile outputmodelfile" जहां "ऑब्जेक्ट" निकाला जा करने के लिए ऑब्जेक्ट की संख्या है ।
- उस ऑब्जेक्ट के लिए एक मास्क बनाएं: imodmop-मास्के २५५ outputmodelfile imagefile outputmask mrc
- फ़ाइल को tif स्टैक में कनवर्ट करें: mrc2tif-s outputmask. mrc outputmask. tif
4. विभाजित घटकों से एक परिमित तत्व मेष बनाएं
- Iso2mesh एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध MATLAB volumetric tetrahedral परिमित तत्व जाल में TIFF छवि स्टैक परिवर्तित करने के लिए प्रोग्राम है । डाउनलोड करें और iso2mesh.sourceforge.net से MATLAB पथ में iso2mesh जोड़ें ।
- स्रोत कोड और डेटा डाउनलोड github वेबसाइट https://github.com/CellSMB/RyR-simulator से मेष पर RyR समूहों अनुकरण करने के लिए ।
- CardiacCellMeshGenerator MATLAB अनुप्रयोग (चित्र 5) प्रारंभ करें ।
- MATLAB में विभिंन organelle घटक मास्क लोड जीयूआई के ऊपरी बाएं हाथ की ओर तीन पुश बटन का उपयोग कर ।
- अंय बाइनरी छवि स्टैक बनाएं जो आरेख 6Aमें दिखाए गए के रूप में myofibrils और mitochondria के बीच अंतराल demarcates ।
- खुला ImageJ ।
- फ़ाइल का उपयोग करना । संवाद खोलें, myofibrils और mitochondria tiff स्टैक प्रोग्राम में लोड करें ।
- प्रक्रिया का चयन करके छवि इसके अलावा प्लगइन आरंभ । कैलकुलेटर प्लस "।
- i1 के रूप में myofibril छवि स्टैक का चयन करें, i2 के रूप में mitochondria छवि स्टैक, और "जोड़ें" ऑपरेटर चुनें । "ठीक" क्लिक करें ।
- एक नई छवि 4.5.4 के परिणाम का प्रतिनिधित्व करने के ढेर के बाद प्रकट होता है, का चयन करें "संपादित करें । उलटा " चित्र 6Aके समान एक छवि स्टैक बनाने के लिए ।
- CardiacCellMeshGenerator प्रोग्राम पर "RyRGapsFile" बटन को धकेल कर myofibrils और mitochondria के बीच के अंतराल के बाइनरी छवि स्टैक युक्त फ़ाइल लोड करें ।
- जीयूआई पर "उत्पन्न मेष" पुश. यह ' cgalmesh ' विकल्प के साथ iso2mesh कमांड v2m ट्रिगर करने के लिए एक tetrahedral के समान जाल उत्पंन होगा चित्रा 4E। तीन फ़ाइलें आउटपुट होगा इस चरण के अंत में: एक. एलेा फ़ाइल,. face फ़ाइल, और एक. नोड फ़ाइल है कि तत्वों को बनाने वाले नोड्स की लिस्टिंग हो जाएगा, नोड्स है कि ऊपर चेहरे, और नोड्स के निर्देशांक क्रमशः.
5. गणितीय परिमित तत्व मेष पर ब्याज की आयन-चैनलों के स्थानिक रूप से अलग घनत्व नक्शा ।
-
RyR-सिंयुलेटर के लिए आवश्यक जानकारी उत्पंन बटन धक्का द्वारा लेबल जीयूआई पर RyR-सिंयुलेटर आदानों उत्पंन ।
नोट: बटन एक समारोह generateRyRsimulatorInputs. m ट्रिगर, जो निंनलिखित जानकारी का उपयोग करता है से कदम 4 आदानों उत्पंन करने के लिए:
(1) outDir: RyR क्लस्टर सिमुलेशन के लिए आवश्यक हैं जो आउटपुट फ़ाइलों के लिए स्थान है ।
(2) imres: छवि स्टैक्स के तीन दिशाओं में पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन ।
(3) myofibril_file: बाइनरी छवि वाली फ़ाइल चित्रा 4Bमें दिखाए गए जैसे स्टैक ।
(4) sarcolemma_file: बाइनरी छवि युक्त फ़ाइल चित्रा 4aमें दिखाया गया है कि जैसे ढेर ।
(5) ryrgaps_file: बाइनरी छवि वाली फ़ाइल उस तरह स्टैक होती है जो चित्रा 5में दिखाई गई थी ।- इस फ़ंक्शन निष्पादित करता है, के बाद जाँच करें कि निम्न फ़ाइलें outDir पथ के रूप में निर्दिष्ट निर्देशिका में बनाया गया है:
- d_axial_micron. txt, जो z-डिस्क की स्थिति और छवि स्टैक में पिक्सेल के शेष के बीच अक्षीय दूरी का प्रतिनिधित्व करता है ।
- d_radial_micron. txt, जो इयूक्लिडियन दूरी का प्रतिनिधित्व करता है (अक्षीय घटक को छोड़कर) z-डिस्क विमान पर पिक्सल के लिए संभावित RyR क्लस्टर स्थानों के सेट में प्रत्येक पिक्सेल से ।
- W_micron. txt, जो RyR क्लस्टर्स के लिए सभी उपलब्ध पदों के स्थानिक निर्देशांकों की सूची का प्रतिनिधित्व करता है ।
- शेष 3 फ़ाइलें फ़ोल्डर में प्रत्यय "_pixel" "_micron" के बजाय यह निरूपित करने के लिए कि इन फ़ाइलों के भीतर मानों में पिक्सेल निर्देशांक प्रपत्र लिखा गया है ।
-
myofibrils की बाइनरी छवि स्टैक पर RyR क्लस्टर वितरण अनुकरण ।
- पुश बटन लेबल "ओपन RyR-सिंयुलेटर में आर" कार्यक्रम शुरू करने के लिए ।
- आर जीयूआई पर, चुनें "फ़ाइल । खोलें "और फ़ाइल ढूंढें" सेटिंग्स । आर "के भीतर RyR-सिंयुलेटर पैकेज (RyR-सिंयुलेटर/ R) ।
- इसके अलावा फ़ाइल ryr-सिंयुलेटर-समानांतर खोलें । आर (RyR में स्थित-सिंयुलेटर/स्रोत/RyR-सिंयुलेटर-समानांतर । R). Rstudio (https://www.rstudio.com) या एक सादा कमांड लाइन इंटरफेस जैसे वातावरण इस्तेमाल किया जा सकता है, एक खोल या कमांड विंडो में R64 आदेश का उपयोग उदा ।
- सेटिंग्स में पैरामीटर्स परिवर्तित करें । R नीचे विस्तृत रूप में फ़ाइल:
- सेट Path2 फ़ोल्डर पता करने के लिए 5.1.2 में सूचीबद्ध फ़ाइलें RyR क्लस्टर्स और myofibrils के एक के लिए एक का अधिग्रहण किया फोकल स्टैक के लिए सूची है ।
नोट: github भंडार फ़ोल्डर इनपुट-फ़ाइलें/मास्टर-सेल/पहले से ही एक पहले से एकत्रित छवि स्टैक के लिए जनरेट किया गया फ़ाइलें हैं । - जहाँ चरण 5.1.2 में जनरेट किया गया फ़ाइलें संग्रहीत की गई हैं एक फ़ोल्डर पता करने के लिए Path4 सेट करें ।
- Path3 बिंदु सेट करने के लिए एक फ़ोल्डर जहां उपयोगकर्ता चाहता है नकली RyR क्लस्टर स्थानों को सहेजा जा करने के लिए ।
- मॉडल (आमतौर पर २०० से ३०० की श्रेणी में) में नकली होने के लिए RyR क्लस्टर की संख्या के लिए N सेट करें ।
- सेट etol, एक सहिष्णुता सेटिंग, RyR क्लस्टर के प्रयोग मापा स्थानिक वितरण और मॉडल RyR समूहों की नकली स्थानिक वितरण के बीच अंतर के लिए ।
- RyR-Simulator etol मान को संतुष्ट एक नकली RyR क्लस्टर प्रतिमान ढूँढने के लिए ले जाना चाहिए प्रयास की संख्या को सीमित करने के लिए numIter सेट करें ।
नोट: etol और numIter के लिए मान सेटिंग्स के भीतर विशिष्ट मानों के लिए सेट किया गया है । R फ़ाइल । - अलग RyR क्लस्टर पैटर्न है कि उपयोगकर्ता अनुकरण करना चाहता है की संख्या के लिए numPatterns सेट (आमतौर पर, यह उपयोगी व्यवहार है सांख्यिकीय विश्वास के लिए ९९ पैटर्न अनुकरण) ।
- numCores सेट के साथ तेजी से समानांतर प्रसंस्करण के लिए कई CPU धागे (कोर) के उपयोग को सक्षम करने के लिए बिंदु पैटर्न अनुकरण ।
- सेट Path2 फ़ोल्डर पता करने के लिए 5.1.2 में सूचीबद्ध फ़ाइलें RyR क्लस्टर्स और myofibrils के एक के लिए एक का अधिग्रहण किया फोकल स्टैक के लिए सूची है ।
- जांच करें कि निंनलिखित संकुल आर में पैकेज इंस्टॉलर जीयूआई का उपयोग कर स्थापित कर रहे हैं: हिमपात, doSNOW, doparallel, foreach, पुनरावृत्तियों, और rgl ।
- आर कमांड विंडो में निंनलिखित आदेश दर्ज करके सिम्युलेटर निष्पादित: स्रोत (' ryr-सिंयुलेटर-समानांतर पथ । R ', chdir = TRUE)
नोट: RyR-Simulator प्रोग्राम का आउटपुट. txt फ़ाइलों की एक सूची है (एक numPatterns फ़ाइल जनरेट किया जाएगा) जिसमें n पंक्तियों और 3 कॉलम, जो x, y, और z का प्रतिनिधित्व करता है में समंवय सूचियां n नकली RyR समूहों के निर्देशांक ।
-
CardiacCellMeshGenerator का उपयोग कर एक गणना मॉडल पर स्थानिक घनत्व के रूप में नक्शा अंक ।
- "का चयन करें RyR अंक फ़ाइल" लेबल बटन का चयन करके, उन है कि RyR-सिंयुलेटर द्वारा उत्पादन किया गया से एक नकली RyR क्लस्टर वितरण पाठ फ़ाइल का चयन करें ।
- MATLAB में जीयूआई पर "RyR घनत्व मैपर" निष्पादित । यह एक गोलाकार कर्नेल तीव्रता अनुमानक विधि26नामक विधि का उपयोग करते हुए चरण ४.८ में उत्पन्न किया गया था जो परिमित तत्व मेष पर 5.3.1 चरण में. txt फ़ाइल में अनुकरणीय RyR क्लस्टर के स्थानिक स्थानों नक्शा होगा ।
नोट: इस कदम से आउटपुट. txt विस्तार के साथ एक फ़ाइल है कि आयन के संख्यात्मक घनत्व के लिए मूल्यों की एक सूची में शामिल है, गणना मेष नोड्स में से प्रत्येक पर प्रति इकाई गोलाकार मात्रा चैनल ।
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Representative Results
चित्रा 2 के माध्यम से चित्रा 7 इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं: (i) पार-अनुभागीय इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विचारों के लिए ऊतक ब्लॉकों visualizing और reओरिएंट; (ii) एक 3d इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि स्टैक जनरेट कर रहा है; (iii) ब्याज के organelles के लिए उप-सेलुलर ultrastructure को विभाजित करना; (iv) एक परिमित तत्व iso2mesh का उपयोग कर मेष की पीढ़ी; (v) जाल पर RyR समूहों के एक यथार्थवादी वितरण अनुकरण; (vi) गणना जाल पर एक स्थानिक घनत्व के रूप में इस स्थानिक वितरण मानचित्रण द्वारा पीछा किया ।
चित्रा 2 ठेठ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों है कि दिखाने के लिए कैसे कोशिकाओं दिखाई जब उन्मुख longitudinally (चित्रा 2a, बला एल), परोक्ष (आंकड़ा 2a, बला ओ) और क्रॉस-अनुभागीय (आंकड़ा 2 बी) के संबंध में प्रदर्शित करता है विमान काटना । तिरछा और longitudinally मूलक नमूनों का प्रदर्शन striations है, जबकि क्रॉस-सेक्शनल ओरिएंटेड नमूनों का प्रदर्शन striations नहीं है. केशिकाओं भी परोक्ष विचारों की तुलना में पार अनुभागीय विचारों में अधिक परिपत्र दिखाई देते हैं ।
चित्रा 3 ए एक अच्छी गुणवत्ता स्कैन स्टैक है कि जब चरण 1 में ऊतक तैयारी प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है प्राप्त कर सकते है की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । देखभाल जब माइक्रोस्कोप छवि झुकाव श्रृंखला से 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन लिया जाना चाहिए । कोलाइडयन सोने के कणों की गलत ट्रैकिंग, या पर्याप्त सोने के कणों की कमी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते है-छवि इसके विपरीत और स्कैन की छवि ध्यान केंद्रित काफी । यह अलग संरचनाओं काफी खंड की क्षमता को प्रभावित करता है । देखभाल और अनुभव के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक ब्लॉकों पर्याप्त दाग रहे है और है कि वहां ऊतक की मात्रा के माध्यम से कोलाइडयन सोने के कणों का एक भी वितरण है आवश्यक हैं । यदि संदेह में, यह एक विशेषज्ञ प्रयोगशाला या स्थानीय संस्था में सुविधा के साथ परामर्श करने के लिए उपयोगी हो सकता है । यदि मॉडल पीढ़ी कम विपरीत या गलत तरीके से खंगाला डेटा के साथ प्रयास किया है, मॉडल अभी भी उत्पंन किया जा सकता है लेकिन जैविक प्रणालियों के गुणों के साथ मॉडलिंग परिणामों के पत्राचार के लिए गरीब हो सकता है । चित्र बी myofibrils और mitochondria की एक विभाजित मॉडल की तरह लगता है की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है.
चित्रा 4E tetrahedral मेष कि iso2mesh द्वारा उत्पादित है की एक 3 डी प्रतिपादन से पता चलता है । जब तक मूल इमेज टैक् स और फॉल्ट के कार्य अच् छी गुणवत्ता के होते हैं, तब तक यह कदम काफी दमदार है । फिगर घमण्ड और फिगर 6C एक ठेठ RyR क्लस्टर वितरण (लाल में) 3 डी सेलुलर टोपोलॉजी के भीतर दिखा । इस स्तर पर, जाल ही RyR सिम्युलेटर में इनपुट नहीं है । कक्ष सीमा के एक छवि स्टैक और myofibrils और mitochondria के बीच अंतराल — चित्रा 4 में विभाजित छवियों से उत्पंन — RyR सिम्युलेटर में प्रमुख निविष्टियां बनाते हैं । देखभाल myofibrils और mitochondria की सीमाओं के रूप में सही रूप में संभव के रूप में खंड लिया जाना चाहिए; गलत विभाजन डेटा में सेल टोपोलॉजी के एक गलत प्रतिनिधित्व है, जो फलस्वरूप मेष के भीतर RyR स्थान को प्रभावित करेगा परिणाम होगा । यह तो cardiomyocyte (अनुप्रयोग 1) में संकेत कैल्शियम की spatio-लौकिक गतिशीलता को प्रभावित करेगा ।
चित्रा 7 गोलाकार कर्नेल तीव्रता अनुमानक एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के बाद एक ही जाल टोपोलॉजी पर नकली RyR समूहों के 3 उदाहरणों से पता चलता है । सूचना RyR क्लस्टर के संगठन में भिंनता है । इन परिवर्तनों को प्रयोगात्मक डेटा18में पाया गया था कि परिवर्तनशीलता के भीतर होने के लिए मापा गया है । ध्यान कर्नेल क्षेत्र त्रिज्या और कदम आकार जिस पर गिरी नमूने RyR क्लस्टर घनत्व को चुनने में लिया जाना चाहिए । इन दो कारकों को प्रभावित कैसे तेजी से या diffusely RyR समूहों के घनत्व का एक प्रतिनिधित्व मेष पर चित्रित किया जाएगा । इन मापदंडों के लिए विभिंन मूल्यों के प्रभाव का एक विश्लेषण एक उचित जाल के लिए पैरामीटर विकल्प पर नीचे संकीर्ण करने में मदद मिलेगी ।
RyR समूहों, myofibrils, और mitochondria के परिणामस्वरूप मेष cardiomyocyte संरचना का एक ंयूनतम मॉडल है । यह जाल लागू किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से यह है कि अंय सेलुलर संरचना डेटा से व्युत्पंन, कैल्शियम गतिशीलता और ऊर्जा के अध्ययन के लिए किया गया के रूपांतरों । इन दो आवेदनों का एक सिंहावलोकन नीचे उल्लिखित करने के लिए संरचना-समारोह संबंधों पर अंतर्दृष्टि देने में कोशिका संरचना के परिमित तत्व मॉडलिंग की शक्ति का वर्णन है ।
अनुप्रयोग 1 18 : cardiomyocytes में कैल्शियम रिलीज के Spatiotemporal गतिशीलता । इस मॉडल में कैल्शियम सिग्नलिंग पर RyR क्लस्टर्स, myofibrils, और mitochondria के विषम वितरण की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है । चित्रा 8 जब इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न जाल टोपोलॉजी पर नकली क्षणिक के बढ़ते चरण के दौरान cytosolic कैल्शियम की spatiotemporal गतिशीलता से पता चलता है. चित्रा 8B समय के साथ विषम मुक्त कैल्शियम और fluorophore-बाध्य कैल्शियम एकाग्रता से पता चलता है. तीर RyR समूहों या उन क्षेत्रों में mitochondria के एक उच्च घनत्व के कारण उच्च कैल्शियम के छोटे धब्बे को इंगित करते हैं । चित्रा 8C नकली लाइन स्कैन छवियों है कि प्रयोगात्मक लाइन की तुलना में किया जा सकता है दिखाता है-कैल्शियम गतिशीलता है कि आम तौर पर जीना फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एकत्र की छवियों को स्कैन । मॉडल सिमुलेशन एक प्रयोगात्मक अधिग्रहीत छवि से कैल्शियम की स्थानिक विविधता का एक बहुत उच्च संकल्प को देखने प्रदान करता है । इसके अलावा, मॉडल के कारण संरचनात्मक माइक्रोस्कोपी डेटा से व्युत्पंन किया जा रहा है, क्लस्टर की संख्या है कि निष्क्रिय रहना चाहिए (~ 4-6) heterogeneities के लिए विद्युत सक्रियण के बाद फोकल लाइन में होने के लिए स्कैन छवि ठीक निर्धारित किया जा सकता है । इसी तरह के heterogeneities में मनाया जाता है प्रायोगिक रूप से अधिग्रहीत लाइन-स्कैन छवियों के पशु मॉडल में कैल्शियम गतिशीलता के दिल की विफलता18
अनुप्रयोग 2 27 : cardiomyocytes में mitochondrial के Spatiotemporal गतिशीलता । इस काम का एक व्यापक उद्देश्य कैल्शियम गतिशीलता, mitochondrial, और मांसपेशियों के संकुचन के बीच संबंध का अध्ययन करने के लिए है । पहले कदम के रूप में, cardiomyocyte के भीतर अलगाव में mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के सिमुलेशन आयोजित किया गया है । जैसे, RyR समूहों के वितरण की जरूरत नहीं है, और एक बस ३.४ कदम पर जाल का उपयोग कर सकते हैं । एक अधिक जटिल आवेदन के रूप में, (आवेदन 2) कैल्शियम गतिशीलता के साथ युग्मित किया जा सकता है (अनुप्रयोग 1) एक मॉडल है कि सभी जाल और मॉडल निर्माण में माना जाता घटकों का उपयोग करता है, यानी mitochondria, myofibrils, और ryanodine में रिसेप्टर्स.
चित्रा 9 इन स्थानिक चयापचय सिमुलेशन से एक कदम ३.४ का उपयोग कर उत्पन्न जाल के विभिन्न क्षेत्रों पर परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है । चित्रा 9A कोशिका पार अनुभाग भर में ऑक्सीजन एकाग्रता को दर्शाया गया है, जबकि आंकड़ा 9B केवल कक्ष के myofibril डिब्बे में ADP की एकाग्रता से पता चलता है. चित्रा 9C mitochondrial नेटवर्क के पार mitochondrial झिल्ली क्षमता के वितरण को दर्शाया गया है । ये आंकड़े सेल क्रास सेक्शन में mitochondria और myofibrils के नॉन यूनिफॉर्म डिस्ट्रीब्यूशन को उजागर करते हैं । वे भी इस गैर वर्दी ultrastructure से उत्पंन सजातीय चयापचय परिदृश्य प्रकट करते हैं । यह सूक्ष्म डेटा की शक्ति संरचना पर अंतर्दृष्टि देने के लिए परिमित तत्व सिमुलेशन आधारित समारोह संबंधों कि अंयथा प्रयोगात्मक अकेले तरीकों के माध्यम से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है दर्शाता है ।
चित्र 1: रासायनिक निर्धारण के लिए दिल की तैयारी Langendorff । (क) Langendorff छिड़काव तंत्र की योजनाबद्ध. टोंटी एक वाल्व है Tyrode और निर्धारण समाधान के बीच स्विच होता है । बेस पर यूरिन का इस्तेमाल दिल के जरिए perfuse को पकड़ने के लिए किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत सेल अभिविन्यास का परीक्षण. (क) टोल्यूनि नीले रंग के चमकीले क्षेत्र के दृश्य कार्डियक ऊतक कि longitudinally उंमुख (एल) और परोक्ष रूप से उंमुख (ओ) इमेजिंग विमान के संबंध के साथ कर रहे है illustrating के ऊतकों की मोटी अनुभाग; उदाहरण के लिए, longitudinally ओरिएंटेड कक्ष में striations को नोट करें । (ख) एक ऊतक अनुभाग है कि अनुप्रस्थ, सेल के पार अनुभाग इमेजिंग विमान के साथ गठबंधन किया है की उज्ज्वल क्षेत्र देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा के फॉल्ट । (एक) mitochondria के मैनुअल विभाजन का स्नैपशॉट मूर्तिकार उपकरण का उपयोग कर । (B) पूर्ण मैंयुअल रूप से विभाजित mitochondria का 3d दृश्य, myofibrils (रंगों की एक किस्म में), और sarcolemma (गुलाबी में) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4:3 डी tetrahedral जाल में बाइनरी छवि स्टैक परिवर्तित. (A-C) क्रमशः sarcolemma, myofibrils और mitochondria के बाइनरी मास्क । (D) myofibrils के बाइनरी मास्क (लाल) और mitochondria (हरे रंग में) का विलयित दृश्य । (E) प्रतिनिधि tetrahedral मेष कि छवि में ढेर से उत्पंन किया गया था (डी) iso2mesh का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5: CardiacCellMeshGenerator. ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस का एक स्क्रीनशॉट जो 4 और 5 चरण निष्पादित करने के लिए उपयोगकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल प्रकाशन के साथ जुडा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: एक खंडित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि कार्डियक ultrastructure के ढेर पर एक यथार्थवादी RyR क्लस्टर वितरण अनुकरण । (क) myofibrils और mitochondria के बीच के अंतराल का चित्रण करने वाली एक बाइनरी इमेज स्टैक है, जो सभी पिक्सेल के सेट का प्रतिनिधित्व करती है जहां RyR क्लस्टर पाया जा सकताहै. (B) 3d छवि स्टैक में दर्शाए गए 3d ज्यामिति के भीतर नकली RyR क्लस्टर वितरण (लाल क्षेत्रों के रूप में दिखाया गया) में से किसी एक 3d रेंडरिंग (छवि स्केल करने के लिए आरेखित नहीं); हरी सतहों छवि स्टैक में mitochondria का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) एक उच्च आवर्धन (इस प्रकार एक छोटे से हिस्से की सीमाओं पर सेल पार से काट रहा है अनुभाग) चरण 4 से RyR समूहों के ओवरले के दृश्य और 3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी छवि ढेर का एक टुकड़ा पर कदम से गणना जाल । (ख) और (ग) राजगोपाल एट अलसे संशोधित किया गया है । 18 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 7: तीन नकली RyR क्लस्टर पैटर्न से RyR क्लस्टर के संख्यात्मक घनत्व के स्थानिक वितरण । सभी मेष नोड्स ०.० RyR क्लस्टर्स/µm3 के सांख्यिक घनत्व के लिए सफेद से रंग कोडित हैं ०.९९ RyR क्लस्टर्स/µm3की अधिकतम संख्यात्मक घनत्व के लिए लाल/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 8: में स्थानिक विविधता [ca2 +]मैं ca के बढ़ते चरण के दौरान2 + क्षणिक । (क) औसत cytosolic आसानी से फैलाना [ca2 +]i (बाएं) और Fluo-4 बाध्य Ca2 +, [F4Ca]मैं (दाएं) । (ख) और (ग) z-डिस्क, अनुप्रस्थ विमान में आज़ादी से फैलाना सीए2 + और F4Ca की समय चूक स्नैपशॉट दिखाएँ; काले तीर उच्च के क्षेत्रों मार्क [Ca2 +]मैं mitochondrial clustering के कारण; लाल तीर उच्च के क्षेत्रों को चिह्नित [Ca2 +]मैं करीब निकटता में कई RyR समूहों के कारण । (ग) [Ca2 +] के अनुकरणीय लाइन स्कैनमैं (मध्य) [F4Ca]मैं (दाएं) । पंक्ति स्थिति कक्ष क्रॉस-अनुभाग पर बाईं ओर दिखाया गया है । कक्ष क्रॉस-अनुभाग के क्षैतिज आयाम को छवि के क्रॉस-अनुभागों में स्थानिक स्केल के संकेतक के रूप में प्रदान किया गया है । यह आंकड़ा राजगोपाल एट अलसे संशोधित किया गया है । 18 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 9: चयापचयों और mitochondrial झिल्ली की स्थानिक वितरण क्षमता कार्डिएक ऊर्जा चयापचय के स्थानिक अनुकरण से उत्पंन । (एक) µ मीटर की इकाइयों में सेल पार खंड भर में ऑक्सीजन एकाग्रता, (ख) केवल ADP के myofibril भाग में सेल के µ एम. (सी) की इकाइयों में mitochondrial झिल्ली क्षमता का वितरण mitochondrial भर में एकाग्रता एमवी की इकाइयों में नेटवर्क । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 10: आर सांख्यिकी पैकेज पर एक नकली RyR क्लस्टर बिंदु पैटर्न के दृश्य । इस विंडो RyR समूहों सिमुलेशन के समापन पर प्रकट होता है, नकली बिंदु पैटर्न के पहले चित्रण । यह एक संकेत है कि RyR-सिंयुलेटर के रूप में अच्छी तरह से निष्कर्ष निकाला है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और नकली पैटर्न की गुणवत्ता पूछताछ कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| रसायन | मात्रा |
| ०.२ एन एचसीएल | |
| 1 एन एचसीएल | 5 मिलीलीटर |
| आसुत जल | 20 मिलीलीटर |
| ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate बफर स्टॉक | |
| सोडियम cacodylate | ३२.१ g [3H2O] |
| ०.२ एन एचसीएल | 25 मिलीलीटर |
| आसुत जल के साथ 1 एल बनाओ | |
| पीएच ७.४ | |
| ०.३ मीटर सोडियम cacodylate बफर स्टॉक | |
| सोडियम cacodylate | ६४.२ g [3H2O] |
| ०.२ एन एचसीएल | 25 मिलीलीटर |
| आसुत जल के साथ 1 एल बनाओ | |
| पीएच ७.४ | |
| Tyrode समाधान संरचना | |
| Nacl | १३९ एमएम |
| KCl | 3 मिमी |
| CaCl2 | 3 मिमी |
| MgCl2 | 1 मिमी |
| ग्लूकोज | 12 एमएम |
| NaHCO3 | 17 एमएम |
| प्रोबेनेसिड | 1 मिमी |
| Bdm | 20 एमएम |
| NaCl/KCl/NaHCO3 1 L समाधान | |
| NaCl (आण्विक वजन ५८.४४ g/ | ८१.२ छ |
| KCl (आण्विक वजन ७४.५५ g/ | २.२४ छ |
| NaHCO3 (आण्विक वजन ८४.०१ g/ | १४.२८ छ |
| 1 L आसुत जल में भंग | |
| MgCl2/CaCl2 1 L हल | |
| CaCl2 (2H2O) (आण्विक वजन १४७ g/ | १.७६४ छ |
| MgCl2 (6H2O) (२०३.३१ g/ | ०.८१४ छ |
| 1 L आसुत जल में भंग | |
| 1 एम ग्लूकोज २०० एमएल समाधान | |
| डेक्सट्रोज (आण्विक वजन १८०.१६ g/ | ३६.०३ छ |
| २०० मिलीलीटर में भंग डबल आसुत जल | |
| Tyrode सॉल्यूशन ५०० mL सॉल्यूशन | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | ५० एमएल |
| ग्लूकोज | 6 मिलीलीटर |
| डबल आसुत जल | ४०० एमएल |
| 5 मिनट के लिए समाधान में बुलबुला ऑक्सीजन | |
| 2% पीएफए + २.५% Glutaraldehyde + ०.२% टानिक अम्ल निर्धारण में ०.१५ मीटर सोडियम cacodylate | |
| Paraformaldehyde पाउडर (पीएफए) | 2 जी |
| टानिक अम्ल | ०.२ छ |
| आसुत जल | 20 मिलीलीटर |
| २५ टक्के Glutaraldehyde | 10 मिलीलीटर |
| ०.३ एम सोडियम cacodylate | 20 मिलीलीटर |
| ०.१५ एम सोडियम cacodylate | ५० एमएल |
| 1 N NaOH | 4 ग्राम NaOH/100 मिलीलीटर आसुत जल |
| ४% Uranyl एसीटेट शेयर समाधान | |
| Uranyl एसीटेट | 4 जी |
| उबलते डबल आसुत जल के पास | ९६ एमएल |
| एक fumehood में एक सरगर्मी का उपयोग कर निकट-लिंग पानी में UA भंग. | |
| फ़िल्टर एक Whatman #1 फ़िल्टर के माध्यम से प्रकाश संरक्षण के लिए २०० मिलीलीटर भूरे रंग की बोतल में UA | |
| कैप कसकर और लेबल, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
तालिका 1: रिएजेंट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक तैयार करने के लिए मात्रा ।
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Discussion
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल रूपरेखा महत्वपूर्ण कदम cardiomyocyte ultrastructure के एक उपंयास परिमित तत्व ज्यामितीय मॉडल उत्पंन करने के लिए । विधि विभिंन माइक्रोस्कोपी के अभिकलनी संलयन (या, सिद्धांत, अंय डेटा) में सक्षम बनाता है cardiomyocyte गतिशीलता का एक अधिक व्यापक गणना मॉडल है कि स्थानिक सेल वास्तुकला का विवरण शामिल विकसित करने के लिए मोडल । वर्तमान में कोई अंय प्रोटोकॉल के लिए एक cardiomyocyte के इस तरह के एक मॉडल बनाने के लिए उपलब्ध है ।
चरण 1 छिड़काव निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । वैकल्पिक रूप से, दिल, उत्पाद के छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया जा सकता है, और निर्धारण में डूबे । हालांकि, इस प्रक्रिया को जल्दी से किया जाना है और विभिंन परिणाम हो सकता है, नमूनों के आकार पर निर्भर करता है । लेखकों के अनुभव में, छिड़काव ऊतक और कोशिकाओं में निर्धारण की पूरी तरह से घुसपैठ सुनिश्चित करता है । लेखकों ने पहले भी Krebs-Henseliet समाधान के साथ दिल को perfused कर दिया है. यह निर्धारण से पहले काम कर दिल पर माप सक्षम होना चाहिए ।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रसंस्करण कदम 2 में इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए ठेठ हैं । प्रसंस्करण समाधान मात्रा, विशेष रूप से धुंधला समाधान के, और समय अलग हो सकता है जब अंय इमेजिंग तकनीकों जैसे सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या केंद्रित आयन बीम माइक्रोस्कोपी28का उपयोग कर । अधिग्रहीत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों अलग organelle क्षेत्रों में विभाजित किया जाना चाहिए, जैसे mitochondria, myofibrils, और अनुप्रस्थ नलिकाओं. यह मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित फैशन में आयोजित किया जा सकता है । छवि स्टैक में कंट्रास्ट धुंधला प्रोटोकॉल की सफलता पर आंशिक रूप से निर्भर करता है, लेकिन टोमोग्राफी प्रदर्शन करते समय इस कंट्रास्ट से कुछ खो जाता है । यह प्रोटोकॉल विभिंन संरचनाओं को विभाजित करने के लिए मैंयुअल चरणों का वर्णन करता है, हालांकि स्वचालित सेगमेंटेशन29 करने के लिए नई विधियाँ डेटा प्रवाह को बेहतर बनाने के लिए सामांय में अधिक अनुकूल होंगी ।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी dataset में जाँच करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण गुण छवि कंट्रास्ट और संरचना संरक्षण कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में धुंधला नुस्खा और राल एंबेडिंग मिश्रण myofibrils, mitochondria, और हृदय कोशिका के जेड डिस्क के बीच उच्च विपरीत के लिए परिष्कृत किया गया है । उदाहरण के लिए, लेखकों ने पहले sarcoplasmic जालीदार नेटवर्क को demarcate करने के लिए स्टेप १.२ में टैनिंग एसिड के स्थान पर कैल्शियम क्लोराइड का इस्तेमाल किया है । यह organelle विभाजन के दौरान myofibril बंडलों की बाहरी सीमाओं की पहचान करने के साथ मदद की । अतिरिक्त धुंधला रासायनिक घटकों और समय भी झिल्ली संरचनाओं, जैसे sarcoplasmic जालिका या अनुप्रस्थ-अक्षीय नलिकाओं30visualizing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र भी संरचनात्मक क्षरण के लिए जांच की जानी चाहिए । खराब गुणवत्ता निर्धारण या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रोसेसिंग mitochondrial cristae, उखाड़ फेंकना या सूजन mitochondria के उच्च अनुपात, और कोशिका झिल्ली (sarcolemma) के भागों के विघटन के गंभीर नुकसान में परिणाम कर सकते हैं । एक करीब और सावधान परीक्षा भी टी ट्यूबलर और एसआर झिल्ली की हानि दिखा सकते हैं, लेकिन कम अप्रशिक्षित आंख को स्पष्ट कर रहे हैं । इस समस्या के समाधान में शामिल हैं: (i) संपूर्ण छिड़काव सुनिश्चित करना; (२) टिशू को छोटे नमूनों में विच्छेदित करना जो कि निर्धारण और दाग की गहरी पैठ भी सुनिश्चित करता है; (iii) यह सुनिश्चित करना कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रसंस्करण शीत समाधान में किया जाता है या बर्फ पर जहां भी निर्दिष्ट; और (iv) यह सुनिश्चित करना कि धुंधला और निर्जलीकरण (विशेष रूप से निर्जलीकरण) के लिए समय कड़ाई से पालन कर रहे हैं ।
एक ठेठ cardiomyocyte ~ पार धारा व्यास में 20 µm और लंबाई में ~ १०० µm है । यह इमेजिंग पूरे दिल की कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण चुनौती बनाता है । इसके अलावा, दिल के भीतर मांसपेशी फाइबर के बदलते उंमुखीकरण31 आगे एक छवि मात्रा जिसका अक्षों अनुप्रस्थ और ब्याज की एक सेल के अनुदैर्ध्य कुल्हाड़ियों के साथ गठबंधन कर रहे है के अधिग्रहण पेचीदा है । छवि विश्लेषण कार्यक्रम जैसे IMOD एक वांछित अभिविन्यास में डेटा के सिंथेटिक पुनः संरेखण सक्षम करें. सीरियल ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी28 में हाल ही में अग्रिमों और संबंधित छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम29 भी इन समस्याओं को हल करने में मदद । फिर भी, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मोटे वर्गों की सावधान परीक्षा और ब्लॉक के बाद फिर से अभिविन्यास (चरण २.५) इमेजिंग के साथ अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ अक्षों के उचित संरेखण के साथ इमेजिंग कोशिकाओं की संभावना में वृद्धि होगी अक्ष. यह सुनिश्चित करेगा कि कक्ष की अधिकांश मात्रा दृश्य के फ़ील्ड के भीतर कैप्चर की जाएगी ।
प्रोटोकॉल चरण 3, 4 और 5 स्थापित किया जा करने के लिए सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता है । IMOD, आर सांख्यिकी पैकेज, iso2mesh और फिजी (माइक्रोस्कोपी डाटा के लिए ImageJ का एक संस्करण) व्यापक प्रलेखन और कैसे उन का उपयोग करने पर ट्यूटोरियल है । CardiacCellMeshGenerator एक MATLAB अनुप्रयोग है कि एक सरल कार्यप्रवाह में मॉडल बनाने के लिए उपयोगकर्ता के लिए आसान बनाने के लिए विकसित किया गया है । उपयोगकर्ताओं को पूरे स्रोत कोड डाउनलोड कर सकते हैं, और github RyR-सिंयुलेटर भंडार लिंक (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE) से आवेदन पैकेज । आवेदन, CardiacCellMeshGenerator. miappinstall, एक app के रूप में MATLAB में स्थापित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में उत्पंन जाल के लिए आदानों RyR के अंदर पाया जा सकता है-सिंयुलेटर/इनपुट-फ़ाइलें/लक्ष्य-tomo-cell/, जबकि RyR-क्लस्टर सिम्युलेटर के लिए अतिरिक्त जानकारी RyR के अंदर पाया जा सकता है-सिंयुलेटर/इनपुट-फ़ाइलें/मास्टर-सेल/ अनुप्रयोग प्रारंभ करने से पहले, उपयोगकर्ताओं को सुनिश्चित करना चाहिए कि स्थापित iso2mesh फ़ोल्डर और इसके उप फ़ोल्डर्स MATLAB पथ में जोड़ा गया है । इसी प्रकार, यह सुनिश्चित करें कि क्लस्टर सिम्युलेटर के लिए आर-संकुल आवश्यक (सामग्री तालिका) r के भीतर भी स्थापित किया गया है ।
RyR क्लस्टर सिम्युलेटर के लिए आदानों पैदा करते समय एक प्रगति पट्टी अनुप्रयोग में शामिल किया गया है, और RyR घनत्व मैपर का उपयोग कर जाल पर RyR क्लस्टर घनत्व मानचित्रण जब; जाल पीढ़ी कदम निष्कर्ष निकाला है जब अनुप्रयोग जीयूआई में 3 डी जाल प्रदान करेगा. आर उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर RyR क्लस्टर सिमुलेशन को पूरा करने पर, एक ग्राफिकल विंडो दिखाई देगा (चित्र 10), नकली 3d RyR क्लस्टर बिंदु पैटर्न में से एक का चित्रण ।
जीयूआई पर "उत्पन्न मेष" बटन एक tetrahedral मेष उत्पन्न करने के लिए iso2mesh समारोह से चलाता है । मॉडल संकल्प जीयूआई कि अधिकतम tetrahedral तत्व मात्रा और एज लंबाई को समायोजित पर "iso2mesh पैरामीटर" की स्थापना द्वारा समायोजित किया जा सकता है । कार्यक्रम वर्तमान में myofibril क्षेत्र और mitochondria क्षेत्रों को बनाने वाले तत्वों को अलग करता है; इस सुविधा को भविष्य में कक्ष के अंय घटकों को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जाएगा ।
उपयोगकर्ताओं को 3 डी प्रतिपादन मेष और RyR क्लस्टर के इन चरणों का निवारण करने के लिए उपयोग कर सकते हैं । RyR क्लस्टर सिमुलेशन सेटिंग्स, etol और numIter, अंदर सेटिंग्स । R RyR क्लस्टर सिमुलेशन की शुद्धता को प्रभावित; इन दो पैरामीटर निर्धारित करते है जब एक RyR क्लस्टर प्रतिमान सिमुलेशन समाप्त । ये पैरामीटर R विंडो में RyR क्लस्टर्स के वितरण के निरीक्षण पर समायोजित किया जा सकता (चित्र 10) यह सुनिश्चित करने के लिए कि: (i) सभी क्लस्टर z-डिस्क के करीब हैं; और (ii) क्लस्टर्स किसी एक क्षेत्र में एकत्रित करने के बजाय पूरे क्रॉस-सेक्शन में फैले होते हैं । इन दो मापदंडों के लिए सिमुलेशन के एक तदर्थ संवेदनशीलता विश्लेषण etol और numIter का एक उपयुक्त संयोजन का निर्धारण करने के लिए आयोजित किया जा सकता है ।
गोलाकार कर्नेल तीव्रता अनुमानक चरण 5 में एक कर्नेल है, जो ब्याज की मात्रा (इस संदर्भ में 3 डी स्थानिक मॉडल) पर पारित किया है के रूप में चुना व्यास के एक क्षेत्र का उपयोग करता है । ये पैरामीटर चित्रा 5में GUI पर इस चिकनी एल्गोरिथ्म के लिए समायोजित किया जा सकता है: (1) r_sphere गोलाकार कर्नेल चिकनी की त्रिज्या को परिभाषित करता है; (2) hval चलने स्थानिक चरण आकार को परिभाषित करता है जिस पर गोलाकार कर्नेल को वॉल्यूम पर iteratively दिया जाना आवश्यक है ।
स्थानिक घनत्व मापदंडों पर्याप्त हैं कि क्या निर्धारित करने के लिए एक सरल तरीका चित्रा 7में दिखाया गया है के रूप में RyR क्लस्टर घनत्व मूल्यों के वितरण का निरीक्षण करने के लिए है । घनत्व मूल्यों वितरित किया जाना चाहिए ऐसी है कि उच्च घनत्व मूल्यों के पड़ोस सूक्ष्म डेटा में एक RyR क्लस्टर के आकार के लिए एक समान आकार है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल केवल myofibrils, mitochondria, और RyR क्लस्टर्स के यथार्थवादी वितरण शामिल है एक परिमित तत्व मॉडल पैदा करता है । इस चरण के लिए एक विस्तार ECC में एक भूमिका निभाने वाले अन्य आयन-चैनलों के वितरण अनुकरण करने के लिए होगा, जैसे कि होती sarco-endoplasmic जालीदार कैल्शियम पंपों (SERCA2a), सोडियम-कैल्शियम एक्सचेंजर्स (NCX) और sarcolemmal कैल्शियम पंपों. इन एक्सटेंशन के लिए कुंजी इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा से आयन चैनलों के स्थानिक वितरण का एक विश्लेषण है. उदाहरण के लिए, NCX चैनल ०.६७ µm की एक औसत रिक्ति पर टी-ट्यूबलर झिल्ली पर समान रूप से वितरित किया जा मापा गया है, लेकिन RyR क्लस्टर्स के लिए उनके संबंध इतना स्पष्ट नहीं है३२। दूसरी ओर, SERCA2a लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी पहले SR३३चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन SERCA2a के स्थानिक घनत्व साहित्य में रिपोर्ट नहीं किया गया है । इसलिए, इस स्तर पर, टी नलिकाओं पर SR नेटवर्क और NCX पर सेरका 2a का एक समान वितरण सावधानी के साथ ग्रहण किया जा सकता है ।
के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में प्रदर्शन किया, परिणामी परिमित तत्व मेष परिमित तत्व सॉल्वर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है३४ ऐसे कैल्शियम संकेतन18 और जैव ऊर्जा के रूप में प्रतिक्रिया-प्रसार के रूप में27 रासायनिक प्रक्रियाओं अनुकरण करने के लिए प्रक्रियाओं. यह अंत करने के लिए, आयन चैनल जाल टोपोलॉजी के भीतर नोड्स पर प्रतिक्रिया साइटों के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । प्रतिक्रिया साइटों स्रोतों या विभिंन रासायनिक प्रजातियों के डूब के रूप में कार्य करने के लिए सेल के विभिंन डिब्बों में इन आयन चैनलों के माध्यम से रासायनिक प्रजातियों के प्रवाह का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस प्रोटोकॉल से उत्पादन मेष और RyR घनत्व फ़ाइलें किसी भी अंय घालमेल या किसी अंय वातावरण के भीतर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते कि सॉफ्टवेयर इन पाठ फ़ाइलों को पहचानने की सुविधा है । पाठ फ़ाइलों को भी स्क्रिप्ट या तीसरे पक्ष के सॉफ्टवेयर से हेरफेर किया जा सकता है पसंद के वातावरण के इनपुट फ़ाइल स्वरूप आवश्यकताओं को संतुष्ट । कैल्शियम गतिशीलता पर पहला आवेदन केवल कैल्शियम स्ट्रोक के लिए इस मॉडल की उपयोगिता को दर्शाता है, लेकिन इस जाल अब समय तराजू के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है कि संकेत नहीं है. मेष और क्लस्टर घनत्व कई कैल्शियम चक्र अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, homeostasis और स्थिरता के रखरखाव के साथ ही परिमित तत्व सॉल्वर है कि प्रयोग किया जाता है पर निर्भर है ।
एक लंबी अवधि के उद्देश्य के लिए यह आसान cardiomyocytes और अंय प्रकार के कोशिका के संरचनात्मक सटीक परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए बनाने के लिए मॉडल के निर्माण की इस पाइपलाइन में सुधार है । एक स्वचालित विभाजन एल्गोरिथ्म हाल ही में विकसित किया गया है, जो धारावाहिक के लिए लागू किया जा सकता है-ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन cardiomyocytes के माइक्रोस्कोपिक डाटा न्यूनतम उपयोगकर्ता के साथ पूरे सेल में myofibrils और mitochondria वितरण का एक मॉडल बनाने के लिए इनपुट29. इस विधि भविष्य में टी tubule और एसआर झिल्ली नेटवर्क खंड बढ़ाया जाएगा । RyR के एक अधिक सामान्यीकृत संस्करण-सिंयुलेटर एल्गोरिथ्म है कि उपयोगकर्ताओं का विश्लेषण करने के लिए और आयन चैनल और organelles के बीच सह स्थानों अनुकरण, साथ ही साथ विभिंन आयन-चैनल प्रकार के बीच, एक उच्च प्रवाह फैशन में भी विकास के अधीन है सक्षम हो जाएगा । सेल के एक पूर्ण मॉडल के निर्माण के लिए एक निर्बाध प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों सेल संरचना और सेल समारोह के बीच संबंध पर मॉडल आधारित परिकल्पना परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए सक्षम हो जाएगा अधिक नियमित रूप से प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ वर्तमान में संभव है अकेले.
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
यह काम न्यूजीलैंड के रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया मारसडेन डेवीड फास्ट स्टार्ट ग्रांट 11-UOA-१८४, द ह्यूमन फ्रंटियर्स साइंस प्रोग्राम रिसर्च ग्रांट RGP0027 2013 और ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट DP170101358 ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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