Summary
翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々 は出芽酵母出芽酵母における翻訳の定量分析のための高スループット方法をについて説明します。
Abstract
MRNA のタンパク質への翻訳は、規制のいくつかの層を含む複雑なプロセスです。MRNA 転写の変化蛋白質合成に変更を反映するが、多くの例外を観察されているとしばしば見なされます。最近では、リボソーム プロファイル (またはリボ Seq) と呼ばれる手法は、mRNA の領域はタンパク質とゲノムのレベルで翻訳の定量化に変換されます、精度の高い識別ができる強力な方法として浮上しています。ここでは、出芽酵母リボ Seq を使用して翻訳のゲノムワイドな定量化のための一般的なプロトコルを提案する.また、同時に何千もの同じサンプルの mrna の翻訳効率を定量化し、比較実験への応答でこれらのパラメーターの変更を可能にリボ Seq データ mRNA 豊富な測定と組み合わせること操作または異なる生理学的状態に。ヌクレアーゼ消化、ショ糖勾配分画法によるフット プリントとはそのままリボソーム複合体の分離および DNA ライブラリの準備を使用して適切なと共にディープ シーケンスのリボソーム足跡の生成のための詳しいプロトコルについて述べる生体内で翻訳の正確な分析を確保するために必要な品質を制御します。
Introduction
mRNA の翻訳は、タンパク質発現の調節に重要な役割を果たしている細胞の基本的なプロセスの 1 つです。したがって、mRNA の翻訳は、さまざまな内部および外部生理的刺激1,2への応答では厳重します。ただし、翻訳制御機構のまま流。ここでは、プロファイリング ・ リボソームで翻訳出芽酵母におけるゲノム定量化のプロトコルについて述べる.リボソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、研究し、細胞の異なる条件の下で特定の Mrna の翻訳を定量化することです。このテクニックは、ゲノム全体のリボソーム占有率を定量的に解析する次世代シーケンスを使用して、タンパク質合成生体内単一コドン解像度3,4の率を監視できます。現在、このメソッド タンパク質翻訳のレベルを測定する最も先進的な手段を提供して他の現在利用可能な技術、マイクロ アレイなどによって明らかにすることができない情報を提供する便利な検出ツールをあると証明したか翻訳の状態配列解析 (TSAA) 5。リボソームのプロファイリングと並進出力のトラン スクリプト レベルでそれらの変更内容をレポートとしてそれはまた他の方法と比べて多くの高い感度を提供します。
このアプローチは、リボソームで保護された mRNA の断片3のディープ シーケンスに基づいています。リボゾームの保護タンパク質翻訳中 〜 (足跡と呼ばれる) mRNA の6の 28 の nt 部分。リボソームで保護されたフラグメントのシーケンスを決定すると、リボ Seq は翻訳 mRNA にリボソームの位置をマップし、積極的にタンパク質3,7と訳されるが mRNA のどの領域を確認できます。さらに、特定の mRNA のコピーに揃える足跡の数をカウントすることによって mRNA の翻訳定量的測定できます。
リボソーム保護断片を分離するためにセル lysates は当初リボヌクレアーゼ消化続いてリボソームを失速する翻訳阻害剤と扱われます。無料の mRNA およびリボゾームによって保護されていない翻訳 Mrna の部分はリボヌクレアーゼによって低下するのに対し、フット プリントとはそのままリボソーム複合体を浄化することによって mRNA のリボソーム保護断片を回復できます。これらの mRNA の足跡は cDNA ライブラリに変換し、ディープ シーケンス (図 1) によって分析します。リボソームのプロファイリングに並行して、そのまま mRNA を同じサンプルから抽出してシーケンスします。リボ Seq mRNA 豊富な測定と識別される翻訳のレベルを比較すると、特にアップ- または調整される翻訳のレベルでは、ある遺伝子を識別し、ゲノム全体のレベルでの mRNA の翻訳の効率を計算できます。この資料で説明されているプロトコルはイースト菌の特定が、他のシステムでリボ Seq プロトコルを確立しようとして、研究者の役に立つまたする必要があります。
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Protocol
1. エキスの準備
- YPD プレート (1% 酵母エキス、2% ペプトン、グルコース 2%、2% 寒天培地) に単一コロニーのため凍結する在庫から連勝酵母菌。2 日間の 30 ° C で版を孵化させなさい。
- 50 mL の円錐形遠心管中の ypd 培地 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% グルコース) 15 mL に YPD プレート (単一コロニーを使用) から酵母を接種して 30 ° C に (200-250 rpm) を振動で一晩成長
- 文化を 2 L の滅菌フラスコ ypd 培地 500 mL に希釈して OD600 < 0.1。外径 φ600まで 3-5 h 30 ° C で揺れで酵母を育てる = 0.5 (中間ログ フェーズ)。
- 0.45 μ m メンブラン フィルター ガラス ホルダー フィルターのアセンブリを使用してフィルタ リングによって細胞を収集します。へらで、液体窒素で凍結、ペレットをこすり、-80 ° C で保存冷凍餌の予想サイズが 〜 0.2 - 0.5 g。
注意: 液体窒素は超低温です。適切な保護具を着用します。 - 新鮮な換散バッファーを準備 (20 mM トリス塩酸 pH 8.0、140 mM KCl、5 mM MgCl2, 100 μ g/mL シクロヘキシミド、0.5 mM DTT、1% トリトン X-100)、使用の直前に氷の上を保ちます。
- 3 クロム鋼ビーズ (3.2 mm) を 1.8 mL ステンレス チューブに入れます。あらかじめ液体窒素で冷やすと冷凍餌を追加、シリコーン ゴム製のキャップでカバーします。10 cryogrinding でサンプルを均質で 4200 rpm; s10 回繰り返します。少なくとも 10 の液体窒素で管を冷やす各ラウンド間 s。
注: 凍結サンプルを常に保つために重要です。 - 1 mL の溶解バッファーを追加、ピペッティングでよく混ぜます。新しい 1.5 mL チューブに移します。
- 4 ° C で 5 分間 20,000 × g で遠心します。一方氷に取り組んで、新しい 1.5 mL チューブに上清を転送します。ライセートの 100 μ L を多 mRNA の分離のための新しい 1.5 mL チューブに転送します。すぐに RNA の隔離またはフラッシュ凍結液体窒素でチューブを続行します。メジャー OD260 lysate の残りの足跡の抽出を使用すると、フラッシュは、液体窒素でチューブを固定します。ストア-80 ° C の溶解液
2. 足跡の抽出
- サッカロースの勾配の準備
- 50%、40%、30%、20%、10% のショ糖勾配バッファー (20 mM トリス塩酸 pH 8.0、140 mM KCl、5 mM MgCl2, 100 μ g/mL シクロヘキシミド、0.5 mM DTT) のソリューションを準備します。
- 13.2 mL 薄肉 polyallomer チューブの底に準備された 50% ショ糖バッファーの 2.2 mL のピペット、-80 ° C (図 2) で 10 分のためのソリューションを凍結します。2.2 mL の冷凍 50% ショ糖バッファー上に 40% ショ糖バッファー層し、-80 ° C で 10 分間凍結互いの上にバッファー層 30%、20% そして 10% ショ糖、同じ説明を次します。階層化しながら気泡を避けます。使用するまで-80 ° C でグラデーションをしてください。サッカロースの勾配を実験前に少なくとも 1 日の準備し、-80 ° C で保存する必要があります。
- ヌクレアーゼ消化
- 雪解けのサッカロースの勾配 4 ° C での実験の前に、の夜
- 細胞ライセート (フット プリント サンプル) 氷の上を解凍します。細胞ライセートを新しい 1.5 mL チューブ 50 OD260台を含むの因数を転送し、新鮮な換散バッファーを追加 1 mL まで。残りのライセート-80 ° C で保存します。10 μ L を追加 RNase 私 (100 U/μ L) とかかとの頭以上の回転子の緩やかな回転と室温で 1 時間インキュベートします。
- (省略可能)4 ° C で 5 分間 20,000 × g でサンプルを明確にし、新しい 1.5 mL チューブに上清を回復します。
- 超遠心法
- 軽くレイヤーのライセート サンプル 10-50% ショ糖密度勾配の上に。
- 超遠心機、polyallomer チューブ 210,000 x g (35,000 rpm) SW 41 Ti ローター 3 h の 4 ° c で。
- グラデーションの分別システム セットアップ
- コンポーネントをオンに、少なくとも 30 分間のウォーム アップ UV モニターを許可します。
- デジタル レコーダー ソフトウェアを使用してコンピューター上のソフトウェアを起動-0.01 と 1 にグラフの上限を設定します。
- 追跡ソリューション (トリス塩酸 pH 8.0、140 mM KCl、5 mM MgCl260% ショ糖 20 mM) と注射器を埋める、注射器、カニューレ内部空気の泡を削除します。
- RNase フリーの水で満たされた遠心チューブをインストールします。2 つの黒のマークを見ることができるまで、カニューレのチューブに穴を開けます。1 mL/分でシリンジ ポンプを起動します。
- 水は、フローセルを通過すると、0 にベースラインを調整する UV モニターの「自動ゼロ」ボタンを押します。UV モニターの感度を設定"2.0 AU」。安定したベースラインが設定されている後は、シリンジ ポンプを停止します。追跡ソリューションを回復し、遠心管を削除します。
- Monosome 分離
- インストールし、含むショ糖密度勾配超遠心機チューブに穴を開けます。1 mL/分でシリンジ ポンプを起動、254の値の監視は 1 mL の一部分を収集します。プールの 1 つの管に 80 年代の monosome ピークを表す分数、氷上 (図 3) を保ちます。
- 追跡ソリューションのフロー ・ セルに達すると、シリンジ ポンプを停止します。追跡ソリューションを回復し、遠心管を削除します。2.5.1 のステップで始まるサンプルの残りの部分に分別を繰り返します。
注: 完了したら、きれいに RNase フリー水の少なくとも 30 ml 分別システム。チューブ、シリンジと暖かい水ですべてのリムーバブル コンポーネントを徹底的に洗います。 - 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で 0.5 mL 遠心フィルター (MWCO 100 kDa) を分数をフィルターしフローを破棄、ボリュームが繰り返して < 100 μ L。解放バッファー (20 mM トリス塩酸 pH 7.0、2 ミリメートルの EDTA、40 U/mL RNase 阻害剤) の 400 μ L を追加します。ピペッティング、ミックスを孵化させなさい氷の 10 分、新しいコレクション チューブ ユニットに転送します。4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離し、流れを収集します。
- フット プリント フラグメント精製
- フロースルー含む足跡 RNA 断片 (を最終濃度 1% の)、SDS ミックス注 20% の 20 μ L を追加、新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- 酸の 1 ボリュームを追加-フェノール: クロロホルム (pH 4.5)、10 の渦 s。
注意: 酸-フェノール: クロロホルムは有毒である、吸入、皮膚との接触を避けます。 - 65 ° C 5 分で保温、1 分 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプル遠心分離のための氷の上に置く、水相 (上) を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 100% のエタノールの 2.5 倍量の 1/10 ボリュームを追加することによってフット プリントの RNA のフラグメントを沈殿させます。
3. 多 mRNA の抽出
- 総 RNA の抽出
- 細胞ライセート (総 RNAサンプル) 氷の上の 100 μ 因数を解凍の 20% (を最終濃度 1% の)、SDS ミックス ピペッティングの 20 mM トリス塩酸 pH 7.0 と 20 μ L 300 μ L を追加します。
- 酸の 1 ボリューム (400 μ L) を追加-フェノール: クロロホルム (pH 4.5) と 10 の渦 s。
- 65 ° C 5 分で保温、1 分 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプル遠心分離のための氷の上に置く、水相 (上) を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- 2 番目のフェノールの抽出を実行します。酸の 1 ボリュームを追加-フェノール: クロロホルム (pH 4.5) 65 ° C 5 分で 10 s. 熱の渦を入れて 1 分 4 ° C で 5 分間遠心 12,000 × g でサンプルのため氷の上、水性相を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- RNA の沈殿物します。このため 3 M NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 100% のエタノールの 2.5 倍量の 1/10 ボリュームを追加します。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
- 多 mRNA 分離
- 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で RNA のサンプルを遠心分離機、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s がゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除し、空気乾燥 5 分のペレット。
- 300 μ L のポリ a mRNA 分離キットから換/結合バッファーでペレットを溶解します。多 mRNA 分離キット製造元のプロトコルに従って多 mRNA の抽出に進みます。
- 3 M NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 100% のエタノールの 2.5 倍量の 1/10 ボリュームを追加することによって mRNA サンプルの沈殿物します。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
- mRNA の断片化
- 遠心分離機の 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で mRNA サンプル、エタノールを削除します。30 秒スピンダウン、ゲルの読み込みとエタノールの残りの部分を削除のヒント、空気乾燥させて 5 分のペレット。
- RNase フリー水の 18 μ L で mRNA を再懸濁します、RNA 断片化バッファー x 10 の 2 μ L を追加します。94 ° C で 5 分間加温します。氷にチューブを転送します。
- 3 M NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 100% のエタノールの 2.5 倍量の 1/10 ボリュームを追加することによって沈殿させます。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
4. 脱燐酸化
- フット プリントと T4 ポリヌクレオチド キナーゼと断片化された mRNA サンプルを扱います。このため、遠心分離機のサンプル 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s がヒントを読み込んでゲルとエタノールの残りの部分を削除します。エアコンは、5 分のペレットを乾燥させます。
- 水の 7.75 μ L でペレットを再懸濁します、10 x T4 ポリヌクレオチド キナーゼバッファーの 1 μ L、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (10,000 U/mL) の 1 μ L と RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 0.25 μ L を追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- (省略可能)1 x TBE バッファーを使用して 15 分間 180 V で 15 %tbe 尿素ゲルを実行済み。
- 各フット プリントと mRNA サンプルの 10 μ L に 2 X TBE 尿素サンプルバッファーの 10 μ L を追加します。10 μ M サイズ マーカー オリゴヌクレオチドの 1 μ L を含むコントロールのサンプルを準備 (32 nt)、10 μ M より低いサイズ マーカー オリゴヌクレオチドの 1 μ L (28 nt)、8 μ L 水と 2 x フット プリント サンプルの TBE 尿素サンプルバッファーの 10 μ L。10 μ M RNA マーカー オリゴヌクレオチドの 1 μ L を含むコントロールのサンプルを準備 (63 nt)、9 μ L 水と mRNA サンプル TBE 尿素サンプル バッファー x 2 の 10 μ L。
- サンプルやコントロール 75 ° C で 3 分間インキュベート、スピン ・ ダウン、1 分 15 %tbe 尿素ゲルの 2 井戸、1 時間 180 V でゲルの電気泳動によって別の RNA のフラグメントに各サンプルを読み込むために氷を置きます。
- 核酸ゲル染色 (水で希釈 10,000 x) で 5 分のためのゲルを染色、光から保護します。
- 28 と 32 の nt マーカー フット プリントのサンプル (図 4 a) とその周辺の間適切なバンドをカット ブルー光 transilluminator を用いた mRNA の 50-70 nt はきれいなかみそりの刃で (図 4 b) をサンプリングします。少なくとも 10 分-80 ° c ポリアクリルアミドのゲル部分を固定します。
- とおりポリアクリルアミドゲルから RNA を抽出します。2 分の 70 ° C でゲル部分の熱は、使い捨てのペレットの乳棒を使用してゲルを挽きます。300 μ L の溶出バッファー (20 mM トリス塩酸 pH 7.0、2 ミリメートルの EDTA) と RNA を溶出 1 μ L RNase 阻害剤 (20 U/μ L) を追加し、37 ° C 3 時間で孵化させなさい。
- 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプルを遠心、上清を収集し、追加 1/10 量 NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 2.5 倍量の 100% エタノールを引き起こしましょう。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
5. 3'-アダプター結紮
- 4 ° C で 30 分間 20,000 × g では、フット プリントと mRNA サンプルを遠心分離機、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s ゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除します。空気は、10 分のペレットを乾燥させます。
- ヌクレアーゼ フリー水 4.75 μ でペレットを再懸濁します、50 %peg8000、10 X T4 RNA リガーゼのバッファーの 1 μ L、3'-アダプター (100 ng/μ L)、RNase 阻害剤 (20 U/μ L)、1 μ L の RNA T4 リガーゼ 2 の 0.25 μ L の 1 μ L の 2 μ L 切り捨て KQ (200,000 U/mL)。16 ° C で一晩インキュベートします。
- 次の朝は、ligation の反作用に直接 5'-deadenylase (10 U/μ L) の 0.5 μ L と Rec J exonuclease (10 U/μ L) の 0.5 μ L を追加することによりアダプターの過剰を削除します。30 ° C で 30 分間インキュベートします。
- サンプルの沈殿物します。このため、ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ、1 μ L グリコーゲン (10 mg/mL)、NaOAc (pH 5.5) の 1/10 量、100% のエタノールの 2.5 倍の量を追加します。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
6. 逆のトランスクリプション
- 遠心分離機のサンプル 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s ゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除します。空気は、10 分のペレットを乾燥させます。
- ヌクレアーゼ フリー水の 11.5 μ L でペレットを再懸濁します、8 μ M の逆のトランスクリプションのプライマー (RT プライマー) の 0.5 μ、1 μ L の dNTP ミックス (10 mM) を追加します。65 ° C で 5 分間加温、氷の場所します。
- 最初の鎖バッファー、0.1 M の DTT、RNase 阻害剤 (20 U/μ L)、逆転写酵素 (200 U/μ L) の 0.5 μ L の 0.5 μ L の 2 μ L X 5 の 4 μ L を追加します。65 ° C、80 ° C で 5 分間で 1 分 48 ° C で 30 分間インキュベートします。
- 沈殿しないと 2 M NaOH の 0.8 μ L を追加することによって、RNA の加水分解にすぐに進み、98 ° C で 30 分間加温0.8 μ l 添加 2 M 塩酸反応を中和するために。
- サンプルの沈殿物します。
7. 環状
- 遠心分離機のサンプル 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s がゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除し、空気乾燥 10 分のペレット。
- ヌクレアーゼ フリー水の 16.75 μ L でペレットを再懸濁します。単一座礁させた DNA リガーゼ バッファー、一本鎖 Dna リガーゼの 50 mM MnCl2 0.25 μ L の 1 μ L x 10 の 2 μ L を追加 (100 U/μ L)。60 ° C、80 ° C で 10 分間で 1 時間インキュベートします。沈殿しないし、-20 ° C で ssDNA ライゲーション反応生成物の保存
8. Pcr ライブラリ
- 氷の上の作業は、PCR チューブで、次を混在させる: ヌクレアーゼ フリー水、20 μ M 前方プライマー、20 μ M インデックスを逆プライマーの 2 μ L、忠実度の高い DNA plymerase バッファー、dNTPs (10 mM) の 4 μ L、一本鎖 Dna ライゲーション反応生成物の 4 μ L x 5 の 40 μ L の 2 μ L の 146 μ L、、忠実度の高い DNA ポリメラーゼの 2 μ L。配列の多重がサンプルごとに異なるインデックスを逆プライマーを選択します。4 新しい PCR チューブ PCR の混合物の 50 μ 因数に転送します。
- さまざまな数 (8、10、12、14) サイクルの PCR 増幅を実行次の設定を使用して。
初期変性の 98 ° C で 1 分
8 に 14 サイクル:
15 94 ° C で s
5 55 ° c s
10 65 ° c s
65 ° C 最終的な拡張で 2 分 - 3 M NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 100% のエタノールの 2.5 倍量の 1/10 ボリュームを追加することによって PCR の製品の沈殿物します。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
- 遠心分離機のサンプル 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s がゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除し、空気乾燥ペレット。
- ヌクレアーゼ フリー水の 8 μ L でペレットを再懸濁します、核酸サンプル バッファー x 5 の非変化の 2 μ L を追加します。非変化の 8 %tbe ゲルの 1 のサンプルをロードします。35 分の 150 V でゲルの電気泳動によって DNA の製品を分離します。コントロールとして含む 0.5 μ L 10 bp の DNA の梯子 (1 μ g/μ L)、7.5 μ L 水および非変化 5 核酸サンプル バッファー倍 2 μ L のサンプルを準備し、ゲルの別の車線に実行します。
- 核酸ゲル染色 (水で希釈 10,000 x) で 5 分のためのゲルを染色、光から保護します。バンド約 150 カット ブルー光 transilluminator を使用してフット プリントのサンプルと約 180 の bp bp きれいなかみそりの刃を持つ mRNA サンプル (図 6)。少なくとも 10 分-80 ° c ゲル断片を格納します。
- 2 分の 70 ° C でゲル部分の熱は、使い捨てのペレットの乳棒を使用してゲルを挽きます。20 mM トリス塩酸 pH 7.0 の 300 μ L の DNA を溶出し、37 ° C 3 時間で孵化させなさい。
- 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプルを遠心、上清を収集し、追加 1/10 量 NaOAc (pH 5.5)、グリコーゲン (10 mg/mL) の 1/100 ボリュームと 2.5 倍量の 100% エタノールを引き起こしましょう。少なくとも 1 時間-20 ° C で孵化させなさい。
- 遠心分離機のサンプル 4 ° C で 30 分間 20,000 × g で、エタノールを削除します。30 スピンダウン最大速度で s がゲルの読み込みヒントとエタノールの残りの部分を削除し、空気乾燥ペレット。最後に、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L でライブラリを再懸濁します、数量、品質管理、シーケンスに進みます。
9. 図書館の定量化と高スループット シーケンス
- シークエンシングのためのサンプルを送信する前に PCR 増幅ライブラリの品質と収量を決定します。フット プリントや mRNA シーケンス ライブラリの代表的なプロファイルは、図 7のとおりです。PCR 増幅ライブラリの予想サイズはフット プリント サンプルの 148-152 bp と mRNA サンプル 170-190 bp。
- バーコードが異なるといくつかのサンプルは、配列のためプールが場合、は、qPCR 法シーケンス ライブラリ定量アッセイを使用してライブラリの正確な定量化を実行します。
- 等モル比でライブラリをプールします。プールのサンプルの合計数 × 3 μ L としてプールの容量を計算します。ライブラリは、プールの 10 nM の最終的な集中を達成するために等モル比で混合されるので、追加する必要があります各ライブラリのボリュームを決定します。新しい 1.5 mL チューブに各ライブラリの計算されたボリュームを追加、ピペッティングで混ぜます。計算された総容積を達成するために水を追加します。-20 ° C でプールされたライブラリを格納します。
- イルミナ シーケンス プラットフォームで実行 50 bp シングル エンド配列を使用して配列されるプールされたライブラリの因数を送信します。我々 は日常的に単一シーケンスを実行すると、どの利回りで 12 個の試料を多重化 〜 シーケンス レーンあたり 2 億を読み取ります。
注: 足跡読み取り各サンプルごとに収集の最終的な数は入力材料の量と rRNA 汚染のレベルに依存します。
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Representative Results
詳細なプロファイルデータ リボソームの構造バイオ情報解析パイプラインをされている8,9で説明しました。さらに、いくつかの研究グループの差動遺伝子発現解析とシーケンス データをプロファイリング方法10、11,12 リボソームに固有の処理のためのバイオインフォマティクス ツールを開発しています。 ,13,14,15,16,17,18。リボ Seq データの分析の最初のステップは逆多重化、3' アダプター シーケンス Cutadapt ソフトウェア19を使用して AGATCGGAAGAGCACACGTCT をトリミングします。非コード Rna が、rRNA、tRNA、ボウタイ20を使用して汚染シーケンスを削除するなどに対して配列読み取りを配置するし、合っていない読み取り、酵母ゲノムにマップされます。HTseq カウント ソフトウェア21、によって評価される、遺伝子あたり数と発現遺伝子が DESeq2 22を使用して読みます。
図 8は、私たちのプロトコルを使用して得られた hbs1Δ 23,24の酵母削除の変異における翻訳の定量的分析の代表的な結果を示します。まず、数および野生型細胞と hbs1Δ 変異株の生成されたフット プリントと mRNA のライブラリをシーケンス処理後に得られる非コード RNA (Rrna など) に対応する読み取りの割合を検討しました。任意 rRNA 枯渇の手順 (以下で説明)、50 から私たちのフット プリント ライブラリは、フット プリントのリボソーム保護断片 (図 8 a) に対応のすべてのシーケンスされた読み取りの 60% がなくても分かった。対照的に、rRNA 由来のフラグメントの 3% だけは多 mRNA 分離できる rRNA 読み取りの効果的な除去であることを示す mRNA ライブラリで観察されました。一緒に、フット プリント サンプルの各以上 1000 万のフット プリントの読み取りを取得することができましたで 2 複製シーケンスを処理します。通常ライブラリ生成のばらつきとデータの再現性を評価するために、各実験条件ごとに少なくとも 2 つの独立した生物学的複製を分析します。フット プリントと mRNA サンプル ライブラリ表示ピアソン相関係数 R 良い再現性 〜 一致するサンプル (図 8 b) 間 0.99。
リボソームのプロファイリングで、ゲノム全体のレベルでのタンパク質翻訳のレベルを評価するに加え、実験条件3間の翻訳効率の変化を測定できます。このため、(リボヌクレアーゼとは扱われない) 細胞ライセートの因数は多 mRNA の単離と RNA シーケンス ライブラリの準備に使用されます。MRNA の変化によって調整される遺伝子を識別するためにリボ Seq と RNA Seq データセットを直接比較できます同じ制御された条件下で準備されますフット プリント ライブラリと RNA シーケンス ライブラリの両方がそれぞれの個々 の複製にたどることができるので、転写、翻訳の効率、または相乗効果。Hbs1Δ 変異体のタンパク質翻訳のレベルで具体的にアップまたはダウン-規制である遺伝子を識別するために、変更の計算翻訳の効率で各遺伝子 (図 8) の mRNA rpkm でフット プリント rpkm 値を割った。
図 1: リボ Seq プロトコルの概要。全体のプロトコルは、約 11 日で実行できます。各手順の推定時間が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サッカロースの勾配の準備この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的なショ糖勾配プロファイル。(A)コントロールのショ糖勾配プロファイルを取得 (と扱われない RNase 私) サンプル。(B)リボソーム保護 RNA 断片を抽出するためにセル lysates は RNase で処理されて私は室温 (RT) で 1 時間。Monosomal のピークに対応する分数は、足跡の抽出のため、収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: T4 ポリヌクレオチド キナーゼ治療後 15% のポリアクリルアミドゲルの代表的な画像を取得します。(A)フット プリント サンプルの 28 と 32 nt 周り摘出ゲルのスライスのサイズが表示されます。(B)カット ゲルのスライスについて mRNA サンプルの 50-70 nt。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 10% ポリアクリルアミドゲルの代表的なイメージは、逆のトランスクリプションの後得られた。(A)カット上部バンド 〜 128 nt フット プリント サンプルは、逆のトランスクリプションの製品に対応します。(B)カットの周りのバンド 150 170 nt mRNA サンプル (上部バンド)。下のバンドは、RT プライマーに対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ライブラリの PCR 増幅のポリアクリルアミド ゲルの浄化します。ライブラリ増幅の 8、10、12、および 14 のサイクル後に得られる PCR の製品は解決された非変化 8 %tbe ゲル。フルレングスのフット プリント ライブラリのサイズは ~ 150 bp、mRNA のライブラリのサイズは 170 ~ 190 跪く挿入が含まれていない下のバンドを避けるため。
図 7: バイオアナライザー解析します。PCR 増幅フット プリント ライブラリの(A)代表バイオアナライザー プロファイル。フット プリント ライブラリの平均サイズは 148 ~ 152 に期待される nt。 (B) mRNA サンプルの配列ライブラリの代表バイオアナライザー プロファイルを取得します。予想される mRNA ライブラリのサイズは 170-190 ntこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 8: 代表結果。(A)野生型のサンプルおよび hbs1Δ 変異体 mRNA、フット プリント、および rRNA の読み取りの数です。野生型細胞と hbs1Δ 変異体の 2 つの生物を複製シーケンスによって生成された読み取りの合計数が表示されます。(B) 2 つのフット プリントと mRNA 豊かさの測定の再現性をレプリケートします。ピアソンの相関係数 (R) が示されます。(C)転写制御と hbs1Δ 変異体の並進変化。大幅調整し、調整される遺伝子 hbs1Δ の mRNA の転写、翻訳効率の変化することの相乗効果によって影響を受ける彼らかどうかに従ってグループ化されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プライマー | シーケンス | インデックス | ||||
| 3' アダプター (100 ng/μ L) | /5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC/ | |||||
| RT プライマー | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| 前方の PCR プライマー | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| インデックス プライマー 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| インデックス入門 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| インデックス入門 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| インデックス プライマー 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| インデックス プライマー 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| インデックス入門 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
表 1: 3 ' アダプターおよびプライマー シーケンス。
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Discussion
リボ Seq アプローチは、mRNA 翻訳体内でゲノムのレベル3の解析のための強力な技術として浮上しています。シングル コドン解像度変換を監視でき、この手法を使用して研究は翻訳制御の私達の理解に貢献しています。その利点にもかかわらずリボ Seq いくつか制限があります。リボソーム RNA (rRNA) フラグメントは、リボソーム保護足跡リボ Seq 実験9,25で得ることができる便利な配列読み取りの収量の減少の分離中に常に共同浄化されました。我々 のデータは、rRNA 汚染は、すべての読み取り (図 8) の 40-50% に貢献できることを示しています。この制限を克服する方法の 1 つは、シーケンス処理深さを増やすことです。シーケンスの追加のラウンドは、各分析サンプルの配列読み取りの必要な数を達成するまで行わなければなりません。我々 のプロトコルを使用したシーケンス ライブラリの分析では、12 個の試料を多重化イルミナ HiSeq 2000 プラットフォーム上で実行標準 50 bp シングル エンドのとき以上 500 万面積読み取りフット プリント ライブラリごとに得られることを示しています。ただし、rRNA と重要な汚染が観測されると、オプションの rRNA の取り外し手順が実行できます。
フット プリント ライブラリからフラグメントの汚染 rRNA を削除する戦略の 1 つは、 8,26,27を前述のように、ビオチン標識オリゴヌクレオチドとサブトラクティブ ハイブリダイゼーション法を使用します。また、市販の rRNA の枯渇のキットを使用して読み取りを汚染 rRNA を削除できます。このため、研究者はステップから精製された 3'-アダプター-結紮フット プリントの断片の上 rRNA 枯渇を実行できます5.4 。次の rRNA の枯渇、フット プリント サンプルを沈殿し、プロトコルで説明されているように逆のトランスクリプション (手順6) のために直接使用することができます。
ショ糖勾配分別のプロトコルで説明を使用して monosomes の浄化だけでなく方法がいくつか開発されている列に基づく浄化28とショ糖クッション8 を介して遠心を利用 ,29。これらのメソッドは、フット プリント ライブラリの準備のプロセスをスピードアップすることができ、ショ糖勾配分画と比較して以下の技術的に挑戦している、彼らと許可しない精製 monosomes の質的分析、ヌクレアーゼの効率消化手順です。最近、ヌクレアーゼの選択は種30リボソーム保護 RNA 断片の精製の効率に影響を与える示されています。一方、ショウジョウバエの同様、マウス組織のリボソームの整合性に影響を与える酵母細胞ライセート、その活動で堅牢な活動を RNase を示されています。したがって、選択とヌクレアーゼの集中は、他の種にこのプロトコルを採用するときに最適化する必要があります。
もう一つの重要な考慮事項は、翻訳阻害剤の使用です。リボソームのプロファイリングのためのほとんどのプロトコルは通常収穫3セル中のリボソームの流出を防ぐために細胞伸長阻害剤, シクロヘキシミドや harringtonine などの治療を含みます。翻訳阻害剤の使用の制限の 1 つは、薬拡散徐々 にセルで、リボソーム31の進行抑制を誘導です。また、翻訳の開始または終了、薬は抑制しません。結果として、リボソームは過度に開始コドンで蓄積し、停止コドン8,27,31に使い尽くされます。このアーティファクトを制限するために我々 はフラッシュすることを選んだセルを液体窒素で凍結し、換散バッファーのみで抽出時シクロヘキシミドと扱います。
様々 な種のリボ Seq を利用して報告数が比較的大きいにもかかわらずリボ Seq 解析を実行するための標準プロトコルを欠いています。その結果、異なった実験室で生成されたリボ Seq データを直接比較できません。たとえば、データセットをプロファイリング公開されたリボソームの比較研究32の間で結果に重要な矛盾を明らかにしました。これは過去数年にわたって進化してプロトコルとしてなされた継続的な改善の一部によるものです。また、多くの研究者は、リボソームの研究またはモデル システム9,25の特定のニーズにそれを採用するプロトコルをプロファイルを変更しました。さらに同様のプロトコルをプロファイリング リボソームの標準化データの解析と標準化、実験的先入観のいくつかを防ぐことを許可して生体内で翻訳の正確かつ再現可能な数量を確保します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この仕事は健康補助金 AG040191 と VML に AG054566 研究機構によって支えられました。VML が加齢医学研究のためのアメリカ連合から遠く研究助成受信者間に調査しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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