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Biochemistry

Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव

Published: December 21, 2017 doi: 10.3791/56820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

Summary

अनुवाद विनियमन प्रोटीन बहुतायत के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहां, हम नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें अनुवाद के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह विधि का वर्णन ।

Abstract

प्रोटीन में mRNA का अनुवाद एक जटिल विनियमन के कई परतों को शामिल प्रक्रिया है । यह अक्सर माना जाता है कि mRNA प्रतिलेखन में परिवर्तन प्रोटीन संश्लेषण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित, लेकिन कई अपवाद देखा गया है । हाल ही में, एक तकनीक ribosome profile बुलाया (या राइबो-Seq) एक शक्तिशाली तरीका है कि पहचान की अनुमति देता है के रूप में उभरा है, उच्च सटीकता के साथ, जो mRNA के क्षेत्रों प्रोटीन और अनुवाद के जीनोम में ठहराव व्यापक स्तर पर अनुवाद कर रहे हैं । यहां, हम उभरते खमीर में राइबो-Seq का उपयोग अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, संयोजन राइबो-mRNA बहुतायत माप के साथ Seq डेटा हमें एक साथ एक ही नमूना में mRNA टेप के हजारों की अनुवाद क्षमता मात्रा और प्रयोगात्मक के जवाब में इन मापदंडों में परिवर्तन की तुलना करने के लिए अनुमति देता है जोड़तोड़ या अलग शारीरिक राज्यों में । हम ribosome पैरों के nuclease पाचन का उपयोग कर, बरकरार ribosome के अलगाव-सुक्रोज ढाल अंश के द्वारा पदचिह्न परिसरों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, और उचित साथ साथ गहरी अनुक्रमण के लिए डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी गुणवत्ता नियंत्रण vivo अनुवाद में का सही विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।

Introduction

mRNA अनुवाद कोशिका में मौलिक प्रक्रियाओं में से एक है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, mRNA अनुवाद कसकर अलग आंतरिक और बाह्य शारीरिक उत्तेजनाओं 1,2के जवाब में नियंत्रित किया जाता है । तथापि, शोधों के विनियमन के तंत्र का अध्ययन करते रहते हैं । यहां, हम ribosome profiling द्वारा उभरते खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । ribosome रूपरेखा तकनीक के समग्र लक्ष्य के लिए अध्ययन और विभिंन सेलुलर शर्तों के तहत विशिष्ट mRNAs के अनुवाद मात्रा है । इस तकनीक का उपयोग करता है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मात्रात्मक जीनोम भर में ribosome अधिभोग का विश्लेषण और एकल codon संकल्प 3,4पर vivo में प्रोटीन संश्लेषण की दर की निगरानी की अनुमति देता है । वर्तमान में, इस विधि प्रोटीन अनुवाद के स्तर को मापने का सबसे उंनत साधन प्रदान करता है, और एक उपयोगी खोज जानकारी उपलब्ध कराने के उपकरण है कि अंय वर्तमान में उपलब्ध तकनीकों से नहीं पता चल सकता है साबित हो गया है, जैसे microarrays या अनुवाद राज्य सरणी विश्लेषण (TSAA) 5। के रूप में ribosome प्रतिलिपि स्तर और शोधों के उत्पादन में संयुक्त परिवर्तन पर रिपोर्ट की रूपरेखा, यह भी अंय तरीकों की तुलना में बहुत अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है ।

यह प्रकिया ribosome-सुरक्षित mRNA अंशों 3की गहरी sequencing पर आधारित है । प्रोटीन अनुवाद के दौरान, ribosomes की रक्षा ~ 28 mRNA के nt भाग (पैरों के निशान कहा जाता है) 6। ribosome-संरक्षित टुकड़े के अनुक्रम का निर्धारण करके, राइबो-Seq अनुवादित mRNA पर ribosomes की स्थिति को मैप कर सकते हैं और जो mRNA के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए सक्रिय रूप से प्रोटीन 3,7में अनुवाद होने की संभावना है । इसके अलावा, हम मात्रा के निशान है कि एक दिया mRNA प्रतिलिपि को संरेखित की संख्या की गिनती से mRNA के अनुवाद को मापने कर सकते हैं ।

आदेश में ribosome-संरक्षित टुकड़े को अलग करने के लिए, सेल lysates शुरू में एक अनुवाद अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है ribosomes ribonuclease पाचन द्वारा पीछा स्टाल । जबकि मुक्त mRNA और अनुवादित mRNAs के भाग ribosomes द्वारा संरक्षित नहीं ribonuclease द्वारा अपमानित कर रहे हैं, ribosome-संरक्षित mRNA टुकड़े शुद्ध बरकरार ribosome-पदचिह्न परिसरों से बरामद किया जा सकता है । इन mRNA पैरों के निशान तो सीडीएनए पुस्तकालय में बदल रहे हैं और गहरी अनुक्रमण (चित्रा 1) द्वारा विश्लेषण किया. ribosome रूपरेखा के समानांतर में, बरकरार mRNA एक ही नमूना है और अनुक्रम से निकाला जाता है । mRNA बहुतायत माप के साथ राइबो-Seq द्वारा की पहचान अनुवाद के स्तर की तुलना करके, हम विशेष रूप से कर रहे हैं कि जीन की पहचान कर सकते हैं-या नीचे अनुवाद के स्तर पर विनियमित और जीनोम-वाइड स्तर पर mRNA के अनुवाद दक्षता की गणना. हालांकि इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल खमीर के लिए विशिष्ट है, यह भी शोधकर्ताओं जो अंय प्रणालियों में राइबो-Seq प्रोटोकॉल स्थापित करने की कोशिश करेंगे के लिए उपयोगी होना चाहिए ।

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Protocol

1. निकालने की तैयारी

  1. लकीर YPD प्लेटों पर एकल कालोनियों के लिए जमे हुए शेयरों से खमीर उपभेदों (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज, और 2% आगर) । 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन ।
  2. एक YPD प्लेट से लगाना खमीर (एक ही कॉलोनी का उपयोग करें) में YPD मध्यम (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज) एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में 15 मिलीलीटर और मिलाते हुए (200-250 rpm) के साथ रातोंरात बढ़ने में 30 डिग्री सेल्सियस ।
  3. संस्कृति को पतला करने में ५०० मिलीलीटर YPD मध्यम से एक 2 L बाँझ कुप्पी में, जिससे कि आयुध डिपो६०० & #60; ०.१. 3-5 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ खमीर कोशिकाओं को विकसित६०० = ०.५ (मध्य प्रवेश चरण) ।
  4. एक ग्लास धारक फिल्टर विधानसभा का उपयोग ०.४५ माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टरिंग द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा । एक रंग के साथ गोली परिमार्जन, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज, और दुकान पर-८० ° c । जमे हुए गोली की उंमीद आकार ~ ०.२-०.५ जी है ।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन अत्यंत कम तापमान है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
  5. एक ताजा Lysis बफर तैयार (20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, १४० मिमी KCl, 5 मिमी MgCl2, १०० μg/एमएल cycloheximide, ०.५ मिमी डीटीटी, 1% ट्राइटन एक्स-१००) तुरंत उपयोग करने से पहले, बर्फ पर रखें.
  6. एक १.८ मिलीलीटर स्टेनलेस स्टील ट्यूब में 3 क्रोम स्टील मोती (३.२ मिमी) रखो । तरल नाइट्रोजन में पूर्व ठंडा और जमे हुए छर्रों जोड़ने के लिए, एक सिलिकॉन रबर टोपी के साथ कवर । ४२०० rpm पर 10 एस के लिए cryogrinding द्वारा नमूना Homogenize; दोहराएं 10 बार । ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब हर दौर के बीच कम से कम 10 एस ।
    नोट: यह हमेशा नमूना जमे हुए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  7. Lysis बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । एक नया १.५ एमएल ट्यूब में स्थानांतरण ।
  8. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० x g पर केंद्रापसारक । बर्फ पर काम करते समय, एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में supernatant हस्तांतरण । पाली (क) mRNA अलगाव के लिए एक नई १.५ एमएल ट्यूब के लिए lysate के १०० μL स्थानांतरण । आरएनए अलगाव या फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में ट्यूब फ्रीज करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें । माप ओडी lysate के बाकी के२६० , जो पदचिह्न निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और फ्लैश तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों फ्रीज । -८० ° c पर lysates स्टोर ।

2. पदचिह्न निष्कर्षण

  1. सुक्रोज ग्रेडिएंट की तैयारी
    1. ५०%, ४०%, 30%, 20%, और ग्रैडिएंट बफ़र में 10% सुक्रोज के लिए समाधान तैयार करें (20 mm Tris-HCl pH ८.०, १४० mm KCl, 5 mm MgCl2, १०० μg/एमएल cycloheximide, ०.५ mm डीटीटी) ।
    2. १३.२ मिलीलीटर पतली दीवार polyallomer ट्यूब के नीचे करने के लिए तैयार ५०% सुक्रोज बफर के पिपेट २.२ मिलीलीटर और 10 मिनट में-८० ° c (चित्रा 2) के लिए समाधान फ्रीज । फिर परत २.२ ४०% सुक्रोज बफर के जमे हुए ५०% सुक्रोज बफर के शीर्ष पर, और 10 मिनट के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज । एक ही निर्देश के बाद, परत 30% है, तो 20%, और अंत में 10% सुक्रोज एक दूसरे की लालबत्ती थें । जबकि लेयरिंग हवा के बुलबुले बनाने से बचें । ग्रेडिएंट्स को-८० ° c उपयोग तक रखें । सुक्रोज ग्रैडिएंट्स को प्रयोग के पहले कम से एक दिन तैयार किया जाना चाहिए और-८० ° c पर संग्रहित करना चाहिए ।
  2. Nuclease पाचन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों से पहले सुक्रोज ढाल रात गल ।
    2. गल सेल lysate (बर्फ पर पदचिह्न नमूना) । एक नई १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए ५० आयुध डिपो२६० इकाइयों युक्त सेल lysate के एक aliquot हस्तांतरण और ताजा Lysis बफर जोड़ने के लिए 1 मिलीलीटर । शेष lysate पर-८० डिग्री सेल्सियस की दुकान । 10 μL RNase मैं (१०० U/μL) और एक सिर से अधिक ऊँची एड़ी के जूते पर कोमल रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 1 ज मशीन जोड़ें ।
    3. वैकल्पिक) 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूनों को स्पष्ट और एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में supernatant की वसूली ।
  3. Ultracentrifugation
    1. धीरे परत एक 10-50% सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर lysate नमूने ।
    2. Ultracentrifuge polyallomer ट्यूबों पर २१०,००० x g (३५,००० rpm) पर 4 ° c 3 h दप-४१ ती रोटर का उपयोग कर के लिए ।
  4. ग्रैडिएंट भिन्नीकरण सिस्टम सेट-अप
    1. घटकों को चालू करें और यूवी पर नजर रखने के लिए गर्म अप करने के लिए अनुमति देने के लिए ंयूनतम 30 मिनट ।
    2. यदि कोई डिजिटल रिकॉर्डर सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहा है, तो कंप्यूटर पर सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, ग्राफ़ की स्केलिंग सीमाएं-०.०१ और 1 पर सेट करें ।
    3. चेस समाधान के साथ सिरिंज भरें (20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, १४० मिमी KCl, 5 मिमी MgCl2, ६०% सुक्रोज), सिरिंज और प्रवेशनी के अंदर किसी भी हवा के बुलबुले को दूर.
    4. RNase मुक्त पानी से भरा एक ultracentrifuge ट्यूब स्थापित करें । प्रवेशनी के साथ ट्यूब पियर्स जब तक दो काले निशान देखा जा सकता है । 1 मिलीलीटर/मिनट पर सिरिंज पंप शुरू.
    5. के रूप में पानी के प्रवाह सेल के माध्यम से गुजरता है, प्रेस "ऑटो शूंय" यूवी मॉनिटर पर बटन 0 करने के लिए आधारभूत समायोजित करने के लिए । "२.० AU" करने के लिए यूवी मॉनिटर की संवेदनशीलता सेट करें । एक स्थिर आधार रेखा के बाद स्थापित किया गया है, सिरिंज पंप बंद करो । चेस समाधान ठीक है और ultracentrifuge ट्यूब को हटा दें ।
  5. Monosome अलगाव
    1. स्थापित करें और सुक्रोज ढाल युक्त ultracentrifuge ट्यूब पियर्स । 1 मिलीलीटर/मिनट पर सिरिंज पंप शुरू, 1 मिलीलीटर एक२५४ मूल्यों की निगरानी भागों लीजिए । पूल एक ट्यूब में 80 के दशक monosome चोटी का प्रतिनिधित्व अंश, बर्फ पर रखने के लिए (चित्रा 3) ।
    2. एक बार चेस समाधान प्रवाह सेल तक पहुंच जाता है, सिरिंज पंप बंद करो । चेस समाधान ठीक है और ultracentrifuge ट्यूब को हटा दें । कदम 2.5.1 पर शुरू नमूनों के बाकी के लिए आंशिक रूप से दोहराएँ ।
      नोट: समाप्त होने पर, RNase-मुक्त पानी के कम से 30 मिलीलीटर के साथ भिन्नीकरण प्रणाली को साफ करें । अच्छी तरह से गर्म पानी के साथ टयूबिंग, सिरिंज और सभी हटाने योग्य घटकों को धोने ।
    3. ०.५ एमएल केंद्रापसारक फिल्टर के माध्यम से भिंन फ़िल्टर (१०० केडीए MWCO) में १२,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 ° c और छोड़ प्रवाह के माध्यम से, दोहराने जब तक मात्रा है & #60; १०० μL । रिलीज बफर के ४०० μL जोड़ें (20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.०, 2 मिमी EDTA, ४० यू/एमएल RNase अवरोधक) । pipetting द्वारा मिक्स, बर्फ 10 मिनट पर मशीन और एक नया संग्रह ट्यूब में इकाई हस्तांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
  6. पदचिह्न टुकड़ा शुद्धिकरण
    1. एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रवाह के माध्यम से पदचिह्न युक्त आरएनए टुकड़े स्थानांतरण, 20% एसडीएस के 20 μL (1%), pipetting द्वारा मिश्रण के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
    2. जोड़ें 1 एसिड की मात्रा-Phenol: क्लोरोफॉर्म (पीएच ४.५), भंवर के लिए 10 एस ।
      चेतावनी: एसिड-Phenol: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है, त्वचा और साँस लेना के साथ संपर्क से बचने ।
    3. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर हीट, बर्फ पर डाल के लिए 1 min. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, जलीय चरण (ऊपर) एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण ।
    4. 1/10 NaOAc की मात्रा (पीएच ५.५), ग्लाइकोजन की 1/100 मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों को जोड़कर तेज पदचिह्न आरएनए टुकड़े ।
से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

3. पाली (क) mRNA निष्कर्षण

  1. कुल आरएनए निष्कर्षण
    1. गल एक १०० μL aliquot ऑफ सेल lysate (कुल आरएनए नमूना) बर्फ पर, 20 मिमी Tris के ३०० μL-एचसीएल पीएच ७.० और 20% μL (1% की अंतिम एकाग्रता के लिए) जोड़ें, एसडीएस द्वारा मिश्रण ।
    2. एसिड-Phenol की 1 मात्रा (४०० μL) जोड़ें: क्लोरोफॉर्म (पीएच ४.५) और भंवर 10 एस के लिए ।
    3. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर हीट, बर्फ पर डाल के लिए 1 min. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, जलीय चरण (ऊपर) एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण ।
    4. कोई दूसरा phenol निष्कर्षण निष्पादित करें । एसिड-Phenol की 1 मात्रा जोड़ें: क्लोरोफॉर्म (पीएच ४.५), 10 एस के लिए भंवर 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर हीट, बर्फ पर डाल के लिए 1 min. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए जलीय चरण हस्तांतरण ।
    5. आरएनए का हाला । इस जोड़ें 1/10 3m NaOAc (पीएच ५.५), 1/100 ग्लाइकोजन की मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों की मात्रा । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  2. पाली (क) mRNA अलगाव
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर आरएनए नमूने केंद्रापसारक, इथेनॉल निकालें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी हटाने टिप लोड हो रहा है, और हवा 5 मिनट के लिए गोली सूखी ।
    2. पाली (क) mRNA आइसोलेशन किट से Lysis/बाइंडिंग बफ़र के ३०० μL में गोली भंग । पाली (क) mRNA आइसोलेशन किट निर्माता के प्रोटोकोल के अनुसार mRNA निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें ।
    3. 1/10 3 एम NaOAc (पीएच ५.५), 1/100 ग्लाइकोजन की मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों की मात्रा जोड़कर mRNA नमूनों हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. mRNA विखंडन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर mRNA नमूने केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 सेकंड, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी हटाने टिप और हवा 5 मिनट के लिए गोली सूखी लोड हो रहा है ।
    2. RNase-मुक्त पानी के 18 μL में mRNA reसस्पेंड, 10x आरएनए विखंडन बफर के 2 μL जोड़ें । 94 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट की मशीन । बर्फ के लिए ट्यूब स्थानांतरण ।
    3. 1/10 3 एम NaOAc (पीएच ५.५), 1/100 ग्लाइकोजन की मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों की मात्रा जोड़कर हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

4. Dephosphorylation

  1. टी-4 polynucleotide कळेनासे के साथ पदचिह्न और खंडित mRNA नमूनों का इलाज । इस के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को दूर । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल लोड हो रहा है टिप के साथ इथेनॉल के बाकी हटा दें । एयर 5 मिनट के लिए गोली सूखी ।
  2. पानी की ७.७५ µ एल में गोली फिर से निलंबित, 10x टी-4 polynucleotide कळेनासे बफर के 1 µ एल जोड़ने, टी-4 µ polynucleotide के 1 कळेनासे एल (१०,००० यू/एमएल), और ०.२५ µ एल के RNase अवरोध करनेवाला (20 यू/µ एल) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच मशीन ।
  3. वैकल्पिक) पूर्व एक 15% TBE-यूरिया जेल १८० वी पर 15 मिनट के लिए 1x TBE बफर का उपयोग कर चला ।
  4. प्रत्येक पदचिह्न और mRNA नमूना के 10 µ एल करने के लिए 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के 10 µ एल जोड़ें । 10 µ मीटर ऊपरी आकार मार्कर oligonucleotide (३२ nt), 1 µ एल के 10 µ एम कम आकार मार्कर oligonucleotide (28 nt), 8 µ l पानी, और 10 µ एल के 1 µ l युक्त एक नियंत्रण नमूना तैयार करें 2x TBE के पदचिह्न नमूने के लिए यूरिया नमूना बफर । 1 µ एल के 10 µ एम आरएनए मार्कर oligonucleotide (६३ nt), 9 µ l पानी, और µ नमूनों के लिए 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के 10 mRNA l युक्त एक नियंत्रण नमूना तैयार करें ।
  5. नमूनों की मशीन और ७५ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट नियंत्रण, नीचे स्पिन, 1 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया. 15% TBE के 2 कुओं में प्रत्येक नमूना लोड-यूरिया जेल, जेल ट्रो द्वारा अलग आरएनए टुकड़े १८० वी पर 1 ज के लिए ।
  6. एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ 5 मिनट के लिए जेल दाग (पतला 10, पानी में 000x), प्रकाश से रक्षा ।
  7. एक नीली बत्ती transilluminator का प्रयोग, 28 और ३२ nt मार्करों के बीच उचित बैंड पदचिह्न नमूनों (चित्रा 4a) के लिए और लगभग 50-70 nt mRNA नमूनों के लिए (चित्रा 4B) एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ कट । polyacrylamide जेल टुकड़े पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए ंयूनतम 10 मिनट के लिए फ्रीज ।
  8. इस प्रकार के रूप में polyacrylamide जेल से आरएनए निकालने. 2 मिनट के लिए ७० ° c पर जेल टुकड़े गर्मी, डिस्पोजेबल गोली मूसल का उपयोग कर जेल पीस । ३०० µ एल रेफरेंस बफर (20 एमएम Tris-एचसीएल नं० ७.०, 2 एमएम EDTA) के साथ Elute आरएनए, 1 µ एल RNase अवरोधक (20 यू/µ एल), और 3 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जोड़ें ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा, और NaOAc के 1/10 मात्रा (पीएच ५.५), ग्लाइकोजन के 1/100 मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और २.५% इथेनॉल के १०० संस्करणों को जोड़कर हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

5.3 '-अनुकूलक बंधाव

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर पदचिह्न और mRNA नमूने केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी निकालें-टिप लोड हो रहा है । एयर 10 मिनट के लिए गोली सूखी ।
  2. ४.७५ में गोली reसस्पेंड µ nuclease के एल-मुफ्त पानी, 2 µ एल के ५०% PEG8000, 1 µ एल की 10x टी-4 आरएनए ligase बफर, 1 µ एल की 3 '-अनुकूलक (१०० एनजी/µ एल), ०.२५ µ एल के RNase अवरोधक (20 यू/µ एल), टी-4 आरएनए के 1 µ एल ligase 2 कटा हुआ KQ (२००,००० U/एमएल) । 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  3. अगली सुबह, एडाप्टर के अतिरिक्त ०.५ µ l को जोड़कर निकालें 5 '-deadenylase (10 u/µ l) और ०.५ µ l of आरईसी J exonuclease (10 u/µ l) सीधे बंधाव प्रतिक्रिया करने के लिए. 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. नमूनों को हाला । इस के लिए, nuclease के 30 µ एल-मुक्त पानी, 1 µ एल ग्लाइकोजन (10 मिलीग्राम/एमएल), 1/10 NaOAc (पीएच ५.५) की मात्रा, और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों जोड़ें । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

6. रिवर्स प्रतिलेखन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी निकालें-टिप लोड हो रहा है । एयर 10 मिनट के लिए गोली सूखी ।
  2. nuclease-मुक्त पानी के ११.५ µ एल में गोली reसस्पेंड, 8 µ मीटर रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर (आरटी प्राइमर) और 1 µ एल के dNTP मिश्रण (10 मिमी) के ०.५ µ एल जोड़ें । ६५ डिग्री सेल्सियस, बर्फ पर जगह पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  3. 5x के 4 µ l को जोड़ें पहला कतरा बफर, 2 µ l के ०.१ M डीटीटी, ०.५ µ l के RNase अवरोधक (20 U/µ l), ०.५ µ l के रिवर्स transcriptase (२०० यू/µ l). ४८ डिग्री सेल्सियस, ६५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, ८० डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट में 30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. वेग और आरएनए के hydrolysis के लिए तुरंत आगे बढ़ना मत करो, 2 एम NaOH के ०.८ µ एल जोड़कर, ९८ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की मशीन । प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए ०.८ µ एल 2 एम एचसीएल जोड़ें ।
  5. नमूनों को हाला ।
इसके लिए, nuclease के 20 µ एल-मुफ्त पानी, 1 µ एल ग्लाइकोजन (10 मिलीग्राम/एमएल), 1/10 NaOAc (पीएच ५.५) की मात्रा, और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों जोड़ें । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी निकालें-टिप लोड हो रहा है । एयर 10 मिनट के लिए गोली सूखी ।
  • nuclease के 5 µ एल में गोली reसस्पेंड-नि: शुल्क पानी, 5 µ 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के एल जोड़ें । ७५ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट की मशीन, नीचे स्पिन, 1 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया ।
  • वैकल्पिक) पहले एक 10% TBE-यूरिया जेल १८० पर 15 मिनट के लिए 1x TBE बफर का उपयोग कर चलाते हैं ।
  • 10% TBE-यूरिया जेल की अच्छी तरह से 1 पर नमूना लोड । १८० V पर ५० मिनट के लिए जेल ट्रो द्वारा रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के उत्पादों को अलग । एक नियंत्रण के रूप में, 1 µ एल के २.५ µ एम आरटी प्राइमर, 1 µ एल के २.५ µ एम १२८ nt मार्कर oligonucleotide, 3 µ l पानी, और 5 µ l 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के, और जेल की एक अलग लेन पर चलाने युक्त एक नमूना तैयार करते हैं ।
  • एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ 5 मिनट के लिए जेल दाग (पतला 10, पानी में 000x), प्रकाश से रक्षा । एक नीली बत्ती transilluminator का प्रयोग, एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ १२८ nt और उच्च (चित्रा 5) के आसपास बैंड काट दिया । polyacrylamide जेल टुकड़े पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए ंयूनतम 10 मिनट के लिए फ्रीज ।
  • 2min के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर जेल टुकड़े गर्मी, डिस्पोजेबल गोली मूसल का उपयोग कर जेल पीस । Elute डीएनए के साथ ३०० µ एल के 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.०, और 3 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  • १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, supernatant इकट्ठा, और NaOAc के 1/10 मात्रा (पीएच ५.५), ग्लाइकोजन के 1/100 मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और २.५% इथेनॉल के १०० संस्करणों को जोड़ने के द्वारा हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

    • 7. Circularization

    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी हटाने टिप लोड हो रहा है, और हवा 10 मिनट के लिए गोली सूखी ।
    2. nuclease-मुफ्त पानी की १६.७५ µ एल में गोली reसस्पेंड । 10x एकल असहाय डीएनए (ssDNA) ligase बफर के 2 µ एल जोड़ें, ५० मिमी MnCl के 1 µ एल2, ०.२५ µ एल के ssDNA ligase (१०० यू/µ एल). ६० डिग्री सेल्सियस, ८० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट में 1 घंटे के लिए मशीन । हाला, और ssDNA बंधाव प्रतिक्रिया उत्पाद-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान नहीं है ।

    8. पीसीआर लाइब्रेरी प्रवर्धन

    1. बर्फ पर काम करते समय, एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित मिश्रण: १४६ µ l के nuclease-मुक्त जल, 2 µ एल ऑफ 20 µ मी फॉरवर्ड प्राइमरी, 2 µ एल ऑफ 20 µ मी इंडेक्स्ड रिवर्स प्राइमर, ४० µ एल ऑफ 5x हाई-निष्ठा डीएनए plymerase बफर, 4 µ एल ऑफ dNTPs (10 एमएम), 4 µ एल ऑफ ssDNA बंधाव रिएक्शन प्रोडक्ट , और उच्च निष्ठा वाले डीएनए पोलीमरेज़ के 2 µ l. अनुक्रमण के लिए मल्टीप्लेक्स किया जाएगा कि प्रत्येक नमूने के लिए एक अलग अनुक्रमित रिवर्स प्राइमर चुनें । पीसीआर मिक्सचर के ५० µ l aliquot को 4 नई पीसीआर ट्यूबों में ट्रांसफर करे ।
    2. निंनलिखित सेटिंग्स का उपयोग चक्र की संख्या अलग (8, 10, 12, 14) के साथ पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन:
      ९८ ° c प्रारंभिक विकार पर 1 मिनट
      8 से 14 चक्र:
      15 ९४ डिग्री सेल्सियस पर एस
      5 एस ५५ डिग्री सेल्सियस पर
      10 एस पर ६५ ° c
      ६५ डिग्री सेल्सियस अंतिम विस्तार पर 2 मिनट
    3. 1/10 खंड के 3 एम NaOAc (पीएच ५.५), 1/100 ग्लाइकोजन की मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों को जोड़कर पीसीआर उत्पाद हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी निकालें-टिप लोड हो रहा है, और हवा गोली सूखी ।
    5. nuclease के 8 µ एल में गोली reसस्पेंड-मुक्त पानी, गैर denaturing 5x न्यूक्लिक एसिड नमूना बफर के 2 µ एल जोड़ें । एक गैर denaturing 8% TBE जेल की अच्छी तरह से 1 पर नमूना लोड । जेल ट्रो द्वारा डीएनए उत्पादों को अलग १५० V पर ३५ मिनट के लिए । एक नियंत्रण के रूप में, 10 बीपी डीएनए सीढ़ी (1 µ जी/µ एल), ७.५ µ एल पानी, और गैर µ 5x denaturing एसिड नमूना बफर के 2 न्यूक्लिक एल के ०.५ µ एल युक्त एक नमूना तैयार करते हैं, और जेल की एक अलग लेन पर चलाते हैं ।
    6. एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ 5 मिनट के लिए जेल दाग (पतला 10, पानी में 000x), प्रकाश से रक्षा । एक नीली बत्ती transilluminator का उपयोग करना, एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ पदचिह्न नमूनों के लिए १५० बीपी के आसपास बैंड और mRNA नमूनों के लिए लगभग १८० बीपी (चित्रा 6) काट दिया । जेल टुकड़े पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए ंयूनतम 10 मिनट के लिए स्टोर ।
    7. 2 मिनट के लिए ७० ° c पर जेल टुकड़े गर्मी, डिस्पोजेबल गोली मूसल का उपयोग कर जेल पीस । Elute डीएनए के साथ ३०० µ एल के 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.०, और 3 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    8. १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, supernatant इकट्ठा, और NaOAc के 1/10 मात्रा (पीएच ५.५), ग्लाइकोजन के 1/100 मात्रा (10 मिलीग्राम/एमएल), और २.५% इथेनॉल के १०० संस्करणों को जोड़ने के द्वारा हाला । से कम 1 ज के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक, इथेनॉल को हटा दें । नीचे स्पिन 30 अधिकतम गति से एस, एक जेल के साथ इथेनॉल के बाकी निकालें-टिप लोड हो रहा है, और हवा गोली सूखी । अंत में, nuclease के 20 µ एल में पुस्तकालयों reसस्पेंड-मुक्त पानी और ठहराव, गुणवत्ता नियंत्रण और अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ना ।

    9. पुस्तकालय ठहराव और उच्च प्रवाह अनुक्रमण

    1. sequencing के लिए नमूने भेजने से पहले, पीसीआर प्रवर्धित पुस्तकालयों की उपज और गुणवत्ता का निर्धारण । पदचिह्न और mRNA अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए प्रतिनिधि प्रोफाइल चित्रा 7में दिखाए जाते हैं । पीसीआर परिवर्धित पुस्तकालय के अपेक्षित आकार 148-152 है पदचिह्न नमूनों के लिए बीपी, और 170-190 mRNA नमूनों के लिए बीपी ।
    2. विभिन्न बारकोड के साथ कई नमूने अनुक्रमण के लिए जमा हो जाएगा, तो एक qPCR-आधारित अनुक्रमण पुस्तकालय ठहराव परख का उपयोग कर पुस्तकालयों की सटीक ठहराव प्रदर्शन ।
    3. equimolar अनुपात में पुस्तकालयों पूल । 3 µ l x के रूप में पूल की कुल मात्रा की गणना करें परित किए जाने वाले नमूनों की कुल संख्या । कि पुस्तकालयों equimolar अनुपात में मिश्रित कर रहे हैं पूल के 10 एनएम अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा करने की जरूरत है कि प्रत्येक पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करते हैं । एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब, pipetting द्वारा मिश्रण में प्रत्येक पुस्तकालय की गणना की मात्रा जोड़ें । परिकलित कुल मात्रा को प्राप्त करने के लिए पानी जोड़ें । -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पुस्तकालयों ।
    4. Illumina sequencing प्लेटफ़ॉर्म पर चलाएँ ५० bp एकल-अंत sequencing का उपयोग कर अनुक्रम किया जा करने के लिए pooled लायब्रेरी का एक aliquot भेजें । हम नियमित रूप से मल्टीप्लेक्स में एक एकल अनुक्रमण चलाने में 12 नमूने, जो पैदावार ~ २००,०००,००० अनुक्रमण लेन प्रति पढ़ता है ।
      नोट: प्रत्येक नमूने प्रति एकत्र की अंतिम संख्या पढ़ता इनपुट सामग्री की मात्रा और rRNA संदूषण के स्तर पर निर्भर करता है ।

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    Representative Results

    ribosome profiling डेटा के bioinformatic विश्लेषण के लिए विस्तृत पाइपलाइनों पहले 8,9बताया गया है । इसके अलावा, कई अनुसंधान समूहों अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और अनुक्रमण डेटा के प्रसंस्करण के लिए bioinformatics उपकरण विकसित किया है, जो ribosome रूपरेखा विधि के लिए विशिष्ट है 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18। राइबो-Seq डेटा के विश्लेषण में पहला कदम है और ' 3 एडेप्टर अनुक्रम ट्रिमिंग कर रहा है AGATCGGAAGAGCACACGTCT Cutadapt सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 19। फिर अनुक्रमण पढ़ता गैर कोडिंग RNAs, जैसे rRNA और tRNA के खिलाफ गठबंधन कर रहे हैं, दूषित अनुक्रम को दूर करने के लिए Bowtie 20 का उपयोग कर, और पढ़ता है कि संरेखित नहीं है तो खमीर जीनोम के लिए मैप कर रहे हैं । पढ़ने के प्रति जीन गिनती तो HTseq द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है गिनती सॉफ्टवेयर 21, और अंतर व्यक्त जीन DESeq2 का उपयोग कर पहचाने जाते है 22।

    चित्रा 8 hbs1Δ में अनुवाद के मात्रात्मक विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है 23,24 खमीर विलोपन उत्परिवर्ती कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किए गए । सबसे पहले, हम संख्या और पढ़ता है कि गैर करने के लिए संगत-कोडिंग आरएनए (जैसे rRNAs) sequencing पदचिह्न और mRNA जंगली प्रकार कोशिकाओं और hbs1Δ उत्परिवर्ती के लिए उत्पन्न पुस्तकालयों के बाद प्राप्त करने के अनुपात का आकलन किया. हमने पाया है कि, यहां तक कि किसी भी rRNA कमी कदम के बिना (नीचे चर्चा), ५० से ६०% के सभी अनुक्रम में पढ़ता है हमारे पदचिह्न पुस्तकालयों में ribosome से संबंधित पदचिह्न टुकड़े (चित्रा ८अ) की रक्षा की । इसके विपरीत, rRNA के केवल 3%-व्युत्पंन टुकड़े mRNA पुस्तकालयों में मनाया गया है कि पाली (एक) mRNA अलगाव rRNA के प्रभावी उंमूलन की अनुमति देता है पढ़ता है । एक साथ, हम अधिक से अधिक १०,०००,००० पदचिह्न प्राप्त करने में सक्षम थे 2 अनुक्रमण द्वारा पदचिह्न नमूनों में से प्रत्येक के लिए पढ़ता है । पुस्तकालय पीढ़ी और डेटा की reproducibility की परिवर्तनशीलता का आकलन करने के लिए, हम आम तौर पर प्रत्येक प्रयोगात्मक शर्त के अनुसार कम से कम दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति का विश्लेषण । दोनों पदचिह्न और mRNA नमूना पुस्तकालयों पियरसन सहसंबंध गुणांक आर के साथ अच्छा reproducibility दिखाने के नमूने के बीच ~ ०.९९ (चित्रा 8B) ।

    जीनोम-वाइड स्तर पर प्रोटीन अनुवाद के स्तर का आकलन करने के अलावा, ribosome profiling प्रयोगात्मक स्थितियों 3के बीच अनुवाद क्षमता में परिवर्तन को मापने की अनुमति देता है । इसके लिए, कक्ष lysate (ribonuclease के साथ इलाज नहीं) के एक aliquot पाली (क) mRNA अलगाव और एक आरएनए-Seq पुस्तकालय की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है । क्योंकि दोनों पदचिह्न पुस्तकालय और आरएनए-Seq पुस्तकालय एक ही नियंत्रित शर्तों के तहत तैयार कर रहे हैं और प्रत्येक व्यक्ति को दोहराने के लिए पता लगाया जा सकता है, राइबो-Seq और आरएनए-Seq डेटासेट सीधे mRNA में परिवर्तन द्वारा विनियमित रहे हैं कि जीन की पहचान की तुलना में किया जा सकता है प्रतिलेखन, अनुवाद दक्षता, या एक संयुक्त प्रभाव से । जीन की पहचान करने के लिए कि अप कर रहे हैं या नीचे-hbs1Δ उत्परिवर्ती में प्रोटीन अनुवाद के स्तर पर विशेष रूप से विनियमित, हम प्रत्येक जीन के लिए mRNA rpkm द्वारा पदचिह्न rpkm मूल्यों को विभाजित करके अनुवाद दक्षता में परिवर्तन की गणना (चित्रा 8C) ।

    Figure 1
    चित्र 1: राइबो-Seq प्रोटोकॉल का ओवरव्यू. पूरे प्रोटोकॉल लगभग 11 दिनों में किया जा सकता है । प्रत्येक चरण के लिए अनुमानित समय दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2: सुक्रोज ग्रेडिएंट्स की तैयारी कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3: प्रतिनिधि सुक्रोज ग्रेडिएंट प्रोफ़ाइल. (A) नियंत्रण के लिए प्राप्त सुक्रोज ग्रैडिएंट प्रोफ़ाइल (RNase I के साथ व्यवहार नहीं) नमूना । (ख) ribosome-संरक्षित आरएनए अंशों को निकालने के लिए, कक्ष lysates RNase I के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (RT) पर इलाज किया जाता है । monosomal चोटी के लिए इसी अंश तो पदचिह्न निष्कर्षण के लिए एकत्र कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: टी-2 polynucleotide कळेनासे उपचार के बाद प्राप्त 15% polyacrylamide जैल के प्रतिनिधि छवियां । (क) 28 और ३२ nt के आसपास एक्साइज जेल टुकड़ा के आकार पदचिह्न नमूनों के लिए दिखाया गया है । (ख) जेल टुकड़ा काटने के बारे में 50-70 mRNA नमूनों के लिए nt । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्रा 5:10% polyacrylamide के प्रतिनिधि छवियां रिवर्स प्रतिलेखन के बाद प्राप्त जैल । (क) ऊपरी बैंड कट पदचिह्न नमूनों के लिए ~ १२८ nt, रिवर्स प्रतिलेखन के उत्पाद के लिए इसी । (ख) mRNA नमूनों (ऊपरी बैंड) के लिए 150-170 nt के आसपास बैंड काट । लोअर बैंड आरटी प्राइमर के अनुरूप है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6: पीसीआर प्रवर्धित पुस्तकालयों के Polyacrylamide जेल शुद्धि । पीसीआर उत्पाद 8, 10, 12 और पुस्तकालय प्रवर्धन के 14 चक्र के बाद प्राप्त एक गैर denaturing 8% TBE जेल पर हल किया गया था ।पूर्ण लंबाई पदचिह्न पुस्तकालयों के आकार ~ १५० बीपी है, जबकि mRNA पुस्तकालयों के आकार ~ 170-190 बीपी है । कम बैंड है कि insert शामिल नहीं है से बचें ।

    Figure 7
    चित्र 7: विश्लेषक विश्लेषण. (क) पीसीआर के प्रतिनिधि विश्लेषक प्रोफाइल परिवर्धित पदचिह्न पुस्तकालय । पदचिह्न पुस्तकालय का औसत आकार १४८ से १५२ nt के लिए होने की उंमीद है । (B) अनुक्रमण लाइब्रेरी के प्रतिनिधि mRNA नमूनों के लिए प्राप्त की गई । mRNA लाइब्रेरी का अपेक्षित आकार 170-190 nt है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Figure 8
    चित्र 8: प्रतिनिधि परिणाम । (क) mRNA, पदचिह्न की संख्या, और rRNA जंगली प्रकार के नमूने और hbs1Δ उत्परिवर्ती के लिए प्राप्त पढ़ता है । दो जैविक प्रतिकृतियां अनुक्रमण द्वारा उत्पंन की संयुक्त संख्या जंगली प्रकार कोशिकाओं और hbs1Δ उत्परिवर्ती के लिए दिखाए जाते हैं । (ख) पदचिह्न और mRNA-बहुतायत माप के Reproducibility के बीच दो प्रतिकृति । पियरसन सहसंबंध गुणांक (R) इंगित किए गए हैं । (ग) hbs1Δ उत्परिवर्ती में Transcriptional और शोधों में परिवर्तन. hbs1Δ में काफी ऊपर विनियमित और नीचे विनियमित जीन है कि वे mRNA प्रतिलेखन, अनुवाद दक्षता, या एक संयुक्त प्रभाव से में परिवर्तन से प्रभावित कर रहे है के अनुसार समूहीकृत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    प्राइमरों अनुक्रम सूचकांक
    3 ' अनुकूलक (१०० एनजी/µ एल) /5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC/
    आरटी प्राइमर pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    आगे पीसीआर प्राइमर AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG
    सूचकांक 1 प्राइमर CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ATCACG
    अनुक्रमणिका प्राइमरी 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT CGATGT
    इंडेक्स प्राइमरी 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TTAGGC
    सूचकांक 4 प्राइमर CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TGACCA
    अनुक्रमणिका प्राइमरी 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ACAGTG
    इंडेक्स प्राइमरी 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT GCCAAT

    तालिका 1:3 ' अनुकूलक और प्राइमर अनुक्रम ।

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    Discussion

    राइबो-Seq दृष्टिकोण विवो में जीनोम-वाइड स्तर 3पर mRNA अनुवाद के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है । इस दृष्टिकोण है, जो एकल codon संकल्प के साथ अनुवाद की निगरानी की अनुमति देता है का उपयोग कर अध्ययन, अनुवाद विनियमन की हमारी समझ में योगदान दिया है । इसके फायदों के बावजूद राइबो-Seq की कई सीमाएं हैं । राइबोसोमल आरएनए (rRNA) टुकड़े हमेशा राइबो-Seq प्रयोगों 9,25में प्राप्त किया जा सकता है कि उपयोगी अनुक्रमण पढ़ता की उपज को कम ribosome-संरक्षित पदचिह्नों के अलगाव के दौरान सह-शुद्ध कर रहे हैं । हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि rRNA संदूषण के रूप में कई के रूप में योगदान कर सकते है 40-50% सभी पढ़ता है (चित्र 8) । इस सीमा को दूर करने के तरीकों में से एक sequencing गहराई को बढ़ाने के लिए है । अनुक्रमण के अतिरिक्त राउंड किया जाना चाहिए पढ़ता अनुक्रमण की आवश्यक संख्या प्रत्येक विश्लेषण नमूनों के लिए प्राप्त की है । हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार sequencing पुस्तकालयों के विश्लेषण से पता चलता है कि अधिक से अधिक ५,०००,००० पदचिह्न पढ़ता प्रत्येक पदचिह्न पुस्तकालय के लिए प्राप्त किया जा सकता है, जब 12 नमूनों एक मानक ५०-बीपी एकल अंत Illumina HiSeq २००० मंच पर चलाने में एक साथ मल्टीप्लेक्स रहे हैं । हालांकि, यदि rRNA के साथ महत्वपूर्ण संदूषण मनाया जाता है, तो एक वैकल्पिक rRNA निष्कासन चरण किया जा सकता है ।

    एक रणनीति के पदचिह्न पुस्तकालयों से rRNA दूषित टुकड़े को दूर करने के लिए biotinylated oligonucleotides के साथ पूर्व 8,26,27वर्णित के रूप में उपश्वसनी संकरण का उपयोग है । वैकल्पिक रूप से, rRNA दूषित पढ़ता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध rRNA कमी किट का उपयोग करके हटाया जा सकता है । इस के लिए, शोधकर्ताओं शुद्ध 3 ' पर rRNA घट प्रदर्शन कर सकते हैं-अनुकूलक-ligated चरण ५.४ से पदचिह्न टुकड़े . rRNA कमी के बाद, पदचिह्न नमूने और उपजी जा सकता है सीधे प्रतिलेखन (चरण 6) के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के लिए इस्तेमाल किया ।

    हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित सुक्रोज ढाल भिन्नीकरण का उपयोग कर monosomes की शुद्धि के अलावा, कई तरीके विकसित किया गया है कि एक स्तंभ का उपयोग-शुद्धि 28 और एक सुक्रोज तकिया के माध्यम से ultracentrifugation-आधारित 8 ,29. हालांकि इन तरीकों को गति कर सकते है पदचिह्न पुस्तकालय की तैयारी की प्रक्रिया और कम तकनीकी रूप से सुक्रोज ढाल अंश की तुलना में चुनौती दे रहे हैं, वे शुद्ध monosomes और nuclease की दक्षता के गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति नहीं है पाचन कदम । हाल ही में, nuclease का चुनाव विभिन्न प्रजातियों में ribosome-संरक्षित आरएनए टुकड़े के शुद्धिकरण की दक्षता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है 30. जबकि RNase मैं खमीर सेल lysates में मजबूत गतिविधि है, अपनी गतिविधि के लिए माउस के ऊतकों में ribosomes की अखंडता को प्रभावित करने के साथ ही फल मक्खियों में दिखाया गया है । इसलिए, विकल्प और nuclease की एकाग्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए जब अंय प्रजातियों के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाने ।

    एक और महत्वपूर्ण विचार अनुवाद अवरोधकों का उपयोग है । ribosome के लिए सबसे प्रोटोकॉल आम तौर पर इस तरह के cycloheximide या harringtonine के रूप में बढ़ाव अवरोधकों, के साथ कोशिकाओं के इलाज शामिल है, क्रम में चलाने को रोकने के लिए सेल कटाई के दौरान ribosomes के बंद 3। अनुवाद अवरोधकों के उपयोग की सीमाओं में से एक यह है कि दवाओं के सेल में उत्तरोत्तर फैलाना, ribosomes के एक प्रगतिशील अवरोध उत्प्रेरण 31। इसके अलावा, दवाओं अनुवाद दीक्षा या समाप्ति को बाधित नहीं है । एक परिणाम के रूप में, ribosomes अधिकतर शुरू codon पर जमा है और बंद codon में समाप्त कर रहे है 8,27,31। आदेश में इस विरूपण साक्ष्य को सीमित करने के लिए, हम फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं को फ्रीज और lysis बफर में निष्कर्षण के समय ही cycloheximide के साथ इलाज के लिए चुना है ।

    रिपोर्टों है कि विभिंन प्रजातियों में राइबो-Seq का उपयोग किया है की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या के बावजूद, राइबो-Seq विश्लेषण प्रदर्शन के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी है । एक परिणाम के रूप में, राइबो-Seq विभिंन प्रयोगशालाओं द्वारा उत्पंन डेटा सीधे तुलना नहीं की जा सकती । उदाहरण के लिए, प्रकाशित ribosome की तुलना के लिए, अध्ययनों के बीच परिणामों में महत्वपूर्ण विसंगतियों का पता चला ३२। यह पिछले कई वर्षों में विकसित प्रोटोकॉल के रूप में किया गया है कि निरंतर सुधार के कारण भाग में है । इसके अलावा, कई शोधकर्ताओं ने इसे अपने अध्ययन या मॉडल प्रणाली 9,25की विशिष्ट जरूरतों को अपनाने के लिए ribosome रूपरेखा प्रोटोकॉल संशोधित । इसके अलावा ribosome रूपरेखा प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से डेटा विश्लेषण और सामान्यीकरण का मानकीकरण, प्रायोगिक पूर्वाग्रहों में से कुछ को रोकने और vivo अनुवाद में से सही और प्रतिलिपि ठहराव को सुनिश्चित करने की अनुमति होगी ।

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    Disclosures

    लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

    Acknowledgments

    यह काम स्वास्थ्य अनुदान AG040191 और AG054566 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा VML को समर्थन दिया गया. इस शोध का आयोजन किया गया था जबकि VML एक दूर अनुसंधान उंर बढ़ने के लिए अमेरिकी संघ से अनुसंधान अनुदान प्राप्तकर्ता था ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
    0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
    0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
    10X TBE buffer Invitrogen AM9863
    10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
    15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
    2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
    2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
    3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
    5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
    8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
    Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
    Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
    Cryogrinder Biospec product 3110BX
    Cycloheximide RPI C81040-5.0
    Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
    Glycogen Invitrogen AM9510
    Gradient fractionation system Brandel BR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
    Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
    Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
    Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
    RNA fragmentation buffer NEB E6186A
    RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
    Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
    ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
    Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
    Sucrose RPI S24060-5000.0
    SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
    Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
    T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
    Thermal cycler Bio-Rad 1851148
    Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
    Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
    UV monitor Bio-Rad 7318160
    Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

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    References

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

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    जैव रसायन अंक १३० आरएनए अनुवाद ribosome profile अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आरएनए-अनुक्रमण Saccharomyces cerevisiae
    Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव
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    Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi,… More

    Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

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