Summary
Translasjonsforskning regulering spiller en viktig rolle i kontrollen av protein overflod. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for kvantitativ analyse av oversettelse i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Oversettelse av mRNA til proteiner er en kompleks prosess som involverer flere lag av regulering. Det er ofte antatt at endringer i mRNA transkripsjon gjenspeile endringer i proteinsyntese, men mange unntak er observert. Nylig en teknikk kalt ribosom profilering (eller Ribo-Seq) har dukket opp som en kraftfull metode som tillater identifikasjon, med høy nøyaktighet, hvilke områder av mRNA er oversatt til proteiner og kvantifisering av oversettelse på genomet hele nivå. Her presenterer vi en generalisert protokoll for genomet hele kvantifisering av oversettelse med Ribo-Seq i spirende gjær. I tillegg tillater kombinerer Ribo-Seq data med mRNA overflod målinger oss å kvantifisere samtidig oversettelse effektivitet av mRNA utskrifter i samme utvalget og sammenligne endringer i disse parameterne svar på eksperimentell manipulasjoner eller i forskjellige fysiologiske stater. Vi beskriver en detaljert protokoll for generering av ribosom fotavtrykk bruker nuclease fordøyelsen, isolasjon av intakt ribosom-fotavtrykk komplekser via sukrose gradient fraksjoneres og utarbeidelse av DNA biblioteker for dyp sekvensering med riktig kvalitetskontroll er nødvendig for å sikre nøyaktig analyse av i vivo oversettelse.
Introduction
mRNA oversettelse er en grunnleggende prosesser i cellen, som spiller en viktig rolle i regulering av protein uttrykk. Derfor er mRNA oversettelse strengt kontrollert svar til ulike interne og eksterne fysiologiske stimuli 1,2. Imidlertid fortsatt mekanismer av translasjonsforskning regulering lite studert. Her beskriver vi protokollen for genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering. Det overordnede målet med ribosom profilering teknikken er å studere og kvantifisere oversettelsen av bestemte mRNAs under ulike mobilnettet forhold. Denne teknikken bruker neste generasjons sekvensering kvantitativt analysere ribosom innkvartering i genomet og tillater overvåking frekvensen av protein syntese i vivo på enkelt codon oppløsning 3,4. Foreløpig denne metoden er den mest avanserte å måle nivåene av protein oversettelsen, og har vist seg for å være et nyttig funn verktøy informasjon som ikke kan avsløres av andre tilgjengelige teknikker, f.eks microarrays eller oversettelse staten matrise analyse (TSAA) 5. Som ribosom profilering rapporter om kombinerte endringene i transkripsjon nivåer og translasjonsforskning utgang, gir det også mye større sensitivitet sammenliknet med andre metoder.
Denne tilnærmingen er basert på dyp sekvensering av ribosom-beskyttet mRNA fragmenter 3. Under oversettelsen er protein, ribosomer beskytte ~ 28 nt deler av mRNA (kalt fotavtrykk) 6. Ved å bestemme rekkefølgen av ribosom-beskyttet fragmenter, kan Ribo-Seq tilordne plasseringen av ribosomer på den oversatte mRNA og identifisere hvilke områder av mRNA er sannsynlig å bli aktivt oversatt til protein 3,7. I tillegg kan vi kvantitativt mål oversettelsen av mRNA ved å telle antall fotavtrykk som sammenfaller med en gitt mRNA transkripsjon.
For å isolere ribosom-beskyttet fragmenter, behandlet celle lysates først med en oversettelse hemmer båsen ribosomene etterfulgt av ribonuclease fordøyelsen. Mens gratis mRNA og deler av oversatt mRNAs ikke beskyttet av ribosomer er degradert av ribonuclease, gjenopprettes ribosom-beskyttet mRNA fragmenter av rensing intakt ribosom-fotavtrykk komplekser. Disse mRNA fotavtrykk deretter konvertert til cDNA bibliotek og analyseres av dyp sekvensering (figur 1). Parallelt med ribosom profilering, er intakt mRNA Hentet fra samme prøven og sekvensielt. Ved å sammenligne nivået av oversettelse identifisert av Ribo-Seq med mRNA overflod målinger, kan vi identifisere gener som er spesielt opp - eller ned-regulert på nivå med oversettelse og beregne oversettelse effektivitet av mRNA på genomet hele nivå. Mens beskrevet i denne artikkelen er spesifikke for gjær bør det være også nyttig for forskerne som vil prøve å etablere Ribo-Seq protokollen i andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ekstra forberedelse
- Strek gjær påkjenningen fra frosne aksjer for enkelt kolonier på YPD plater (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose og 2% agar). Inkuber platene på 30 ° C i 2 dager.
- Vaksinere gjær fra en YPD plate (bruk en enkelt koloni) til 15 mL YPD medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose) i et 50 mL konisk sentrifuge rør og vokse over natten med risting (200-250 rpm) på 30 ° C.
- Fortynne kultur i 500 mL YPD medium i en 2 L sterilt kolbe, slik at OD600 < 0.1. Vokse gjærceller med skjelvende på 30 ° C i 3-5 h til OD600 = 0,5 (midten av Logg fase).
- Samle celler ved å filtrere gjennom 0,45 μm membran filtre ved hjelp av en glass holder filteret forsamlingen. Skrap pellet med en slikkepott, flash fryse i flytende nitrogen, og lagre på-80 ° C. Forventet frosset pellets er ~ 0.2 - 0,5 g.
Forsiktig: Flytende nitrogen er ekstremt lav temperatur; Bruk passende beskyttelse. - Forberede en fersk lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL gapestokk, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) umiddelbart før bruk, holde på is.
- Sette 3 krom-stål perler (3,2 mm) i en 1,8 mL rustfritt stålrør. Pre chill i flytende nitrogen og legge frosset pellets, dekk med en silikon gummi cap. Homogenize prøven ved cryogrinding for 10 s på 4º200 rpm; Gjenta 10 ganger. Chill røret i flytende nitrogen i minst 10 s mellom hver runde.
Merk: Det er viktig å alltid holde utvalget frosset. - Legg 1 mL av lyseringsbuffer, bland godt pipettering. Overføre til en ny 1,5 mL tube.
- Sentrifuger 20.000 x g i 5 min på 4 ° C. Mens du arbeider på is, overføre nedbryting til en ny 1,5 mL tube. Overføre 100 μL lysate til en ny 1,5 mL tube poly(A) mRNA isolering. Fortsett rett til RNA isolasjon eller flash fryse røret i flytende nitrogen. Mål OD260 resten av lysate, som skal brukes for fotavtrykk utvinning, og flash fryse rør i flytende nitrogen. Lagre lysates på-80 ° C.
2. plass utvinning
- Utarbeidelse av sukrose graderinger
- Klargjør løsninger for 50%, 40%, 30%, 20% og 10% sukrose Gradient buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL gapestokk, 0,5 mM DTT).
- Pipetter 2,2 mL forberedt 50% sukrose bufferstørrelsen til bunnen av 13,2 mL tynn vegg polyallomer røret og fryse løsningen for 10 min ved-80 ° C (figur 2). Deretter lag 2,2 mL av 40% sukrose buffer på den frosne 50% sukrose bufferen og fryse i 10 min på-80 ° C. Følger de samme instruksjonene, lag 30%, så 20%, og til slutt 10% sukrose bufrer oppå hverandre. Unngå å gjøre luftbobler under lagene. Holde graderingene ved-80 ° C før bruk. Sukrose graderingene bør være forberedt minst en dag før eksperimentet og lagret på-80 ° C.
- Nuclease fordøyelse
- Tine sukrose graderingene natten før eksperimenter på 4 ° C.
- Tine celle lysate (fotavtrykk utvalget) på is. Overføre en aliquot i celle lysate som inneholder 50 OD260 enheter til en ny 1,5 mL tube og legge frisk lyseringsbuffer opptil 1 mL. Lagre de gjenværende lysate på-80 ° C. Tilsett 10 μL RNase jeg (100 U/μL) og Inkuber 1t ved romtemperatur med mild rotasjon på et hode-over-hæler rotator.
- (Valgfritt) Avklare prøvene 20.000 x g i 5 min på 4 ° C og gjenopprette nedbryting i en ny 1,5 mL tube.
- Ultracentrifugation
- Forsiktig laget lysate prøver til toppen av en 10-50% sukrose gradering.
- Ultracentrifuge polyallomer rør 210 000 x g (35 000 rpm) på 4 ° C for 3t bruker SW-41 Ti rotoren.
- Gradert fraksjoneres Systemkonfigurasjon
- Slå på komponentene og tillate UV skjermen oppvarmingstid minst 30 min.
- Hvis bruker en digital opptaker programvare, starter programvaren på datamaskinen, kan du sette Grafens skalering grenser for-0.01 og 1.
- Fyll sprøyten Chase løsning (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% sukrose), Fjern eventuelle luftbobler inne i sprøyte og kanyle.
- Installere en ultracentrifuge rør fylt med RNase-fritt vann. Pierce røret med kanyle til to svarte merker kan sees. Starte sprøytepumpen på 1 mL/min.
- Når vannet passerer gjennom flyt cellen, trykk "Auto Zero" knappen på UV skjermen justere grunnlinjen til 0. Angi følsomheten for UV å "2.0 AU". Etter en stabil plan er satt opp, stoppe sprøytepumpen. Gjenopprette det Chase og fjerne ultracentrifuge røret.
- Monosome isolasjon
- Installer og pierce ultracentrifuge røret som inneholder sukrose graderingen. Start sprøytepumpen på 1 mL/min, samle 1 mL fraksjoner overvåking254 verdier. Basseng brøker som representerer 80 monosome toppen i en tube, holde på is (Figur 3).
- Når Chase løsning når flyten cellen, stoppe sprøytepumpen. Gjenopprette Chase løsning og fjerne ultracentrifuge røret. Gjenta fraksjoneres for resten av prøvene fra og med trinn 2.5.1.
Merk: Når ferdig, ren fraksjoneres systemet med minst 30 mL av RNase-fritt vann. Grundig vask rør, sprøyter og alle flyttbare komponenter med varmt vann. - Filtrere fraksjoner gjennom 0,5 mL sentrifugal filtre (100 kDa MWCO) 12 000 x g i 10 min på 4 ° C og forkaste gjennomflytsenhet, gjenta til volumet er < 100 μL. Legge til 400 μL utgivelsen Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase hemmer). Blandingen av pipettering, ruge is 10 min og overføre enheten til en ny samling rør. Sentrifuge 12.000 x g i 10 min på 4 ° C og samle gjennomflytsenhet.
- Fotavtrykk fragment rensing
- Overføre gjennomflytsenhet inneholder fotavtrykk RNA fragmenter til en ny 1,5 mL tube, legge til 20 μL av 20% SDS (til en siste konsentrasjon av 1%), blande av pipettering.
- Legge 1 volumet av syre-fenol: kloroform (pH 4.5), vortex for 10 s.
Forsiktig: Acid-fenol: kloroform er giftig, unngå kontakt med hud og innånding. - Varme ved 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 sentrifuge prøven på 12.000 x g for 5 min på 4 ° C, overføre den vandige fasen (øverst) til en ny 1,5 mL tube.
- Utløse fotavtrykk RNA fragmenter ved å legge til 1/10 volum av NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol.
3. Poly(A) mRNA utvinning
- Totale RNA utvinning
- Tine en 100 μL aliquot cellen lysate (Total RNA utvalget) på is, legger 300 μL 20 mM Tris-HCl pH 7.0 og 20 μL 20% SDS (til en siste konsentrasjon av 1%), blande av pipettering.
- Legge til 1-volum (400 μL) av syre-fenol: kloroform (pH 4.5) og vortex for 10 s.
- Varme ved 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 sentrifuge prøven på 12.000 x g for 5 min på 4 ° C, overføre den vandige fasen (øverst) til en ny 1,5 mL tube.
- Utføre en andre fenol utvinning. Legge 1 volumet av syre-fenol: kloroform (pH 4.5), vortex for 10 s. varme ved 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 sentrifuge prøven på 12.000 x g for 5 min på 4 ° C, overføre den vandige fasen til en ny 1,5 mL tube.
- Utløse RNA. Legg til 1/10 volumet av 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol for dette. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
- Poly(A) mRNA isolasjon
- Sentrifuge RNA prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips og lufttørke pellet i 5 min.
- Oppløse pellet i 300 μL Lysis Binding buffer fra poly(A) mRNA isolering kit. Fortsett til poly(A) mRNA utvinning etter poly(A) mRNA isolering kit produsentens protokollen.
- Utløse mRNA prøvene ved å legge til 1/10 volumet av 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
- mRNA fragmentering
- Sentrifuge mRNA prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 sek, fjerne resten av etanol med en gel-lasting tips og luften tørr pellet i 5 min.
- Resuspend mRNA i 18 μL RNase-fritt vann, tilsett 2 μL av 10 x RNA fragmentering buffer. Inkuber 5 min på 94° C. Overføre tube til is.
- Utløse ved å legge til 1/10 volumet av 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
4. dephosphorylation
- Behandle fotavtrykk og fragmentert mRNA prøver med T4 polynucleotide kinase. For dette, sentrifuge prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med en gel lasting tips. Luften tørr pellet i 5 min.
- Resuspend pellet i 7,75 µL av vann, Legg 1 µL 10 x T4 polynucleotide kinase bufferen, 1 µL av T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL) og 0,25 µL av RNase hemmer (20 U/µL). Inkuber 1t på 37 ° C.
- (Valgfritt) Pre kjøre en 15% TBE-urea gel på 180 V i 15 min med 1 x TBE buffer.
- Legge til 10 µL av 2 X TBE-urea eksempel buffer 10 µL av hver fotavtrykk og mRNA prøve. Forberede en kontroll prøven som inneholder 1 µL av 10 µM øvre markør oligonucleotide (32 nt), 1 µL av 10 µM lavere størrelse markør oligonucleotide (28 nt), 8 µL vann og 10 µL av 2 x TBE-urea eksempel buffer for fotavtrykk prøver. Forberede en kontroll prøven som inneholder 1 µL av 10 µM RNA markør oligonucleotide (63 nt), 9 µL vann og 10 µL av 2 x TBE-urea eksempel buffer for mRNA prøver.
- Inkuber prøver og kontroller 3 min ved 75 ° C, spinne ned, lagt på is for 1 min. laste hver prøve i 2 brønner i 15% TBE-urea gel, separat RNA fragmenter av gel geleelektroforese på 180 V 1t.
- Flekk gel for 5 min med en nukleinsyre gel flekk (fortynne 10 000 x i vann), beskytter mot lyset.
- Bruke en blå lys transilluminator, kuttet riktig bandet mellom 28 og 32 nt trådene fotavtrykk prøver (figur 4A) og rundt eksempler 50-70 nt for mRNA (figur 4B) med et rent barberblad. Fryse polyakrylamid gel brikkene på-80 ° C i minst 10 min.
- Pakk ut RNA fra polyakrylamid gel som følger. Varme gel brikkene på 70 ° C i 2 minutter, grind gel bruke engangs pellet støtere. Elute RNA med 300 µL elueringsbufferen (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), legge til 1 µL RNase hemmer (20 U/µL) og ruge på 37 ° C 3 h.
- Sentrifuge prøven på 12.000 x g i 5 min på 4 ° C, samle nedbryting og utløse ved å legge til 1/10 volum av NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
5. 3-adapter Ligation
- Sentrifuge fotavtrykk og mRNA prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips. Luften tørr pellet i 10 min.
- Resuspend pellet i 4.75 µL nuclease uten vann, 2 µL av 50% PEG8000, 1 µL av 10 X T4 RNA ligase buffer, 1 µL av 3-adapter (100 ng/µL), 0,25 µL av RNase hemmer (20 U/µL), 1 µL av T4 RNA ligase 2 avkortet KQ (200.000 U/mL). Ruge over natten på 16 ° C.
- Neste morgen, fjerne overflødig adapter ved å legge 0,5 µL av 5'-deadenylase (10 U/µL) og 0,5 µL av Rec J exonuclease (10 U/µL) direkte til hemorroider reaksjonen. Inkuber i 30 min på 30 ° C.
- Utløse prøvene. For dette, kan du legge 30 µL nuclease uten vann, 1 µL glykogen (10 mg/mL), 1/10 volum av NaOAc (pH 5.5) og 2,5 mengder 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
6. omvendt transkripsjon
- Sentrifuge prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips. Luften tørr pellet i 10 min.
- Resuspend pellet i 11,5 µL nuclease uten vann, Legg til 0,5 µL av 8 µM omvendt transkripsjon primer (RT primer) og 1 µL dNTP mix (10 mM). Inkuber i 5 min på 65 ° C, sted på is.
- Legge til 4 µL av 5 X første strand buffer, 2 µL 0.1 m DTT, 0,5 µL av RNase hemmer (20 U/µL), 0,5 µL av revers transkriptase (200 U/µL). Inkuber i 30 min ved 48 ° C, 1 min på 65 ° C, 5 min på 80 ° C.
- Ikke utløse og fortsette umiddelbart til hydrolyse av ved å legge til 0,8 µL av 2 M NaOH, ruge 30 min på 98 ° C. Legge til 0,8 µL 2M HCl å nøytralisere reaksjonen.
- Utløse prøvene.
7. circularization
- Sentrifuge prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips og lufttørke pellet i 10 min.
- Resuspend pellet i 16.75 µL nuclease uten vann. Legge til 2 µL av 10 x single-strandet DNA (ssDNA) ligase buffer, 1 µL av 50 mM MnCl2 . 0,25 µL av ssDNA Ligase (100 U/µL). Inkuber 1t ved 60 ° C, 10 min på 80 ° C. Ikke utløse, og lagre ssDNA ligation reaksjon produktet på 20 ° C.
8. PCR biblioteket forsterkning
- Mens arbeidet med is, bland følgende i et PCR-rør: 146 µL nuclease-fritt vann, 2 µL av 20 µM frem primer, 2 µL av 20 µM indeksert reversere primer, 40 µL av 5 x Hi-Fi-DNA plymerase buffer, 4 µL av dNTPs (10 mM), 4 µL ssDNA ligation reaksjon produkt , og 2 µL av Hi-Fi-DNA polymerase. Velg en annen indeksert reversere primer for hvert utvalg som vil være multiplekset for sekvenser. Overføre en 50 µL aliquot av PCR blandingen til 4 nye PCR rør.
- Utføre PCR forsterkning med varierende antall sykluser (8, 10, 12, 14) med følgende innstillinger:
1 min på 98 ° C første rødsprit
8-14 går:
15 er på 94 ° C
5 s ved 55 ° C
10 er på 65 ° C
2 minutter til 65 ° C endelig utvidelse - Utløse PCR produktet ved å legge til 1/10 volumet av 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
- Sentrifuge prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips og lufttørke pellet.
- Resuspend pellet i 8 µL nuclease uten vann, Legg 2 µL av ikke-denaturing 5 x nukleinsyre eksempel buffer. Laste inn prøven på 1 godt av en ikke-denaturing 8% TBE gel. Skill DNA produktene med gel geleelektroforese på 150 V for 35 min. Som en kontroll, forberede et utvalg som inneholder 0,5 µL av 10 bp DNA stigen (1 µg/µL), 7,5 µL vann og 2 µL av ikke-denaturing 5 x nukleinsyre eksempel buffer, og kjøre på en egen fil i gel.
- Flekk gel for 5 min med en nukleinsyre gel flekk (fortynne 10 000 x i vann), beskytter mot lyset. Bruke en blå lys transilluminator, kuttet bandet rundt 150 bp for fotavtrykk prøver og rundt 180 bp for mRNA prøver (figur 6) med et rent barberblad. Lagre gel brikkene på-80 ° C i minst 10 min.
- Varme gel brikkene på 70 ° C i 2 minutter, grind gel bruke engangs pellet støtere. Elute DNA med 300 µL av 20 mM Tris-HCl pH 7.0 og ruge på 37 ° C 3 h.
- Sentrifuge prøven på 12.000 x g, etter 5 min på 4 ° C, samle nedbryting og utløse ved å legge til 1/10 volum av NaOAc (pH 5.5), 1/100 volumet av glykogen (10 mg/mL) og 2,5 volum av 100% etanol. Ruge på-20 ° C i minst 1 time.
- Sentrifuge prøvene 20.000 x g i 30 min på 4 ° C, fjerne etanol. Nedspinning 30 s på maks fart, fjerne resten av etanol med gel-lasting tips og lufttørke pellet. Endelig resuspend bibliotekene i 20 µL nuclease uten vann og kvantifisering, kvalitetskontroll og sekvenser.
9. biblioteket kvantifisering og høy gjennomstrømming sekvensering
- Før du sender prøvene for sekvensering, bestemme avkastning og kvaliteten på PCR-forsterket biblioteker. Representant profiler for fotavtrykk og mRNA sekvensering biblioteker vises i figur 7. Forventet er PCR-forsterket biblioteket 148-152 bp for fotavtrykk prøver og 170-190 bp for mRNA prøver.
- Hvis flere prøver med forskjellige strekkoder vil samordnes for sekvensering, Utfør nøyaktig kvantifisering av bibliotekene bruker en qPCR-baserte sekvensering biblioteket kvantifisering analysen.
- Basseng bibliotekene i ekvimolare forhold. Beregne det totale volumet av bassenget som 3 µL x antall eksempler som skal samordnes. Bestem volumet av hvert bibliotek som skal legges slik at biblioteker er blandet i ekvimolare forholdstallene å oppnå 10 nM siste konsentrasjon av bassenget. Legg til beregnet volum av hvert bibliotek i en ny 1,5 mL tube, blande av pipettering. Legge til vann for å oppnå det beregnede totale volumet. Lagre gruppert biblioteker på 20 ° C.
- Sende en aliquot av grupperte biblioteket som ble sekvensert bruker 50 bp single-end sekvensering kjøre på en Illumina sekvensering plattform. Vi rutinemessig multiplex 12 prøvene i en enkelt sekvensering kjøre, hvilke gir ~ 200 millioner leser per sekvensering kjørefelt.
Merk: Det siste nummeret av fotavtrykk samlet per hvert utvalg avhenger av mengden materiale som input og nivået på rRNA forurensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljert rørledninger for bioinformatic analyse av ribosom profildata som er beskrevet tidligere 8,9. I tillegg har flere forskningsgrupper utviklet Bioinformatikk verktøy for differensial gene expression analyse og behandling av sekvensering data som er spesifikke for ribosom profilering metoden 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. Det første trinnet i analyse av Ribo-Seq data er demultiplexing og trimming 3 kort rekkefølgen AGATCGGAAGAGCACACGTCT bruker Cutadapt programvare 19. Deretter den sekvensering lest er justert mot ikke-koding RNAs, som rRNA og tRNA, bruker Bowtie 20 for å fjerne skadelige sekvenser, og lyder som ikke kan rettes tilordnes deretter gjær genomet. Antall per genet kan deretter bli vurdert av HTseq-count programvare 21og ulikt uttrykt gener identifiseres av DESeq2 22.
Figur 8 viser representant resultater kvantitativ analyse av oversettelse i hbs1Δ 23,24 gjær sletting mutant som er oppnådd med våre protokollen. Først vurdert vi antall og andelen leser som tilsvarer ikke-koding RNA (f.eks rRNAs) innhentet etter sekvensering fotavtrykk og mRNA biblioteker genereres for vill-type celler og hbs1Δ mutant. Vi fant at selv uten noen rRNA uttømming trinn (omtalt under), 50-60% av alle sekvensert leser i vårt fotavtrykk biblioteker tilsvarer ribosom-beskyttet fotavtrykk fragmenter (figur 8A). Derimot ble bare 3% av rRNA-avledet fragmenter observert i mRNA biblioteker viser at poly(A) mRNA isolasjon tillater effektiv eliminasjon av rRNA leser. Sammen, vi kunne få mer enn 10 millioner fotavtrykk leser for hver fotavtrykk prøvene av sekvensering 2 gjentak. For å vurdere variasjon av biblioteket generasjon og reproduserbarhet data, analyserer vi vanligvis minst to uavhengige biologiske gjentak per hver eksperimentelle tilstand. Både fotavtrykk og mRNA eksempel biblioteker viser god reproduserbarhet med Pearson korrelasjonskoeffisient R ~ 0,99 mellom matchet eksempler (figur 8B).
I tillegg til vurdere nivået på protein oversettelsen på genomet hele nivå, kan ribosom profilering måle endringer i oversettelse effektivitet mellom eksperimentelle forhold 3. For dette brukes en aliquot i cellen lysate (ikke behandles med ribonuclease) for poly(A) mRNA isolasjon og utarbeidelse av et RNA-Seq-bibliotek. Fordi både fotavtrykk biblioteket og RNA-Seq biblioteket tilberedes kontrollert oppstiller og kan spores til hver enkelt replikere kan Ribo-Seq og RNA-Seq datasett sammenlignes direkte for å identifisere gener som er regulert av endringene i mRNA transkripsjon, oversettelse effektivitet, eller en kombinert effekt. For å identifisere gener som er opp - eller ned-regulert spesielt på nivå av protein oversettelsen i hbs1Δ mutant, beregnet vi endringer i oversettelse effektivitet ved å dele plass rpkm verdier mRNA rpkm for hver av gener (Figur 8 c).
Figur 1: oversikt over Ribo-Seq protokollen. Hele protokollen kan utføres i ca 11 dager. Anslått tid for hvert trinn vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utarbeidelse av sukrose graderinger Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant sukrose gradient profiler. (A) sukrose gradient profilen oppnådd for kontrollen (ikke behandles med RNase jeg) prøve. (B) for å trekke ut ribosom-beskyttet RNA fragmenter, celle lysates behandles med RNase jeg 1t ved romtemperatur (RT). Brøker tilsvarer monosomal toppen er deretter samlet for fotavtrykk utvinning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant bilder av 15% polyakrylamid geléer innhentet etter T4 polynucleotide kinase behandling. (A) størrelsen på forbrukeravgift gel sektoren rundt 28 og 32 nt vises for fotavtrykk prøver. (B) kutt gel stykket om 50-70 nt for mRNA prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant bilder av 10% polyakrylamid geléer innhentet etter omvendt transkripsjon. (A) kuttet øvre band ~ 128 nt for fotavtrykk prøver, tilsvarende av omvendt transkripsjon. (B) kuttet bandet rundt 150-170 nt for mRNA prøvene (øvre band). Lavere bandene tilsvarer RT primer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: polyakrylamid gel rensing av PCR-forsterket biblioteker. PCR produkter etter 8, 10, 12 og 14 sykluser av biblioteket forsterkning ble løst på en ikke-denaturing 8% TBE gel.Full lengde fotavtrykk bibliotekene er ~ 150 bp, mens mRNA biblioteker er ~ 170-190 bp. unngå lavere bandet som ikke inneholder sett inn.
Figur 7: Bioanalyzer analyse. (A) representant Bioanalyzer profiler av PCR-forsterket fotavtrykk biblioteket. Den gjennomsnittlige størrelsen på fotavtrykk biblioteket forventes å være fra 148 til 152 nt. (B) representant Bioanalyzer profiler av sekvensering biblioteket innhentet for mRNA prøver. Forventet mRNA biblioteket er 170-190 nt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: representant resultater. (A) antall mRNA fotavtrykk og rRNA leser innhentet for vill-type utvalget og hbs1Δ mutant. Samlet antall leser generert av sekvensering to biologiske replikerer vises for vill-type celler og hbs1Δ mutant. (B) reproduserbarhet av fotavtrykk og mRNA-overflod målinger mellom to replikerer. Pearson korrelasjonskoeffisienter (R) angis. (C) Transcriptional og translasjonsforskning endringer i hbs1Δ mutant. Betydelig er opp-regulert og ned-regulert gener i hbs1Δ gruppert i henhold til om de påvirkes av en endring i mRNA transkripsjon, oversettelse effektivitet, eller en kombinert effekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primere | Sekvens | Indeks | ||||
| 3 kort (100 ng/µL) | 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| RT primer | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Fremover PCR primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Indeks primer 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Indeks primer 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Indeks primer 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Indeks primer 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Indeks primer 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Indeks primer 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tabell 1: 3' kort og primer sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ribo-Seq tilnærmingen har dukket opp som en kraftig teknologi for analyse av mRNA oversettelse i vivo på genomet hele nivå 3. Studier med denne tilnærmingen, som tillater avlytting oversettelse med enkelt-codon oppløsning, har bidratt til vår forståelse av translasjonsforskning regulering. Til tross for sine fordeler har Ribo-Seq flere begrensninger. Ribosomal RNA (rRNA) fragmenter er alltid co renset under isolasjon av ribosom-beskyttet fotavtrykk redusere avkastningen av nyttig sekvensering leser som kan oppnås i Ribo-Seq eksperimenter 9,25. Våre data viser at rRNA forurensning kan bidra til så mange som 40-50% av alle leser (Figur 8). En av måtene å overkomme denne begrensningen er å øke sekvensering dybden. Flere runder med sekvensering skal utføres til antall sekvensering leser er oppnådd for hver av de analyserte prøvene. Analyse av sekvensering bibliotekene tilberedt med våre Protokoll viser at mer enn 5 millioner fotavtrykk leser kan skaffes for hver fotavtrykk bibliotek når 12 prøver er multiplekset sammen i en standard 50-bp single-slutt kjøre på Illumina HiSeq 2000-plattformen. Men hvis betydelige forurensning med rRNA er observert, kan et valgfritt rRNA fjerning trinn utføres.
En av strategiene fjerne rRNA forurensende fragmenter fra fotavtrykk biblioteker er å bruke subtraktiv hybridisering med biotinylated oligonucleotides som beskrevet tidligere 8,26,27. Alternativt kan rRNA forurensende leser fjernes ved hjelp av kommersielt tilgjengelig rRNA uttømming kits. For dette, forskere kan utføre rRNA uttømming på renset 3-kort-samskrevet fotavtrykk fragmenter fra trinn 5.4. Følgende rRNA utarming, fotavtrykk prøver kan igangsatte og brukes direkte for omvendt transkripsjon (trinn 6) i protokollen.
I tillegg til rensing av monosomes ved hjelp av sukrose gradient fraksjoneres beskrevet i våre protokollen, har flere metoder blitt utviklet som utnytter en kolonne-baserte rensing 28 og ultracentrifugation gjennom en sukrose pute 8 ,29. Mens disse metodene kan fremskynde prosessen fotavtrykk biblioteket forberedelser og er mindre teknisk utfordrende forhold til sukrose gradient fraksjoneres, tillater de ikke kvalitativ analyse av de renset monosomes og effektiviteten av nuclease fordøyelsen trinn. Valg av nuclease har nylig vist å påvirke effektiviteten av rensingen av ribosom-beskyttet RNA fragmenter i ulike arter 30. Mens RNase jeg har robust aktivitet i gjær celle lysates, sin virksomhet har blitt vist å påvirke integriteten til ribosomer i musen vev som frukt fluer. Derfor skal valg og konsentrasjonen av nuclease være optimalisert når det gjelder denne protokollen for andre arter.
En annen viktig faktor er bruken av oversettelse-hemmere. De fleste protokoller for ribosom profilering vanligvis innebære behandling av celler med forlengelse inhibitors, som gapestokk eller harringtonine, for å hindre avrenning av ribosomer under cellen høsting 3. En av begrensningene for bruk av oversettelse hemmere er at narkotika diffus gradvis i cellen, indusere en progressiv hemming av ribosomer 31. Videre narkotika ikke hemme oversettelse innvielsen eller oppsigelse. Som en konsekvens, ribosomer uforholdsmessig akkumuleres på start codon og blir utarmet på Stopp codon 8,27,31. For å begrense denne gjenstand, valgte vi å flash fryse cellene i flytende nitrogen og behandle med gapestokk ved utvinning i lyseringsbuffer bare.
Til tross for et relativt stort antall rapporter som har benyttet Ribo-Seq i ulike arter, mangler standardiserte protokoller for Ribo-Seq analyse. Direkte som en konsekvens, Ribo-Seq-data som er generert av ulike labs kan ikke sammenlignes. For eksempel avslørte sammenligning av publiserte ribosom profilering datasett betydelige forskjeller i resultatene blant studier 32. Dette skyldes delvis til kontinuerlig forbedringer som er gjort som protokoll utviklet seg over de siste årene. I tillegg endret mange forskere ribosom profilering protokollen for å adoptere det til behovene til sine studier eller modell systemet 9,25. Videre standardisere ribosom profilering protokollen også ville dataanalyse og normalisering, tillate forhindre noen av det eksperimentelle biases og sikre nøyaktige og reproduserbar kvantifisering av i vivo oversettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir AG040191 og AG054566 til VML. Denne forskningen ble utført mens VML var en AFAR forskningsstipend mottaker fra American Federation for aldring forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
