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Bioengineering

Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas

Published: April 18, 2018 doi: 10.3791/56817

Summary

Este protocolo describe un método novedoso para crear un modelo de elementos finitos espacial detallada de la arquitectura intracelular de cardiomiocitos de imágenes de microscopía confocal y microscopia electrónica. La potencia de este modelo espacial detallada se demuestra mediante estudios de caso en la señalización de calcio y bioenergética.

Abstract

Con la llegada de tres dimensiones (3D) tecnologías imagenológicas como la tomografía de electrones, cara de serie bloque de análisis de microscopía electrónica y microscopía confocal, la comunidad científica tiene acceso sin precedentes a grandes conjuntos de datos en secundario-micrómetro resolución que caracterizan la remodelación arquitectónica acompaña a cambios en la función de cardiomiocitos en salud y enfermedad. Sin embargo, estos conjuntos de datos han sido utilizados para investigar el papel de la arquitectura celular remodelación en función de los cardiomiocitos. El propósito de este protocolo es describir cómo crear un modelo de elementos finitos precisa de un cardiomiocito mediante microscopia electrónica de alta resolución e imágenes de microscopía confocal. Un modelo detallado y preciso de la arquitectura celular tiene gran potencial para proporcionar nuevas penetraciones en la biología de cardiomiocitos, más experimentos solo pueden reunir. El poder de este método radica en su capacidad de cómputo fusionar información de dos modalidades de imágenes dispares de ultraestructura de cardiomiocitos para desarrollar un modelo unificado y detallado de los cardiomiocitos. Este protocolo describe los pasos para integrar la tomografía electrónica e imágenes de microscopía confocal de cardiomiocitos de rata Wistar (nombre de una raza específica de rata albina) macho adulto para desarrollar un modelo de elementos finitos medio sarcómero de los cardiomiocitos. El procedimiento genera un modelo de elementos finitos 3D que contiene una descripción exacta, alta resolución (orden del día de ~ 35 nm) de la distribución de las mitocondrias, miofibrillas y los grupos de receptores de rianodina que liberan el calcio necesario para el cardiomiocito contracción de la red reticular sarcoplásmica (SR) en el compartimiento cytosolic y miofibrillas. El modelo generado aquí una ilustración no incorpora detalles de la arquitectura del túbulo transversal o la sarcoplásmica, reticular, red y por lo tanto es un modelo mínimo de los cardiomiocitos. Sin embargo, el modelo ya puede ser aplicado en investigaciones basadas en simulación en el papel de la estructura de la célula en bioenergética mitocondrial y señalización calcio, que es ilustrado y discutido usando dos estudios de caso que se presentan después de la Protocolo detallado.

Introduction

Acoplamiento excitación-contracción (ECC) en el corazón se refiere a la importante e intrincado acoplamiento entre la excitación eléctrica de la membrana del cardiomiocito y la posterior contracción mecánica de la célula durante cada latido. Modelos matemáticos han desempeñado un papel clave en el desarrollo de una comprensión cuantitativa de los procesos bioquímicos vinculados entre sí que regulan el potencial de acción1,2,3de bioenergética, de señalización de calcio citosólico y la posterior generación de la fuerza contráctil. Tales modelos han predicho con éxito los cambios en el latido del corazón cuando uno o varios de estos procesos bioquímicos se someten a alteraciones4,5. La ultraestructura altamente organizada de los cardiomiocitos se ha reconocido cada vez más a desempeñar un papel crítico en la función contráctil normal de la célula y el corazón entero. De hecho, cambios en la morfología y organización de los componentes de la ultraestructura cardiaca se producen en paralelo a los cambios bioquímicos en condiciones de enfermedad tales como hipertrofia6,7de insuficiencia cardíaca y miocardiopatía diabética8. Si estos cambios estructurales son menores, adaptativas o patológicas las respuestas a las cambiantes condiciones bioquímicas sigue siendo en gran parte desconocido9. El acoplamiento inherentemente estrecha entre forma y función en biología significa que estudios experimentales solo no pueden proporcionar penetraciones más profundas que las correlaciones entre la función de cardiomiocitos y remodelación estructural. Una nueva generación de modelos matemáticos que pueden incorporar el montaje estructural de los componentes del celulares, junto con los procesos bioquímicos estudiados, son necesarias para desarrollar una comprensión integral, cuantitativa de la relación entre la estructura, bioquímica y fuerza contráctil en los cardiomiocitos. Este protocolo describe métodos que pueden utilizarse para generar modelos de elementos finitos estructural precisa de cardiomiocitos que pueden ser utilizado para tales investigaciones.

La última década ha visto avances en microscopia electrónica 3D10, confocal11y súper resolución microscopia12 que proporcionar penetraciones sin precedentes, de alta resolución en la Asamblea de la nano-escala y microempresas de la componentes subcelular de los cardiomiocitos. Recientemente, estos conjuntos de datos se han utilizado para generar modelos computacionales de cardiomiocitos ultraestructura13,14,15,16. Estos modelos utilizan un método bien establecido de simulación ingeniería, llamado el método de elementos finitos17, para crear elementos finitos mallas computacionales sobre que procesos bioquímicos y cardiomiocitos pueden simular las contracciones. Sin embargo, estos modelos están limitados por la resolución y el detalle que puede proporcionar un método de microscopia en un conjunto de datos de imagen. Por ejemplo, la microscopia electrónica puede generar nanómetro-nivel detalle de estructura de la célula, pero es difícil identificar proteínas específicas dentro de la imagen que sería necesario crear un modelo. Por otro lado, el microscopio óptico de superresolución puede proporcionar imágenes de alto contraste con resoluciones del orden de 50 nm de sólo un selecto pocos molecular componentes de la célula. Sólo mediante la integración de información complementaria de estas modalidades de imágenes puede uno realista explorar la sensibilidad de la función a los cambios en la estructura. Correlativa luz y microscopia electrónica todavía no es un procedimiento de rutina y aún sufriría la limitación de que sólo un número limitado de componentes podría manchado en la vista de inmunofluorescencia y correlacionado con el punto de vista de la microscopia electrónica.

Este protocolo presenta un enfoque novedoso18 que usa métodos estadísticos19 para analizar y cómputo fusionar información de microscopía de luz en la distribución espacial de los canales iónicos con microscopia electrónica información en otros cardiaca componentes de la ultraestructura, como las miofibrillas y mitocondrias. Esto produce un modelo de elementos finitos que se puede utilizar con modelos biofísicos de los procesos bioquímicos para estudiar el papel de la organización celular de cardiomiocitos en los procesos bioquímicos que regulan la contracción de cardiomiocitos. Por ejemplo, este protocolo podría ser utilizado para crear modelos de salud y8modelos de miocitos cardiacos diabetes inducida para estudiar el efecto de remodelación estructural en función de la célula cardíaca que se observa en animales diabéticos. Una ventaja adicional de la naturaleza estadística del método presentado se ilustra también en el protocolo: el método puede generar varias instancias de geometrías de elementos finitos que mímico de cerca las variaciones observadas experimentalmente en la estructura de la célula.

Como un resumen, los pasos del protocolo incluyen: (i) preparación de tejido cardíaco para microscopia electrónica para generar imágenes 3D con suficiente resolución y contraste; (ii) reconstrucción y segmentación de las pilas de imágenes en 3D de datos de microscopia electrónica usando una reconstrucción 3D de microscopia electrónica y software de análisis de imagen llaman IMOD20; (iii) utilizar iso2mesh21 para generar una malla de elementos finitos usando los datos segmentados como entrada; (iv) utilizando el algoritmo de novela y códigos para la distribución de los canales iónicos en la malla de elementos finitos.

La premisa del enfoque a cada paso se describe en el protocolo y resultados representativos se encuentran en las figuras que lo acompaña. Un resumen se describe especificando cómo los modelos espacial detallados generados se pueden utilizar para estudiar la dinámica espacial de calcio durante la ECC como bioenergética mitocondrial. Algunas de las limitaciones actuales del Protocolo se discuten, así como nuevos desarrollos que se están realizando para superarlas y avanzar a una comprensión cuantitativa de la función de la estructura de la célula a la biología de sistemas cardiaco. También se aborda cómo estos métodos se podrían generalizar para crear modelos de elementos finitos de otros tipos de células.

Los usuarios de este protocolo pueden omitir paso 1 y la parte de la reconstrucción del paso 2 si tienen acceso a un montón de imagen de microscopia electrónica existente. Usuarios que deseen adquirir sus datos en colaboración con microscopistas electrón más experimentados deseen discutir y comparar la fijación y los procedimientos de tinción en el paso 1 con el experto para determinar un protocolo óptimo para la adquisición.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad de Auckland Animal Comité de ética y el Comité de uso, donde originalmente se desarrolló el protocolo de tejido y cuidado de animales institucional de la Universidad de California San Diego.

1. experimental Preparación

  1. Preparar soluciones de sodio 0.15 M y 0,3 M amortiguadores cacodilato a pH 7.4 según tabla 1.
  2. Preparar fijador de glutaraldehido (2% paraformaldehido (PFA) + glutaraldehído 2.5% + 0.2% ácido tánico en buffer de cacodilato de sodio de 0.15 M a pH 7.4) usando componentes listados en la tabla 1.
    1. Disolver 2 g de polvo de la PFA en 20 mL de agua destilada a 60 º C sobre una placa calefactora con agitación constante.
    2. Agregar solución de NaOH de 1 M hasta que la solución es clara.
    3. Espere hasta que la temperatura de la solución está por debajo de 40 ° C, luego añadir 10 mL de glutaraldehído y 20 mL de cacodilato de sodio de 0.3 M.
    4. Añadir 0,2 g de ácido tánico y disolver en la solución.
    5. Añadir 50 mL de cacodilato de sodio de 0,15 M.
    6. Guardar tres o cuatro viales de centelleo de 20 mL de fijador en nevera a 4 ° C o en hielo si se utiliza el mismo día.
  3. Preparar solución de Tyrode con 20 mM 2, 3-butanedione monoxima (BDM), según la receta en la tabla 1.
  4. Construir un aparato Langendorff dentro de un armario del humo.
    1. Abrazadera de dos tubos de jeringa de plástico de 100 mL a dos soportes diferentes réplica, aproximadamente 70 cm de altura desde la base de soporte.
    2. Conecte los tubos de jeringa de plástico y un tubo conector usando 3 mm diámetro interior tubería y una llave de tres vías como se muestra en la figura 1.
    3. Colocar una cánula de diámetro externo de 3 mm en la parte inferior del conector de la tubería, donde el corazón se va atado para la fijación de la perfusión.
  5. Llenar los tubos de jeringa con solución de Tyrode y fijadores soluciones a 37 ° C.
    1. Eliminar burbujas de aire dentro de la tubería pasando las soluciones de la jeringa a través de ellos.

2. adquirir datos de microscopia electrónica de la ultraestructura de cardiomiocitos

  1. Preparar el animal para la supresión y la fijación química del corazón.
    Nota: Este protocolo detalla los pasos para procesar adulto tejido cardiaco masculino del rata de Wistar (nombre de una raza específica de rata albina). El protocolo puede requerir modificaciones del tejido cardíaco se obtiene de otras especies.
    1. Anestesiar el animal por el tratamiento de la rata (200-250 g de peso corporal) con 0,5 mL de 250 heparina U/mL mediante inyección intraperitoneal. Espere 10 minutos, y luego la rata con la inyección intraperitoneal de pentobarbital (210 mg/kg de peso corporal).
    2. Prueba el reflejo del pellizco del dedo del pie para confirmar un grado adecuado de anestesia.
    3. Eutanasia a los animales por dislocación cervical.
    4. Cosecha el corazón mediante los procedimientos de disección similares a artículos previamente publicados de JoVE22,23, luego colocarlo en solución salina helada.
    5. Aislar la aorta ascendente y la canule. Asegúrese de que la punta de la cánula se encuentra justo por encima de la la válvula semilunar, donde las arterias coronarias se ramifican. Ate un hilo alrededor de la aorta ascendente.
    6. Conectar la cánula al aparato de Langendorff impulsado por gravedad a ~ 70 cm sobre la base del sistema (figura 1).
    7. Gire la llave de paso en el sistema de Langendorff a inundar el corazón con solución de Tyrode, incluyendo 20 mM BDM (un inhibidor de la miosina) durante 2-3 minutos.
    8. Gire la llave de paso para iniciar la perfusión con fijador de 2% paraformaldehído, glutaraldehído al 2.5% y 0,2% ácido tánico en cacodilato de sodio de 0.15 M a 37 ° C durante 10 minutos. Si tiene éxito, el corazón marrón claro y ser dura y gomosa.
    9. Usando una cuchilla de afeitar, disecar bloques de tejido de la pared libre (lateral) ventricular izquierda y obtener tejido bloquea aproximadamente 1 mm3 de tamaño.
    10. Guarde las muestras en viales de centelleo 20 mL previamente enfriado el mismo fijador en el hielo para 2 h. almacenan tantas muestras como sea posible en los frascos y aseguran que las muestras son sumergidas en la solución.
      PRECAUCIÓN: Es importante mantener las muestras frías hasta después del paso de deshidratación 100% abajo.
  2. Más fijación y tinción de muestras para microscopía electrónica.
    1. Vierta 100 mL de buffer de cacodilato de sodio de 0.15 M en un vaso de vidrio y enfriar sobre hielo.
    2. Preparar volúmenes iguales de 4% el tetróxido de osmio y 0,3 M cacodilato de sodio, seguido por la adición de 0,08 g de ferrocianuro de potasio para hacer una solución de tinción de metal pesado que contiene ferrocianuro de potasio 2% en 2% el tetróxido de osmio y 0.15 M cacodilato de sodio. Enfríe la solución en el hielo.
    3. Pipeta el fijador hacia fuera y reemplazarlo con suficiente frío tampón de cacodilato de sodio de 0.15 M para sumergir las muestras en los frascos. Colocar los viales en hielo durante 5 minutos.
    4. Repita el paso 2.2.3 cuatro veces más con cacodilato de sodio de 0.15 M para quitar exceso fijador.
      PRECAUCIÓN: No utilice pipetas de vidrio debido a pequeños fragmentos pueden entrar en la muestra y pueden arruinar cuchillas de diamante durante el bloque de seccionamiento de tejidos. Es importante para pre-enfriar todas las soluciones en el hielo antes de agregar a la muestra. También es importante que la muestra sigue siendo cubierta por la solución de todos los tiempos (muy breves períodos de cobertura parcial que dura no más de unos pocos segundos pueden ser brevemente toleradas durante intercambios de solución). Al lavar o reemplazar soluciones, añadir la nueva solución rápidamente después de retirar la solución anterior. Mantener los viales de centelleo en el hielo entre lavados. Tenga en cuenta que este paso no es tiempo sensible, los bloques de tejido se pueden lavar un poco más largos, si es necesario.
    5. Reemplazar amortiguador de cacodilato de sodio con metal pesado helada mancha solución y almacenar en hielo durante la noche. Asegurar que el ferrocianuro está bien mezclado agitando el frasco con la mano; la solución debe da vuelta a negra.
      PRECAUCIÓN: El trabajo en la campana extractora al realizar este paso porque el osmio es tóxico.
    6. Diluir solución stock 4% acuosa uranilo acetato (UA) (tabla 1) 2% utilizando volúmenes iguales de material solución UA y agua bidestilada y enfriarse en el hielo.
    7. Reemplazar metales pesados mancha con amortiguador de cacodilato de sodio de 0.15 M enfriado con hielo y dejar la muestra Incubar durante 5 minutos en hielo.
    8. Repita el paso 2.2.7 cuatro veces más hielo para enjuagar cualquier solución de tinción de exceso del metal pesado.
    9. Enjuagar las muestras cuatro veces, con un período de espera de 2 minutos en el medio en agua purificada (destilada doble es suficiente).
    10. Agua purificada con helada 2% UA y deje que la muestra de incuban por 60-120 min en hielo.
    11. Enfriar cinco viales de centelleo de 20 mL de etanol (lo suficiente para sumergir las muestras) en el hielo que se utilizará en el paso de deshidratación. Los seis frascos tienen crecientes porcentajes de etanol en agua destilada: 20%, 50%, 70%, 90% y 100%.
    12. Vierte acetona pura en otro vial de centelleo de 20 mL y enfriar en hielo junto con los frascos de etanol.
    13. Enjuagar las muestras en agua purificada cuatro veces con períodos de espera de 2 minutos en el hielo para lavar exceso UA.
  3. Deshidratar muestras en etanol.
    1. Deshidrate en etanol frío serie sustituyendo sucesivamente solución en el frasco de la muestra como sigue, en el hielo: 20% de etanol durante 10 minutos; etanol al 50% durante 10 minutos; etanol al 70% durante 10 minutos; etanol al 90% durante 10 minutos; a continuación, dos veces en etanol 100% durante 10 minutos.
    2. Muestra a la temperatura de transición sustituyendo el etanol 100% final con acetona pura refrescado y coloque el frasco de la muestra en un banco de laboratorio de temperatura durante 10 minutos.
    3. Realizar un lavado más de 10 min en acetona pura a temperatura ambiente para eliminar la condensación que es observable dentro de los frascos. Durante la incubación, son las soluciones de acetona/resina.
    4. Sustituir la acetona pura en los frascos con 50: 50 resina pura acetona y epoxy (con proporciones de componentes de resina epoxi según lo indicado por el fabricante). Utilizar todos los componentes de un mismo lote. Dejar los frascos de muestra lleno de resina durante la noche en un rotor.
  4. Incrustar las muestras en resina.
    1. Reemplazar la resina de 50: 50 con la resina de 75% (25% acetona) e incubar durante 3 h, seguido por la posterior incubación/infiltración en resina 100% durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Vuelva a colocar la resina 100% con resina 100% fresco y dejar los frascos de muestra durante la noche para una penetración más profunda de la resina en las muestras de tejido.
    3. Tomar muestras de los frascos y colocarlos en recipientes que son respetuosos del horno y tienen una base plana; aluminio o papel de plata para horno puede usarse para este propósito, por ejemplo.
    4. Verter suavemente (para evitar el desplazamiento de las muestras) dulce resina sobre las muestras (así incorporar las muestras en resina) y polimerizar la resina y las muestras en un horno a 60 ° C durante 48 h.
  5. Volver a orientar bloques de resina a las celdas de imagen de corte transversal.
    1. Obtener 1 μm las secciones de la prueba de espesor de los bloques de resina utilizando un ultramicrótomo con un cuchillo de vidrio para evaluar células orientación24.
    2. Mancha de las secciones de prueba gruesa de 20 s con 1% tolueno azul y 1% de bórax.
    3. Examinar la orientación de la célula de músculo bajo un microscopio de campo brillante.
    4. Basado en la orientación que se infiere de las imágenes de las secciones de la prueba de manchado, reorientar longitudinalmente u oblicuamente orientados (similar a la figura 2A) bloques para asegurar que las células se exponen a la cuchilla de vidrio por lo que cortaron en sección transversal (la resina similar a la figura 2B).
  6. Imagen las secciones de tejido usando la tomografía de electrones.
    1. Obtener secciones semi-delgadas (~ 300 nm) del tejido reorientarse bloques usando un diamante cuchillo y transferir las secciones sobre rejillas de cobre25.
    2. Mancha de las secciones de espesor con 2% UA y Sato plomo25.
    3. Partículas de oro coloidal se aplican a ambos lados de las secciones25.
    4. Obtener sistemas de inclinación única o de doble eje serie de imágenes proyectadas de-70 ° a + 70 °25.
  7. Utiliza IMOD20 para reconstruir la pila de imagen 3D (una serie de imágenes 2D que proporcionan la información 3D de una sección de tomografía electrónica única) de la célula. Esta pila reconstruida será segmentada en el paso siguiente.

3. segmento de miofibrillas y mitocondrias regiones del conjunto de datos de imagen en 3D de EM

  1. Ejecutar el programa IMOD "3dmod".
  2. Dentro de la interfaz gráfica de usuario de 3dmod, escriba la dirección de la ".rec" o ".mrc" archivo que contiene el 3D reconstruido dataset de la imagen de la célula (generada en el paso 2.7) en la casilla de entrada "archivos de la imagen:", pulse "OK".
  3. En el menú "Archivo", seleccione nuevo modelo y, a continuación, guarde el archivo con un nombre apropiado usando "Guardar modelo como"... en "Archivo" del menú.
    Nota: Un objeto en IMOD puede contener una colección de componentes segmentados que constituyen el "objeto". De forma predeterminada, un nuevo modelo contiene un nuevo objeto con el id "#1".
  4. En el menú "Especial", seleccione "Herramientas de dibujo". Se abrirá una nueva barra de herramientas similar a la que se muestra en la Figura 3A.
    Nota: Hay varias herramientas que pueden utilizarse para crear contornos alrededor de los límites de diferentes organelas. Más ayuda sobre cómo utilizar estas herramientas puede encontrarse en la documentación de20 IMOD.
  5. Elige la opción de "Esculpir" en el menú de "Herramientas de dibujo" y mueva el ratón sobre la ventana de imagen; aparecerá un contorno circular centrado en el puntero del ratón.
  6. Pulsando el botón central del ratón sobre una mitocondria (las regiones más oscuras de los archivos de imagen, como se ilustra por las demarcaciones con líneas de contorno verdes en la Figura 3A), arrastre el perímetro del contorno de círculo en la forma de su límite.
  7. Una vez contorneado de la frontera de la mitocondria, suelte el botón del medio y repita los pasos 3.6 por cada mitocondria en los datos. Cada contorno será reconocido automáticamente por IMOD como un nuevo contorno dentro del objeto mismo.
  8. Bajo la "edición | Objeto "menú, seleccione"Nuevo"para crear un nuevo objeto. Automáticamente se incremente el número total de objetos en uno y asignar a este número al nuevo objeto.
  9. Repita los pasos 3.6 y 3.7 segmento y contornos de la miofibrilla.
  10. Repita el paso 3,8, seguido del paso 3.6, para segmentar el límite de la célula, así.
  11. Guarde el archivo de modelo en el menú "Archivo".
  12. Ejecutar los siguientes comandos en una ventana de línea de comandos para convertir cada objeto de agrupación en una máscara binaria como se ilustra en la figura 4A-c.
    1. Extraer un objeto específico de la modelo "imodextract objeto modelfile outputmodelfile" donde el "objeto" es el número del objeto se extrae.
    2. Crear una máscara para ese objeto: imodmop-máscara 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Convertir el archivo en una pila de tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. crear una malla de elementos finitos de componentes segmentados

  1. Iso2mesh es un programa MATLAB libremente disponible para convertir pilas de imagen TIFF en mallas de elementos finitos tetraédricos volumétrica. Descargar y añadir el path MATLAB iso2mesh de iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Descargar el código fuente y los datos para simular racimos de RyR en la malla de los github sitio web https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Inicie la aplicación CardiacCellMeshGenerator MATLAB (figura 5).
  4. Cargar las máscaras de componentes de diferentes organelas en MATLAB mediante los tres botones en la parte superior izquierda de la interfaz gráfica.
  5. Crear a otra pila de imagen binaria que demarca las diferencias entre las miofibrillas y mitocondrias como se muestra en la figura 6A.
    1. Abra el ImageJ.
    2. Utilizando el archivo | Abrir cuadro de diálogo, cargar las pilas de tiff de miofibrillas y mitocondrias en el programa.
    3. Iniciar el plugin de además de la imagen seleccionando "proceso | Calculator Plus ".
    4. Seleccionar la pila de la imagen de miofibrilla como i1, la mitocondria pila como i2 de la imagen y elegir el operador "Agregar". Haga clic en "Aceptar".
    5. Después de una nueva pila de imagen que representa el resultado de 4.5.4 aparece, seleccione "editar | Invertir"para producir una pila de imagen similar a la figura 6A.
  6. Cargue el archivo que contiene la pila de la imagen binaria de las brechas entre las miofibrillas y mitocondrias pulsando el botón de "RyRGapsFile" en el programa de CardiacCellMeshGenerator.
  7. Presione "Generar malla" en la interfaz gráfica de usuario. Esto activará el iso2mesh comando v2m con la opción 'cgalmesh' para generar una malla tetraédrica similar a la figura 4E. Tres archivos se encontrarán al final de este paso: un archivo .ele, un archivo .face y un archivo de .node que contendrá el listado de nodos que componen los elementos, los nodos que conforman las caras y las coordenadas de los nodos , respectivamente.

5. matemáticamente del mapa la densidad espacial variable de canales del Ion de interés sobre la malla de elementos finitos.

  1. Generar los insumos necesarios para el simulador de RyR pulsando el botón etiquetado entradas generar RyR-simulador de la interfaz gráfica.
    Nota: El botón activará una función generateRyRsimulatorInputs.m, que utiliza la información siguiente en el paso 4 para generar las entradas:
    (1) outDir: la ubicación para archivos de salida que son necesarios para la simulación de cluster de RyR.
    (2) imres: la resolución de píxeles en las tres direcciones de las pilas de imágenes.
    (3) myofibril_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la Figura 4B.
    (4) sarcolemma_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la Figura 4A.
    (5) ryrgaps_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la figura 5A.
    1. Después de esta función se ejecuta, compruebe que los siguientes archivos se han creado dentro del directorio especificado como el camino outDir:
    • d_axial_micron.txt, que representa la distancia axial entre la posición de los discos z y el resto de los píxeles en la pila de la imagen.
    • d_radial_micron.txt, que representa la distancia euclidiana (excluyendo el componente axial) de cada píxel en el conjunto de posibles ubicaciones de cluster de RyR a los píxeles en el plano z-disco.
    • W_micron.txt, que representa la lista de coordenadas espaciales de todos los puestos disponibles para grupos de RyR para estar presente.
    • Los restantes 3 archivos en la carpeta contienen el sufijo "_pixel" en lugar de "_micron" para denotar que los valores dentro de estos archivos han sido escritos en forma de coordenadas de píxel.
  2. Simulación de distribuciones de cluster de RyR en la pila de la imagen binaria de las miofibrillas.
    1. Presione el botón etiquetado "Abierto de RyR-simulador en R" para iniciar el programa de R.
    2. En la R-gui, seleccione "archivo | Open"y buscar el archivo"settings. R"dentro del paquete de RyR-Simulator (RyR-simulador/fuente/settings. R).
    3. También abrir el archivo ryr-simulador-paralelo. R (ubicado en RyR-simulador/fuente/ryr-simulador-paralelo. R). entornos como Rstudio (https://www.rstudio.com) o una interfaz de línea de comando simple se puede utilizar, por ejemplo, el comando R64 en una ventana de comandos o shell.
    4. Cambiar los parámetros de configuración. R archivo tal como se detalla a continuación:
      1. Ruta2 conjunto a la dirección de la carpeta que contiene archivos que se enumeran en 5.1.2 para una pila experimental adquirido imagen confocal de racimos de RyR y miofibrillas.
        Nota: El github repositorio carpeta entrada-archivos/master-célula ya contiene archivos que se generaron de una pila de imagen previamente recogidos.
      2. Establecer Path4 a una dirección de la carpeta donde se almacenan los archivos que se generaron en el paso 5.1.2.
      3. Establecer punto de Path3 a una carpeta donde el usuario desea las ubicaciones de cluster de RyR simuladas para salvarse.
      4. Conjunto de N al número de racimos de RyR a simular en el modelo (típicamente en el rango de 200 a 300).
      5. Etol Set, una tolerancia de ajuste, la diferencia entre la distribución espacial experimental medida de RyR racimos y la distribución espacial del modelo simulado de racimos de RyR.
      6. Set numIter para limitar el número de intentos que el simulador de RyR debe adoptar para encontrar un patrón de cluster de RyR simulado que satisface el valor etol.
        Nota: Establecer valores para etol y numIter a los valores típicos en la configuración. Archivo de la R.
      7. Conjunto numPatterns al número de diversos patrones de cluster de RyR que se quiere simular (por lo general, es útil practicar simulando 99 patrones de confianza estadística).
      8. NumCores para habilitar el uso de varios hilos de CPU (cores) más rápido en paralelo con R para simular los patrones de punto de ajuste.
    5. Compruebe que los siguientes paquetes se instalan mediante el instalador del paquete gui en nieve R:, doSNOW, doparallel, foreach, iteradores y rgl.
    6. Ejecutar el simulador introduciendo el siguiente comando en la ventana de comandos de R: fuente (' camino a ryr-simulador-paralelo. R', chdir = TRUE)
      Nota: La salida del programa RyR-Simulator es una lista de archivos .txt (se generará un archivo numPatterns) que contienen listas de coordenadas de filas de N y simularon de 3 columnas, que representan la x, y y coordenadas z de los N clusters de RyR.
  3. Mapa puntos como densidades espaciales en un modelo computacional utilizando el CardiacCellMeshGenerator.
    1. Seleccionando el botón etiquetado "Seleccionar archivo de RyR puntos", elija un archivo de texto simulado de RyR cluster distribución de los que tenían salida por el simulador de RyR.
    2. Ejecutar a "RyR densidad Mapper" en la GUI de MATLAB. Este mapa de la ubicación espacial de los grupos de RyR simulados en el archivo .txt en paso 5.3.1 sobre la malla de elementos finitos que se generó en el paso 4.8 utilizando un método llamado un núcleo esférico intensidad estimador método26.
      Nota: La salida de este paso es un archivo con extensión .txt que contiene una lista de valores para la densidad numérica del canal de ion por unidad de volumen esférico en cada uno de los nodos de la malla computacional.

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Representative Results

Figura 2 a figura 7 proporcionar resultados representativos de varios pasos claves en este protocolo: (i) visualizar y reorientación de los bloques de tejido para microscopía electrónica transversal vistas; (ii) generar una pila de imágenes de microscopia electrónica 3D; (iii) segmentación de ultraestructura celular para organelos de interés; (iv) generación de una malla de elementos finitos utilizando iso2mesh; (v) simulando una distribución realista de RyR racimos de la malla; (vi) seguido de mapeo esta distribución espacial como una densidad espacial sobre la malla computacional.

Figura 2 muestra las imágenes de campo brillante típico que muestran cómo las células aparecen cuando orientadas longitudinalmente (figura 2A, con L), oblicua (figura 2A, etiquetados O) y aconsejarse (figura 2B) con respecto a la plano de corte. Oblicuas y longitudinal orientadas muestras exhiben estrías, mientras que aconsejarse orientado las muestras no presentan estriaciones. Los capilares también aparecen más circulares en vistas de sección de vistas oblicuas.

Figura 3A muestra una imagen representativa de una pila de tomografía de buena calidad que puede ser adquirida cuando se sigue el protocolo de preparación de tejido en el paso 1. Debe tener cuidado al realizar reconstrucción 3D de la serie de inclinación de imagen de microscopio. Seguimiento incorrecto de partículas de oro coloidal, o la falta de suficientes partículas de oro puede afectar la calidad, enfoque de imagen y contraste de la imagen, de la tomografía de tórax considerablemente. Esto afecta la capacidad para segmentar diferentes estructuras significativamente. Cuidado y experiencia son necesarias para garantizar que los bloques de tejido se tiñen lo suficiente y que hay una distribución uniforme de partículas de oro coloidal a través del volumen de tejido. En caso de duda, puede ser útil consultar con un especialista en laboratorio o instalaciones de la institución local. Generación del modelo se intenta con bajo contraste o reconstruida incorrectamente los datos, todavía se pueden generar modelos aunque la correspondencia de modelado resultados con las propiedades de los sistemas biológicos a simular puede ser pobre. Figura 3B muestra una imagen representativa de lo que parece un modelo segmentado de miofibrillas y mitocondrias.

Figura 4E muestra una representación 3D de la malla tetraédrica, que es producida por iso2mesh. Como las tareas originales de pila y segmentación de imágenes son de buena calidad, este paso es bastante robusto. Figura 6B y la figura 6 muestran una distribución típica de clúster de RyR (en rojo) dentro de la topología celular 3D. En esta etapa, el acoplamiento sí mismo no es la entrada en el simulador de RyR. Una pila de imágenes de la frontera de la célula y las brechas entre las miofibrillas y mitocondrias, generados a partir de las imágenes segmentadas en la figura 4 — constituyen los principales insumos en el simulador de RyR. Debe tener cuidado a los límites de las miofibrillas y mitocondrias del segmento con la mayor precisión posible; segmentaciones inexactas daría lugar a una representación inexacta de la topología de la célula en los datos, que en consecuencia afectará a RyR colocación dentro de la malla. Entonces, esto afectaría la dinámica espacio-temporal de calcio en los cardiomiocitos (1 aplicación).

La figura 7 muestra 3 casos de clusters de RyR simulados en la misma malla topología después de usar el algoritmo de estimador de intensidad de núcleo esférico. Tenga en cuenta la variación en la organización de los grupos de RyR. Estas variaciones han sido medidas para estar dentro de la variabilidad en los datos experimentales18. Debe tenerse cuidado en elegir el radio de la esfera de núcleo y el tamaño de paso que el núcleo de muestras de la densidad de cluster de RyR. Estos dos factores afectan cómo agudamente o difusamente una representación de la densidad de agrupaciones de RyR se pueden representarse en la malla. Un análisis del efecto de diferentes valores de estos parámetros que ayudan a reducir en las opciones del parámetro para una malla razonable.

La malla resultante de racimos de RyR, miofibrillas y mitocondrias es un modelo mínimo de la estructura de cardiomiocitos. Esta malla se ha aplicado, así como variaciones de lo que fueron derivadas de otros datos de la estructura celular, para el estudio de la bioenergética y dinámica de calcio. Un resumen de estas dos aplicaciones se describe a continuación para ilustrar el poder de modelización de elementos finitos de la estructura de la célula en dar ideas sobre las relaciones estructura-función.

Aplicación 1 18 : Dinámica espacio-temporal de calcio libera en cardiomiocitos. Este modelo se ha utilizado para examinar el papel de la heterogénea distribución de clusters de RyR, miofibrillas y mitocondrias en la señalización de calcio. La figura 8 muestra la dinámica espacio-temporal de calcio citosólico durante la fase creciente de la transitoria cuando simulados en la topología de malla generada a partir de este protocolo. Figura 8B muestra la heterogénea calcio libre y concentración del fluoróforo-limite-calcio con el tiempo. Las flechas señalan a pequeños puntos de calcio alta debido a una mayor densidad de RyR racimos o mitocondrias en esas regiones. Figura 8 muestra imágenes simuladas de barrido de línea que se pueden comparar a las imágenes de barrido de línea experimental de la dinámica de calcio que normalmente se recoge mediante microscopía confocal en. El modelo de simulación proporciona una mucho mayor resolución vista de la heterogeneidad espacial de calcio que una imagen adquirida experimentalmente. Además, debido al modelo se derivan de datos de microscopia estructural, el número de clústeres que debe permanecer inactivo (~ 4-6) después de activación eléctrica de heterogeneidades que se producen en la imagen confocal de barrido de línea podría ser determinada exacto. Heterogeneidades similares se observan en imágenes de barrido de línea adquiridos experimentalmente de la dinámica del calcio en modelos animales de insuficiencia cardiaca18

Aplicación 2 27 : Dinámica espacio-temporal de la bioenergética mitocondrial en cardiomiocitos. El objetivo general de este trabajo es estudiar la relación entre la dinámica de calcio, bioenergética mitocondrial y contracción muscular. Como primer paso, se han realizado simulaciones de la fosforilación oxidativa mitocondrial en aislamiento dentro de los cardiomiocitos. Como tal, no es necesario que la distribución de racimos de RyR, y uno puede utilizar simplemente la malla en el paso 3.4. Como una aplicación más compleja, la bioenergética (uso 2) podría ser juntada con dinámica de calcio (uso 1) en un modelo que utiliza todos los componentes considerados en malla y construcción del modelo, es decir mitocondria, miofibrillas y rianodina receptores.

Figura 9 representa los resultados de estas simulaciones espaciales metabolismo sobre diferentes regiones de una malla mediante paso 3.4. Figura 9A representa la concentración de oxígeno a lo largo de la sección transversal de la célula, mientras que la figura 9B muestra la concentración de ADP en el compartimiento de miofibrillas de la célula. Figura 9 muestra la distribución de potencial de membrana mitocondrial a través de la red mitocondrial. Estas cifras revelan la distribución no uniforme de las mitocondrias y miofibrillas en la sección transversal de la célula. También revelan el paisaje metabólico no homogéneo resultante de la ultraestructura de esta no uniforme. Esto demuestra el poder de los datos de microscopia basado en simulaciones de elementos finitos para dar ideas sobre las relaciones estructura-función que de otra manera difíciles de obtener a través de métodos experimentales solamente.

Figure 1
Figura 1: preparación de Langendorff del corazón para la fijación química. (A) esquema del aparato de perfusión de Langendorff. La llave de paso contiene una válvula para cambiar entre de Tyrode y soluciones de fijador. El vaso de precipitados en la base se utiliza para soluciones de perfusión a través del corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: examen de orientación de la célula bajo microscopía de campo brillante. Vista de campo brillante (A) de la sección de tolueno azul manchada gruesa de tejido cardiaco que ilustran las células que están orientada longitudinalmente (L) y (O) orientado oblicuamente con respecto al plano de proyección de imagen; Tenga en cuenta las estrías en la célula longitudinalmente orientada, por ejemplo. (B) vista de campo brillante de una sección de tejido que tiene la sección transversal, de la celda alineada con el plano de proyección de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: segmentación de los datos de microscopia electrónica. (A) captura de la segmentación manual de las mitocondrias mediante la herramienta de esculpir. (B) una vista 3D de las completas segmentadas manualmente mitocondrias, miofibrillas (en una variedad de colores) y sarcolema (en rosa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: conversión de stacks de la imagen binaria en 3D malla tetraédrica. (A-C) Máscaras binarias del sarcolema miofibrillas y mitocondrias, respectivamente. Combinada (D) vista de las máscaras binarias de las miofibrillas (en rojo) y mitocondrias (en verde). (E) malla tetraédrica representativos que se generó de la pila de la imagen en (D) usando iso2mesh. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: CardiacCellMeshGenerator. Una captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario que acompaña a esta publicación del protocolo para que los usuarios realice los pasos 4 y 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: simulación de una distribución realista de cluster de RyR en una pila de imagen segmentados microscopía de ultraestructura cardiaca. (A) A pila de imagen binaria que representa los vacíos entre las miofibrillas y mitocondrias, que representan el conjunto de todos los píxeles donde se encontraban grupos de RyR. (B) un 3D Render (imagen no dibujada a escala) de uno de lo RyR simulado cluster distribuciones (mostradas como esferas rojas) dentro de la geometría 3D en la pila de imágenes 3D; las superficies verdes representan las mitocondrias en la pila de la imagen. (C) A-aumento mayor (así una pequeña porción es eliminada la sección transversal de la célula en los límites de) vista de la superposición de lo RyR racimos del paso 4 y la malla computacional desde el paso 3 sobre una rebanada de la pila de imagen de tomografía de electrones 3D. (B) y (C) han sido modificados de Rajagopal, et al. 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: distribución espacial de la densidad numérica de RyR racimos de tres simula patrones de cluster de RyR. Todos los nodos de la malla son colores desde el blanco para la densidad numérica de 0.0 RyR racimos/μm3 a rojo para una máxima densidad numérica de 0,99 RyR racimos/μm3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Heterogeneidad espacial en [Ca2 +]i durante la fase creciente de la transitoria de Ca2 + . Obligado (A) la media citosólica difunde libremente [Ca2 +] (izquierda) y Fluo-4 Ca2 +, [F4Ca] (derecha). (B) y (C) Mostrar instantáneas de Time-lapse de difundir libremente Ca2 + y F4Ca en el disco z, plano transversal; flechas negras marcan las regiones de alta [Ca2 +] debido a la agrupación mitocondrial; flechas rojas marcan las regiones de alta [Ca2 +]i debido a varios clusters de RyR en proximidad cercana. (C) análisis de la línea simulada de [Ca2 +] (medio) [F4Ca] (derecha). La posición de línea se muestra en la sección transversal de la celda a la izquierda. La dimensión horizontal de la sección transversal de la célula se ha proporcionado como un indicador de la escala espacial en las secciones de la imagen. Esta figura ha sido modificada de Rajagopal, et al. 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: distribución espacial de los metabolitos y el potencial de membrana mitocondrial generado a partir de la simulación espacial del metabolismo energético cardiaco. (A) concentración de oxígeno a lo largo de la sección transversal de la celda en unidades de μm, concentración de ADP (B) sólo en la parte de miofibrillas de la célula en unidades de μm. (C) distribución de potencial en el mitocondrial de membrana mitocondrial red en unidades de mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: visualización de un patrón de punto de racimo simulado RyR en el paquete de estadísticas R. Esta ventana aparece en la conclusión de las simulaciones de racimos de RyR, que representa el primero de los patrones de punto simulado. Esto puede usarse como un indicador de que el simulador de RyR ha concluido así y puede interrogar a la calidad de los patrones simulados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Productos químicos Cantidades
0.2 ácido clorhídrico N
1 N HCl 5 mL
Agua destilada 20 mL
Existencias M 0,15 sodio cacodilato
Cacodilato de sodio 32,1 g [3H2O]
0.2 ácido clorhídrico N 25 mL
Componen 1 L con agua destilada
pH 7.4
0,3 existencias cacodilato sódico M
Cacodilato de sodio g 64,2 [3H2O]
0.2 ácido clorhídrico N 25 mL
Componen 1 L con agua destilada
pH 7.4
Composición de la solución de Tyrode
NaCl 139 mM
KCl 3 mM
CaCl2 3 mM
MgCl2 1 mM
Glucosa 12 mM
NaHCO3 17 mM
Probenecida 1 mM
ANUNCIO. 20 mM
KCl/NaCl/NaHCO3 1 L solución
NaCl (Peso Molecular 58.44 g/mol) g 81,2
KCl (Peso Molecular 74.55 g/mol) 2,24 g
NaHCO3 (Peso Molecular 84.01 g/mol) 14,28 g
Disolver en 1 L agua destilada agua
Solución de 1 L de MgCl2/CaCl2
CaCl2 (2H2O) (Peso Molecular 147 g/mol) 1,764 g
MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) g 0,814
Disolver en 1 L agua destilada agua
Solución de 200 mL de glucosa de 1 M
Dextrosa (Peso Molecular 180.16 g/mol) g 36,03
Disolver en 200 mL de agua destilada doble
Solución de Tyrode solución 500 mL
KCl/NaCl/NaHCO3 50 mL
Glucosa 6 mL
Agua bidestilada 400 mL
Oxígeno de la burbuja en solución por 5 min.
2% PDA + 2.5% glutaraldehído + 0,2% tánico ácido fijador en cacodilato de sodio de 0.15 M
Polvo paraformaldehido (PFA) 2 g
Ácido tánico 0,2 g
Agua destilada 20 mL
25% glutaraldehído 10 mL
0,3 cacodilato de sodio M 20 mL
Cacodilato de sodio de 0.15 M 50 mL
1 N NaOH 4 g NaOH/100 mL de agua destilada
Solución madre de acetato de uranilo de 4%
Acetato de uranilo 4 g
Cerca de ebullición doble agua destilada 96 mL
Disolver el UA en el agua cerca de bioling con un agitador en un fumehood.
Filtro UA a través de un filtro Whatman #1 frasco de 200 mL de color para la protección de la luz
Tapa herméticamente y etiquetar, almacenar a 4 ° C

Tabla 1: Reactivos y cantidades para preparación de tejido para microscopía electrónica.

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Discussion

El protocolo anterior esboza pasos clave para generar un modelo geométrico de la novela elementos finitos de ultraestructura de cardiomiocitos. El método permite modalidades de fusión computacional de microscopía diferentes (o, en principio, otros datos) desarrollar un modelo computacional más comprensivo de la dinámica de cardiomiocitos que incluye detalles de la arquitectura espacial de la célula. No hay actualmente ningún otro protocolo disponible para crear un modelo de un cardiomiocito.

Paso 1 describe un protocolo para la fijación de la perfusión. Alternativamente, el corazón podría ser suprimido, disecado en pedazos más pequeños e inmerso en el fijador. Sin embargo, este proceso debe realizarse rápidamente y puede tienen diferentes resultados, dependiendo del tamaño de las muestras. En la experiencia el authors', perfusión garantiza la cuidadosa infiltración del fijador en el tejido y las células. Los autores también previamente perfusión el corazón con solución de Krebs-Henseliet para hacer que el corazón batir antes de la fijación. Esto permitió que las medidas en el centro de trabajo antes de la fijación.

Los pasos del proceso de microscopia electrónica en el paso 2 son típicos para tomografía de electrones. Las cantidades de solución de proceso, particularmente de las soluciones de tinción y horarios pueden variar al usar otras técnicas de imagen como serie-bloque-cara microscopía electrónica de barrido o centrado de la viga de ion microscopía28. Las imágenes de microscopia electrónica adquirida deben segmentarse en regiones diferentes organelas como mitocondrias, miofibrillas y túbulos transversales. Esto puede realizarse manualmente o en forma automatizada. El contraste en la pila de la imagen es en parte dependiente en el éxito del Protocolo de tinción, pero algo de este contraste se pierde al realizar la tomografía. Este protocolo describe el manual pasos para segmentar las diferentes estructuras, aunque nuevos métodos para realizar la segmentación automática29 será más favorables en general mejorar el rendimiento de los datos.

Las cualidades más importantes de examinar en la base de datos de microscopia electrónica son la preservación de estructura y contraste de imagen. La receta de tinción y la resina, incrustación de mezclas en este protocolo se han refinado para alto contraste entre las miofibrillas, mitocondrias y los discos z de la célula cardiaca. Por ejemplo, los autores han utilizado previamente el cloruro de calcio en lugar de ácido tánico en el paso 1.2 para delimitar la red reticular sarcoplásmica. Esto ayudó con la identificación de los límites exteriores de los haces de miofibrillas durante segmentación de organelas. Tiempos y componentes químicos coloración adicionales también pueden utilizarse para la visualización de las estructuras de la membrana, como el retículo sarcoplásmico túbulos transversales axiales30.

Las imágenes deben examinarse también de degradación estructural. Proceso de fijación o microscopia electrónica de mala calidad puede resultar en la pérdida severa de cristae mitocondriales, alta proporción de mitocondrias desalojadas o inflamadas y la desintegración de las porciones de la membrana celular (sarcolema). Un examen más cercano y cuidadoso también puede mostrar pérdida de la t-tubular y membranas de SR, pero son menos obvia para el ojo inexperto. Las soluciones a este problema incluyen: (i) asegurar la perfusión completa; (ii) disección del tejido en pequeñas muestras que también garantizan la penetración del fijador y manchas; (iii) asegurar que el procesamiento de microscopia electrónica se realiza en soluciones de frío o sobre hielo donde sea especificada; y (iv) asegurar que se siguen estrictamente los tiempos de tinción y la deshidratación (la deshidratación en particular).

Un típico cardiomiocitos es ~ 20 μm de diámetro de sección transversal y ~ 100 μm de longitud. Esto hace que las células de corazón toda imagen un desafío significativo. Además, la orientación cambiante de las fibras musculares en el corazón31 más complica la adquisición de un volumen de imagen cuyos ejes estén alineados con los ejes longitudinales y transversales de una célula de interés. Programas de análisis de imagen como IMOD permiten reajuste sintética de los datos en una orientación deseada. Avances recientes en serie bloque cara barrido microscopía28 y asociada imagen procesamiento de algoritmos29 también ayudar a resolver estas cuestiones. Sin embargo, la examinación cuidadosa de secciones gruesas debajo de un microscopio de luz y posterior reorientación del bloque (paso 2.5) aumentará la probabilidad de que las células con razonable alineación de los ejes longitudinales y transversales con la proyección de imagen de la proyección de imagen ejes. Esto asegurará que la mayoría del volumen celular será capturada dentro del campo de visión.

Protocolo pasos 3, 4 y 5 requieren software enumerado en la Tabla de materiales a instalar. IMOD, el paquete R-estadísticas, iso2mesh y FiJi (una versión de ImageJ para datos de microscopia) tienen extensa documentación y tutoriales sobre cómo utilizarlos. CardiacCellMeshGenerator es una aplicación de MATLAB que se ha desarrollado para hacer más fácil para el usuario construir el modelo en un flujo de trabajo simple. Los usuarios pueden descargar el código fuente completo y paquete de la aplicación desde el enlace de repositorio de github RyR-simulator (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). La aplicación, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, puede instalarse en MATLAB como una aplicación. Las entradas para la malla generada en este protocolo se pueden encontrar dentro de RyR-simulador/entrada-archivos /-tomo-célula diana /, mientras que las entradas adicionales para el simulador de RyR-cluster se encuentra dentro de RyR-simulador/entrada-archivos/master-cell /. Antes de iniciar la aplicación, los usuarios deben asegurarse de que la carpeta de iso2mesh instalados y sus subcarpetas se han añadido al path MATLAB. Asimismo, asegurar que necesario R-paquetes (Tabla de materiales) para el simulador de cluster también se han instalado dentro de R.

Se ha incluido una barra de progreso en la aplicación al generar la malla, al generar las entradas para el simulador de cluster de RyR y al RyR densidades de cluster de la malla utilizando al asignador de densidad RyR; la aplicación hará que la malla 3D en la interfaz gráfica cuando ha concluido la etapa de generación de la malla. Al término de las simulaciones de cluster de RyR en la interfaz de usuario de R, aparecerá una ventana gráfica (figura 10), que representa uno de los RyR 3D simulado clúster punto de patrones.

El botón "Generar malla" en la GUI desencadena la función iso2mesh para generar una malla tetraédrica. La resolución del modelo se puede ajustar por parámetros el "iso2mesh" en la GUI que ajustar la longitud de borde y volumen máximo elemento tetraédrico. El programa actualmente distingue elementos que conforman la región de miofibrillas y las regiones de las mitocondrias; Esta función se extenderá para incluir otros componentes de la célula en el futuro.

Los usuarios pueden utilizar la representación 3D de la malla y los racimos de RyR para solucionar estos pasos. La configuración de simulación de cluster de RyR, etol y numIter, dentro de configuración. R afectan la precisión de las simulaciones de cluster de RyR; Estos dos parámetros determinan cuándo termina una simulación de modelo de cluster de RyR. Estos parámetros se pueden ajustar en la inspección de la distribución de los grupos de RyR en la ventana de R (figura 10) para asegurarse de que: (i) todos los clústeres están cerca de los discos z; y (ii) los clusters se extienden a través de la sección transversal entera en lugar de agregar en cualquier región. Un análisis de sensibilidad ad hoc de las simulaciones a estos dos parámetros pueden realizarse para determinar una combinación adecuada de etol y numIter.

El estimador de intensidad de núcleo esférico en el paso 5 utiliza una esfera de diámetro solicitada como un núcleo, que se pasa sobre el volumen de interés (el modelo espacial 3D en este contexto). Estos parámetros se pueden ajustar para este alisado algoritmo en la interfaz gráfica en la figura 5: r_sphere (1) define el radio del núcleo esférico suavizado; (2) hval define el tamaño de paso espacial iterativo en el que el núcleo esférico debe pasarse iterativamente sobre el volumen.

Es un enfoque simple para determinar si los parámetros de densidad espacial suficientes inspeccionar la distribución de los valores de densidad de cluster de RyR como se muestra en la figura 7. Los valores de densidad deberán distribuirse tal que el barrio de los valores de alta densidad es un tamaño similar al tamaño de un clúster de RyR en datos de microscopia.

El protocolo actual produce un modelo de elementos finitos que sólo contiene la distribución realista de miofibrillas, mitocondrias y racimos de RyR. Una extensión a este paso sería simular la distribución de los otros canales iónicos que juegan un papel en la ECC, como bombas de calcio reticular sarco endoplasmic (SERCA2a), intercambiador de sodio-calcio (NCX) y las bombas de calcio sarcolemales. La clave de estas extensiones es un análisis de la distribución espacial de los canales del ion de los datos de la inmunofluorescencia. Por ejemplo, se han medido los canales NCX para distribuirse uniformemente sobre las membranas tubulares t en un espaciamiento promedio de 0.67 μm, pero su relación con grupos de RyR no es tan claro32. Por otro lado, los anticuerpos dirigidos a SERCA2a se han utilizado anteriormente para marcar el SR33, pero la densidad espacial de SERCA2a no se ha divulgado en la literatura. Por lo tanto, en esta etapa, puede suponerse una distribución uniforme de SERCA 2A sobre la red del SR y NCX sobre los túbulos t con precaución.

Como se demuestra en los resultados de representante, la malla de elementos finitos resultante puede utilizarse con elementos finitos solvers34 para simular procesos bioquímicos como el calcio señalización18 y bioenergética27 como reacción-difusión procesos. Para ello, canales iónicos se representan como sitios de reacción en los nodos dentro de la topología de malla. Los sitios de reacción actúan como fuentes o sumideros de especies químicas diferentes para representar el flujo de especies químicas a través de estos canales iónicos en diferentes compartimentos de la célula. La malla de salida y RyR densidad archivos de este protocolo pueden utilizarse con cualquier otro integrador o en cualquier otro ambiente, siempre que el software tiene la característica de reconocer estos archivos de texto. Los archivos de texto también pueden ser manipulados por secuencias de comandos o software de terceros para satisfacer los requisitos de formato de archivo de entrada del medio de la opción. La primera aplicación en la dinámica del calcio sólo demuestra la utilidad de este modelo para la carrera ascendente de calcio pero esto no indica que la malla no puede utilizarse para escalas de tiempo más largo. Las densidades de malla y cluster pueden utilizarse para simular múltiples ciclos de calcio, con el mantenimiento de la homeostasis y estabilidad sólo dependiente en el solucionador de elementos finitos que se utiliza.

Un objetivo a largo plazo es mejorar este gasoducto de modelo de construcción para hacer más fácil crear modelos de elementos finitos estructural precisa de cardiomiocitos y otros tipos de células. Un algoritmo de segmentación automatizada ha sido desarrollado recientemente, que puede ser aplicado a los datos de microscopia electrónica análisis serie bloque de cara de cardiomiocitos para crear un modelo de la distribución de las miofibrillas y mitocondrias en la célula completa con mínima del usuario entrada29. Este método se extenderá para segmentar el túbulo t y las redes de membrana de SR en el futuro. Una versión más generalizada del algoritmo RyR-simulador que permitirá a los usuarios analizar y simular lugares Co entre canal del ion y organelos, así como tipos diferentes de canales iónicos, de manera de alto rendimiento está también bajo desarrollo. Un protocolo sin soldadura para la construcción de un modelo completo de la célula permitiría a los científicos realizar pruebas de hipótesis basadas en modelos sobre la relación entre la estructura celular y función de la célula más habitualmente que en la actualidad con aproximaciones experimentales solo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Real Sociedad de Nueva Zelanda Marsden rápido inicio beca 11-solución-184, la beca de investigación de programa de ciencia de fronteras humana RGP0027/2013 y el australiano investigación Consejo descubrimiento proyecto Grant DP170101358.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2393
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405
Dextrose Sigma-Aldrich D9434
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) Merck 354400-500ML
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Tannic Acid Sigma-Aldrich 403040-500G 100g EM grade
Sodium cacodylate Sigma-Aldrich C0250
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4593
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 75632-10ML 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available)
Uranyl Acetate EM Sciences 22400 25g bottle
Potassium Ferrocyanide Merck Millipore 104973
Toluene blue Sigma-Aldrich T3260
Borax Sigma-Aldrich S9640 also termed sodium borate
Ethanol Sigma-Aldrich 792780 Diluted to different percentages with pure water
Acetone EM Sciences RT10017
Resin kit EM Sciences 14040 ACM Durcupan works well
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H9892 1Normal solution
Equipment
Ultramicrotome Leica EM UC7
Transmission electron microscope ThermoFisher Scientific Tecnai F30 http://www.leica-microsystems.com/
Retort stand Proscitech T752
Tubing BioStrategy 75831-346 for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential
Stopcocks SDR QP13813 for langendorff tubing; product is only an example, user can select any
retort stand clamps Proscitech T715
Plastic syringes SDR QPC1108 for solutions on langendorff apparatus
Cannulation silk suture, 7-0 TeleFlex 15B051000 for tieing heart on langedorff apparatus
Cannula Made from 3 mm outer-diameter steel needle
Rubber petri dish mat Proscitech H068 for use as cutting board during fixed-heart dissection
Razor blades Proscitech L056 for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing
Glass bottles BioStrategy 89000-236 for storing solutions during tissue fixation and processing for EM
Beakers BioStrategy 213-0477 for storing solutions temporarily and during perfusion
Scintillation vials BioStrategy 548-2170 for tissue samples during EM processing
Dissection kit Proscitech T161 for animal dissection
Syringe Filters Proscitech WS3-02225S for purification of Uranyl Acetate
Aluminium/silver foil baking cups From any baking products store
Dupont Diamond knife BioStrategy 102680-780 35 degree angle version produces best sections.
Colloidal Gold BBI Solutions EM. GC15 15 nm colloidal gold
EM mesh grids Proscitech GCU150 a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example
Plastic disposal pippettes Proscitech LCH20 best to use plastic disposables especially when working with resin
Software
SerialEM University of Boulder tomography acquisition
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD University of Boulder image alignment and segmentation
iso2mesh available at http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji or similar image processing software ImageJ Fiji is Just Image J available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks
RyR-Simulator codes/data CellSMB group available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGenerator CellSMB group comes with RyR-Simulator under folder "gui-version"
R-statistics software R-project Download from https://www.r-project.org
spatstat R-project install via R program
rgl R-project install via R program
doparallel R-project install via R program
foreach R-project install via R program
doSNOW R-project install via R program
iterators R-project install via R program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas
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Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S.,More

Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S., Hunt, H., Walker, C., Hanssen, E., Crampin, E., Soeller, C. Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology. J. Vis. Exp. (134), e56817, doi:10.3791/56817 (2018).

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