Summary
Translationel forordning spiller en vigtig rolle i kontrollen af protein overflod. Her, beskriver vi en høj overførselshastighed metode til kvantitativ analyse af oversættelse i spirende gær Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Oversættelse af mRNA i proteiner er en kompleks proces, der involverer flere lag af forordningen. Det antages ofte, at ændringer i mRNA transskription afspejler ændringer i proteinsyntesen, men mange undtagelser er blevet observeret. For nylig, en teknik kaldet ribosomet profilering (eller Ribo-Seq) fremstod som en kraftfuld metode, der giver mulighed for identifikation, med høj nøjagtighed, hvilke regioner af mRNA oversættes til proteiner og kvantificering af oversættelse på genom-plan. Vi præsenterer her, en generaliseret protokol for genome-wide kvantificering af oversættelse ved hjælp af Ribo-Seq i spirende gær. Desuden giver kombinere Ribo-Seq data med mRNA overflod målinger os samtidig kvantificere oversættelse effektivitet af tusindvis af mRNA udskrifter i samme prøve og sammenligne ændringer i disse parametre i svar til eksperimentelle manipulationer eller i forskellige fysiologiske stater. Vi beskriver en detaljeret protokol for generation af ribosomet fodspor ved hjælp af nukleasen fordøjelse, isolation af intakt ribosomet-fodaftryk komplekser via saccharose gradient fraktionering og forberedelse af DNA biblioteker til dyb sekvensering sammen med passende kvalitetskontrol er nødvendige for at sikre præcis analyse af i vivo oversættelse.
Introduction
mRNA oversættelse er en af de grundlæggende processer i cellen, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af protein udtryk. Derfor, mRNA oversættelse er stramt kontrolleret som svar på forskellige interne og eksterne fysiologiske stimuli 1,2. Mekanismer for Translationel forordning er dog stadig forsømt. Her beskriver vi protokol for genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering. Det overordnede mål med ribosomet profilering teknik er at studere og kvantificere oversættelse af specifikke mRNAs forskellige cellulære betingelser. Denne teknik bruger next generation sequencing kvantitativt analysere ribosomet belægning i hele genomet og giver mulighed for overvågning sats af protein syntese i vivo på enkelt codon opløsning 3,4. I øjeblikket, denne metode giver den mest avancerede metode til at måle niveauet af protein oversættelse, og har vist sig for at være en nyttig opdagelse værktøj giver oplysninger, der ikke kan blive afsløret af andre i øjeblikket tilgængelige teknik, fx microarrays eller oversættelse tilstand array analyse (TSAA) 5. Som ribosomet profilering rapporter om de samlede ændringer i udskrift niveauer og translationel output, giver det også meget større følsomhed i forhold til andre metoder.
Denne tilgang er baseret på dyb sekventering af ribosomet-beskyttet mRNA fragmenter 3. Under protein oversættelse, ribosomer beskytte ~ 28 nt dele af mRNA (kaldet fodspor) 6. Ved at bestemme rækkefølgen af ribosomet-beskyttet fragmenter, kan Ribo-Seq kortlægge placeringen af ribosomer på den oversatte mRNA og identificere hvilke regioner af mRNA er tilbøjelige til at være aktivt oversat til protein 3,7. Desuden måler vi kvantitativt oversættelse af mRNA ved at tælle antallet af fodspor, der justeres i forhold til en given mRNA udskrift.
For at isolere de ribosom-beskyttet fragmenter, behandles cellelysater i første omgang med en oversættelse hæmmer til stall ribosomer efterfulgt af ribonuklease fordøjelsen. Der henviser til, at frie mRNA og dele af oversatte mRNAs ikke beskyttet af ribosomes er nedbrudt af ribonuklease, kan ribosomet-beskyttet mRNA fragmenter inddrives ved rensende intakt ribosomet-fodaftryk komplekser. Disse mRNA fodspor er derefter omdannes til cDNA bibliotek og analyseret af dyb sekventering (figur 1). Parallelt til ribosomet profilering er intakt mRNA udvundet fra den samme prøve og sekventeret. Ved at sammenligne niveauet for oversættelse identificeret ved Ribo-Seq med mRNA overflod målinger, kan vi identificere gener, der er specifikt op - eller nedreguleret på niveau med oversættelse og beregne oversættelse effektivitet af mRNA på genom-plan. Mens den protokol, der er beskrevet i denne artikel er specifikke for gær, bør det også være nyttig for forskere, der vil forsøge at etablere Ribo-Seq-protokollen i andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uddrag forberedelse
- Streak gærstammer fra frosne bestande for enkelt kolonier på YPD plader (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose og 2% agar). Inkuber plader ved 30 ° C i 2 dage.
- Podes gær fra en YPD tallerken (brug en enkelt koloni) til 15 mL YPD medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose) i en 50 mL konisk centrifugeglas og vokse natten under omrystning (200-250 rpm) ved 30 ° C.
- Fortynd kultur i 500 mL af YPD medium i en 2 L sterile kolbe, således at OD600 < 0,1. Vokse gærceller under omrystning ved 30 ° C i 3-5 h indtil OD600 = 0,5 (midten log fase).
- Indsamle celler ved filtrering gennem 0,45 μm membranfiltre ved hjælp af et glas indehaveren filter forsamling. Skrab pelleten med en spatel, flash fryse i flydende kvælstof, og opbevares ved-80 ° C. Den forventede størrelse af den frosne pellet er ~ 0,2 - 0,5 g.
Forsigtig: Flydende nitrogen er ekstremt lav temperatur; bær passende beskyttelse. - Forberede en frisk lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL cycloheximide, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) umiddelbart inden brug, holde på is.
- Sætte 3 krom-stål perler (3,2 mm) i en 1,8 mL rustfrit stålrør. Pre chill i flydende nitrogen og tilføje frosne pellets, dække med en silikone gummi cap. Homogeniseres prøven af cryogrinding for 10 s på 4200 rpm; Gentag 10 gange. Chill røret i flydende nitrogen for mindst 10 s mellem hver runde.
Bemærk: Det er vigtigt altid at holde prøven frosset. - Der tilsættes 1 mL af lysisbuffer, bland godt af pipettering. Overføres til en ny 1,5 mL tube.
- Der centrifugeres ved 20.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Mens du arbejder på is, skal du overføre supernatanten ind i en ny 1,5 mL rør. 100 μL af lysate overføres til en ny 1,5 mL tube til poly(A) mRNA isolation. Gå straks til RNA isolering eller flash fryse røret i flydende kvælstof. Foranstaltning OD260 af resten af den lysate, som vil blive brugt til fodaftryk udvinding, og flash fryse rørene i flydende kvælstof. Butik lysates ved-80 ° C.
2. fodaftryk udvinding
- Forberedelse af saccharose forløb
- Forberede løsninger til 50%, 40%, 30%, 20% og 10% saccharose i Gradient Buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL cycloheximide, 0,5 mM DTT).
- Der afpipetteres 2,2 mL af den forberedte 50% saccharose buffer til bunden af 13,2 mL tynd væg polyallomer tube og fryse løsning i 10 min ved-80 ° C (figur 2). Derefter lag 2,2 mL af 40% saccharose buffer ud over den frosne 50% saccharose buffer, og fryse i 10 min. ved-80 ° C. Efter den samme instruks, lag 30%, derefter 20%, og endelig 10% saccharose buffere på toppen af hinanden. Undgå luftbobler mens lagdeling. Holde farveforløb på-80 ° C indtil brug. Saccharose forløb bør tilberedes mindst én dag før forsøget og opbevares ved-80 ° C.
- Nukleasen fordøjelsen
- Tø saccharose forløb aftenen før eksperimenter ved 4 ° C.
- Tø celle lysate (fodaftryk eksempel) på is. En alikvot del af celle lysate indeholdende 50 OD260 enheder til en ny 1,5 mL tube og tilføje frisk lysisbuffer op til 1 mL. Gemme de resterende lysate ved-80 ° C. Tilsæt 10 μl RNase jeg (100 U/μL) og inkuberes 1 time ved stuetemperatur med blide rotation på et head-over-heels rotator.
- (Valgfrit) Afklare prøver på 20.000 x g i 5 min. ved 4 ° C og genoprette supernatanten ind i en ny 1,5 mL rør.
- Ultracentrifugering
- Forsigtigt lag lysate prøver til toppen af en 10-50% saccharose gradient.
- Ultracentrifuge polyallomer rør på 210.000 x g (35.000 omdr. / min.) ved 4 ° C til 3 h ved hjælp af SW-41 Ti rotor.
- Gradient fraktionering Systemopsætning
- Tænd komponenterne og tillade UV skærm til warm-up for mindst 30 min.
- Hvis bruger en digital optager software, starter softwaren på computeren, skal du angive diagrammets skalering grænser til-0.01 og 1.
- Fyld sprøjten med Chase løsning (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% saccharose), fjerner eventuelle luftbobler inde i sprøjte og kanyle.
- Installere et ultracentrifuge rør fyldt med RNase-fri vand. Gennembore tube med kanylen, indtil to sorte mærker kan ses. Start sprøjten pumpe på 1 mL/min.
- Når vandet passerer gennem cellen flow, tryk på "Auto nul" på UV skærmen til at justere baseline til 0. Indstiller følsomhed UV skærm til "2.0 AU". Efter en stabil basislinje er blevet oprettet, stoppe sprøjten pumpe. Genskab Chase løsning og fjerne ultracentrifuge rør.
- Monosome isolering
- Installere og gennembore ultracentrifuge tube indeholder saccharose gradient. Start sprøjten pumpe 1 mL/min., indsamle 1 mL fraktioner overvågning en254 værdier. Pool fraktioner der repræsenterer 80S monosome peak i ét rør, holde på is (figur 3).
- Når Chase løsning når cellen flow, stoppe sprøjten pumpe. Genskab Chase løsning og fjerne ultracentrifuge rør. Gentag fraktionering for resten af prøverne starter ved trin 2.5.1.
Bemærk: Når du er færdig, rense fraktionering system med mindst 30 mL af RNase-fri vand. Grundigt vaske slanger, sprøjte og alle flytbare komponenter med varmt vand. - Brøkdele, der filtreres på 0,5 mL centrifugal filtre (100 kDa MWCO) på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og kassér gennemstrømnings-, Gentag indtil volumen er < 100 μL. Tilsæt 400 μL af frigivelse Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase-hæmmer). Mix af pipettering, Ruger på is 10 min og overføre enheden ind i en ny indsamling rør. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og indsamle gennemstrømnings.
- Fodaftryk fragment rensning
- Overføre gennemstrømnings-indeholdende fodaftryk RNA fragmenter til en ny 1,5 mL tube, tilsæt 20 μL af 20% SDS (til en endelig koncentration på 1%), mix af pipettering.
- Tilføj 1 bind af syre-Phenol: Chloroform (pH 4.5), vortex for 10 s.
Forsigtig: Syre-Phenol: Chloroform er giftigt, undgå kontakt med huden og ved indånding. - Varme på 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 min. prøve på 12.000 x g der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C, overføre den vandige fase (øverst) til en ny 1,5 mL tube.
- Bundfald fodaftryk RNA fragmenter ved at tilføje 1/10 bind af NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol.
3. Poly(A) mRNA udvinding
- Total RNA udvinding
- Tø en 100 μL alikvot af celle lysate (Total RNA eksempel) på is, tilsættes 300 μl af 20 mM Tris-HCl pH 7,0 og 20 μL af 20% SDS (til en endelig koncentration på 1%), mix af pipettering.
- Tilføj 1 volumen (400 μL) af syre-Phenol: Chloroform (pH 4.5) og vortex for 10 s.
- Varme på 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 min. prøve på 12.000 x g der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C, overføre den vandige fase (øverst) til en ny 1,5 mL tube.
- Udføre en anden phenol udvinding. Tilføj 1 bind af syre-Phenol: Chloroform (pH 4.5), vortex for 10 s. varme ved 65 ° C i 5 min, lagt på is i 1 min. prøve på 12.000 x g der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C, overføre den vandige fase til en ny 1,5 mL tube.
- Bundfald RNA. Dette Tilføj 1/10 bind af 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
- Poly(A) mRNA isolation
- Centrifugeres RNA prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids, og luft tørre pellet i 5 min.
- Opløse pellet i 300 μL af Lysis/Binding buffer fra poly(A) mRNA isolering kit. Fortsæt til poly(A) mRNA udvinding efter poly(A) mRNA isolering kit producentens protokol.
- Bundfald mRNA prøver ved at tilføje 1/10 bind af 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
- mRNA opsplitning
- Centrifugeres mRNA prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 sek, fjerne resten af ethanol med en gel-loading tip og luft tørre pellet i 5 min.
- Resuspend mRNA i 18 μL af RNase-fri vand, tilsættes 2 μl af 10 x RNA fragmentering buffer. Inkuber 5 min på 94° C. Overføre tube til is.
- Bundfald ved at tilføje 1/10 bind af 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
4. dephosphorylation
- Behandle fodaftryk og fragmenterede mRNA prøver med T4 polynucleotide kinase. For dette, centrifugeres prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med en gel ladning tip. Luft tørre pellet i 5 min.
- Resuspenderes i 7,75 µL vand, tilsæt 1 µL af 10 x T4 polynucleotide kinase buffer, 1 µL af T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL) og 0,25 µL af RNase inhibitor (20 U/µL). Inkubér 1 h ved 37 ° C.
- (Valgfrit) Pre-opstille en 15% TBE-urea gel på 180 V i 15 min. ved hjælp af 1 x TBE buffer.
- Tilføje 10 µL af 2 X TBE-urea prøvebuffer til 10 µL af hver prøve, fodaftryk og mRNA. Forberede en kontrolprøve, der indeholder 1 µL af 10 µM øverste størrelse markør oligonukleotid (32 nt), 1 µL af 10 µM nedre størrelse markør oligonukleotid (28 nt), 8 µL vand og 10 µL af 2 x TBE-urea prøvebuffer fodaftryk prøver. Forberede en kontrolprøve, der indeholder 1 µL af 10 µM RNA markør oligonukleotid (63 nt), 9 µL vand og 10 µL af 2 x TBE-urea prøvebuffer mRNA prøver.
- Inkuber prøver og kontroller 3 min ved 75 ° C, spin ned, sat på isen for 1 min. Læg hver prøve i 2 brønde i 15% TBE-urea gel, separat RNA-fragmenter ved gelelektroforese på 180 V for 1 h.
- Pletten gel for 5 min med en nukleinsyre gel pletten (fortyndet 10.000 x i vand), beskytte mod lys.
- Ved hjælp af en blå lys transilluminator, klippe den rette bånd mellem 28 og 32 nt markører for fodaftryk prøver (figur 4A) og omkring prøver 50-70 nt til mRNA (figur 4B) med en ren barberblad. Fryse polyacrylamid gel stykker ved-80 ° C i mindst 10 min.
- Udtrække RNA fra Polyacrylamiden som følger. Varm gel stykker ved 70 ° C i 2 min., male gel ved hjælp af engangs pellet pestles. Elueres RNA med 300 µL eluering buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA), tilføje 1 µL RNase inhibitor (20 U/µL), og der inkuberes ved 37 ° C til 3 h.
- Centrifugeres prøve på 12.000 x g i 5 min. ved 4 ° C, indsamle supernatanten og bundfald tilføje 1/10 volumen af NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
5. 3'-adapter ligatur
- Centrifugeres fodaftryk og mRNA prøverne på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids. Luft tørre toerstoffet i 10 min.
- Resuspenderes i 4,75 µL nukleasen-gratis vand, 2 µL af 50% PEG8000, 1 µL af 10 X T4 RNA ligase buffer, 1 µL af 3'-adapter (100 ng/µL), 0,25 µL af RNase inhibitor (20 U/µL), 1 µL af T4 RNA ligase 2 afkortet KQ (200.000 U/mL). Der inkuberes natten over ved 16 ° C.
- Den næste morgen, fjerne overskydende af adapter ved at tilføje 0,5 µL af 5'-deadenylase (10 U/µL) og 0,5 µL af Rec Jørgensen exonuclease (10 U/µL) direkte til ligatur reaktion. Inkuber i 30 min. ved 30 ° C.
- Bundfaldet anbringes prøverne. For dette, Tilføj 30 µL nukleasen-gratis vand, 1 µL glykogen (10 mg/mL), 1/10 bind af NaOAc (pH 5,5) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
6. reverse transkription
- Centrifugeres prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids. Luft tørre toerstoffet i 10 min.
- Resuspenderes i 11,5 µL nukleasen-gratis vand, tilsæt 0,5 µL af 8 µM reverse transkription primer (RT primer) og 1 µL af dNTP mix (10 mM). Inkuber i 5 min. ved 65 ° C, Anbring på is.
- Tilføj 4 µL af 5 X første strand buffer, 2 µL af 0,1 M DTT, 0,5 µL af RNase inhibitor (20 U/µL), 0,5 µL af reverse transkriptase (200 U/µL). Inkuber i 30 min. ved 48 ° C, 1 min. ved 65 ° C, 5 min. ved 80 ° C.
- Ikke bundfald og gå straks til hydrolyse af RNA, ved at tilføje 0,8 µL 2 M NaOH, Inkubér 30 min på 98 ° C. Tilføje 0,8 µL 2M HCl til at neutralisere reaktion.
- Bundfaldet anbringes prøverne.
7. circularization
- Centrifugeres prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids, og luft tørre toerstoffet i 10 min.
- Resuspenderes i 16.75 µL nukleasen-gratis vand. Tilføj 2 µL af 10 x enkeltstrenget DNA (ssDNA) ligase buffer, 1 µL af 50 mM frihedsbevægelse2, 0,25 µL af ssDNA Ligase (100 U/µL). Inkuber i 1 time ved 60 ° C, 10 min. ved 80 ° C. Ikke bundfald, og gemme ssDNA ligatur reaktionsprodukt ved-20 ° C.
8. PCR bibliotek forstærkning
- Mens arbejdet på is, bland følgende i en PCR rør: 146 µL nukleasen-gratis vand, 2 µL af 20 µM fremad primer, 2 µL af 20 µM indekseret Reverse primer, 40 µL af 5 x Hi-Fi-DNA plymerase buffer, 4 µL af dNTP'er (10 mM), 4 µL af ssDNA ligatur reaktionsprodukt , og 2 µL af high-fidelity DNA polymerase. Vælg en anden indekseret Reverse primer for hver prøve, der vil være multipleksede til sekvensering. Overføre en 50 µL alikvot af PCR-blandingen i 4 nye PCR rør.
- Udføre PCR-amplifikation med varierende antal cyklusser (8, 10, 12, 14) ved hjælp af følgende indstillinger:
1 min på 98 ° C indledende denaturering
8 til 14 cykler:
15 s på 94 ° C
5 s på 55 ° C
10 s på 65 ° C
2 min. ved 65 ° C endelige udvidelse - Bundfald PCR produkt ved at tilføje 1/10 bind af 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
- Centrifugeres prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids, og luft tørre pellet.
- Resuspenderes i 8 µL nukleasen-gratis vand, tilsættes 2 µL af ikke-denatureringen 5 x nukleinsyre prøvebuffer. Læg prøven på 1 godt af en ikke-denatureringen 8% TBE gel. Adskille DNA produkter ved gelelektroforese på 150 V i 35 min. Som kontrol, forberede en prøve, der indeholder 0,5 µL af 10 bp DNA ladder (1 µg/µL), 7,5 µL vand og 2 µL af ikke-denatureringen 5 x nukleinsyre prøvebuffer og køre på en separat vognbane af gelen.
- Pletten gel for 5 min med en nukleinsyre gel pletten (fortyndet 10.000 x i vand), beskytte mod lys. Ved hjælp af en blå lys transilluminator, skære bandet omkring 150 bp for fodaftryk prøver og omkring 180 bp mRNA prøver (figur 6) med en ren barberblad. Gemme gel stykker ved-80 ° C i mindst 10 min.
- Varm gel stykker ved 70 ° C i 2 min., male gel ved hjælp af engangs pellet pestles. Elueres DNA med 300 µL af 20 mM Tris-HCl pH 7,0, og der inkuberes ved 37 ° C til 3 h.
- Centrifugeres prøve på 12.000 x g, i 5 min. ved 4 ° C, indsamle supernatanten og bundfald tilføje 1/10 volumen af NaOAc (pH 5,5), 1/100 bind af glykogen (10 mg/mL) og 2,5 mængder af 100% ethanol. Der inkuberes ved-20 ° C i mindst 1 time.
- Centrifugeres prøver på 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, skal du fjerne ethanol. Spin ned 30 s på max hastighed, fjerne resten af ethanol med gel-loading spids, og luft tørre pellet. Endelig resuspend biblioteker i 20 µL nukleasen-gratis vand og Fortsæt til kvantificering, kvalitetskontrol og sekventering.
9. bibliotek kvantificering og høj overførselshastighed sekventering
- Før du sender prøver til sekvensering, bestemme udbytte og kvalitet af PCR forstærket biblioteker. Repræsentative profiler for fodaftryk og mRNA sekventering biblioteker er vist i figur 7. Den forventede størrelse af PCR forstærket biblioteket er 148-152 bp fodaftryk prøver og 170-190 bp mRNA prøver.
- Hvis flere prøver med forskellige stregkoder samles til sekvensering, udføre nøjagtig kvantificering af bibliotekerne ved hjælp af en qPCR-baserede sekventering bibliotek kvantificering assay.
- Pool biblioteker i equimolar nøgletal. Beregn det samlede volumen af poolen som 3 µL x samlede antal prøver, der skal samles. Bestemme mængden af hvert bibliotek, der skal tilføjes, således at biblioteker er blandet i de equimolar forhold for at opnå 10 nM endelige koncentration af poolen. Sammenlægge de beregnede mængder af hvert bibliotek i en ny 1,5 mL tube, mix af pipettering. Tilsæt vand for at opnå den beregnede samlede volumen. Gemme fælles biblioteker ved-20 ° C.
- Send en alikvot af poolede biblioteket for at blive sekventeret bruger 50 bp single-ende sekventering køre på en Illumina sekventering platform. Vi rutinemæssigt multiplex 12 prøver i et enkelt sekventering køre, som udbytter ~ 200 millioner læser per sekventering lane.
Bemærk: Det endelige antal fodaftryk læser indsamlet pr. hver prøve afhænger af mængden af tilført materiale og af rRNA forureningsniveauet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljerede rørledninger til bioinformatic analyse af ribosomet profilering data er blevet beskrevet tidligere 8,9. Derudover har flere forskergrupper udviklet bioinformatik værktøjer til differentieret gen expression analyse og behandling af sequencing data, som er specifikke for ribosomet profilering metode 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. Det første skridt i analysen af Ribo-Seq data demultiplexing og trimning af 3' adapter sekvens AGATCGGAAGAGCACACGTCT ved hjælp af Cutadapt software 19. Derefter sekventering læsninger er justeret mod ikke-kodende RNA'er, såsom rRNA og tRNA, ved hjælp af Butterfly 20 til at fjerne forurenende sekvenser, og læser, der ikke justerer tilknyttes derefter gær genom. Læs tæller pr. gen kan derefter blive vurderet af HTseq-count software 21, og varierende udtrykte gener er identificeret ved hjælp af DESeq2 22.
Figur 8 viser repræsentative resultater af den kvantitative analyse af oversættelse i hbs1Δ 23,24 gær sletning mutant, der er fremstillet ved hjælp af vores protokol. Først, vi vurderet antal og andel af læser, der svarer til ikke-kodende RNA (f.eks. rRNAs) fremstillet efter sekvensering fodaftryk og mRNA biblioteker genereret for wild-type celler og hbs1Δ mutant. Vi fandt, at selv uden rRNA udtynding trin (beskrevet nedenfor), fra 50 til 60% af alle sekventeret læser i vores fodaftryk biblioteker svarer til ribosomet-beskyttet fodaftryk fragmenter (figur 8A). Derimod blev kun 3% af rRNA-afledte fragmenter observeret i mRNA biblioteker viser at poly(A) mRNA isolation giver mulighed for effektiv afskaffelse af rRNA læser. Sammen, vi var i stand til at opnå mere end 10 millioner fodaftryk læser for hver af fodaftryk prøverne ved sekventering 2 replikater. For at vurdere variabiliteten af bibliotek generation og reproducerbarhed af data, analysere vi normalt mindst to uafhængige biologiske replikater pr. hver eksperimentelle betingelse. Både fodaftryk og mRNA prøven biblioteker viser god reproducerbarhed med Pearson korrelationskoefficienten R ~ 0,99 mellem matchede prøver (fig. 8B).
Ud over vurderingen af niveauet af protein oversættelse på niveauet genome-wide, kan ribosomet profilering måle ændringer i oversættelse effektivitet mellem forsøgsbetingelser 3. For dette, er en alikvot af cellen lysate (ikke behandlet med ribonuklease) bruges til poly(A) mRNA isolation og forberedelse af et RNA-Seq bibliotek. Fordi både fodaftryk og RNA-Seq biblioteket er udarbejdet i henhold til de samme kontrollerede forhold, og kan spores tilbage til hver enkelte replikat kan Ribo-FF. og RNA-Seq datasæt sammenlignes direkte for at identificere gener, der er reguleret af ændringerne i mRNA transskription, translation effektivitet, eller af en kombineret virkning. For at identificere gener, der er op - eller nedreguleret specifikt på niveauet af protein oversættelse i hbs1Δ mutant, beregnes vi ændringer i oversættelse effektivitet ved at dividere fodaftryk rpkm værdier af mRNA rpkm for hver af generne (fig. 8 c).
Figur 1: oversigt over Ribo-Seq protokol. Hele protokollen kan udføres i ca. 11 dage. Anslået tid for hvert trin er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forberedelse af saccharose forløb Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant saccharose gradient profiler. (A) saccharose gradient profil opnået for kontrol (ikke behandlet med RNase jeg) prøven. (B) for at udtrække ribosomet-beskyttet RNA fragmenter, cellelysater er behandlet med RNase jeg i 1 time ved stuetemperatur (RT). Fraktioner, svarende til den monosomal peak er derefter indsamles for fodaftryk udvinding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder af polyacrylamidgeler 15% fremstillet efter T4 polynucleotide kinase behandling. (A) størrelsen af skåret gel skive omkring 28 og 32 nt er vist for fodaftryk prøver. (B) skåret gel skive om 50-70 nt til mRNA prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative billeder af polyacrylamidgeler 10% opnået efter reverse transkription. (A) skære det øverste bandet ~ 128 nt fodaftryk eksempler, svarer til produktet af reverse transkription. (B) skære bånd omkring 150-170 nt til mRNA prøver (øvre band). De lavere bands svarer til RT primer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: polyacrylamid gel oprensning af PCR forstærket biblioteker. PCR produkter fremstillet efter 8, 10, 12 og 14 cykler bibliotek forstærkning af er løst på en ikke-denatureringen 8% TBE gel.Størrelsen af fuld længde fodaftryk biblioteker er ~ 150 bp, der henviser til, at størrelsen af mRNA biblioteker er ~ 170-190 bp. undgå lavere bandet, der ingen indeholder Indsæt.
Figur 7: Bioanalyzer analyse. (A) repræsentant Bioanalyzer profiler af PCR forstærket fodaftryk bibliotek. Den gennemsnitlige størrelse af biblioteket fodaftryk forventes at være fra 148 til 152 nt. (B) repræsentant Bioanalyzer profiler af biblioteket sekventering fremstillet til mRNA prøver. Den forventede størrelse af mRNA bibliotek er 170-190 nt. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: repræsentative resultater. (A) antallet af mRNA, fodaftryk og rRNA læser opnået for wild-type prøve og hbs1Δ mutant. Kombinerede antal læsninger genereret af sekventering to biologiske replikater er vist for wild-type celler og hbs1Δ mutant. (B) reproducerbarhed af fodaftryk og mRNA-overflod målinger mellem to replikater. Pearson korrelationskoefficienter (R) er angivet. (C) Transcriptional og translationel ændringer i hbs1Δ mutant. Betydeligt er op-regulerede og nedreguleret gener i hbs1Δ grupperet i henhold til om de er påvirket af en ændring i mRNA transskription, translation effektivitet, eller af en kombineret virkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primere | Sekvens | Indeks | ||||
| 3' adapter (100 ng/µL) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| RT primer | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Fremad PCR primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Indeks primer 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Indeks primer 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Indeks primer 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Indeks primer 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Indeks primer 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Indeks primer 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tabel 1: 3' Adapter og primer sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ribo-Seq tilgang har vist sig som en kraftfuld teknologi til analyse af mRNA oversættelse i vivo på genome-wide niveau 3. Undersøgelser ved hjælp af denne fremgangsmåde, der tillader overvågning oversættelse med single-codon opløsning, har bidraget til forståelsen af translationel forordning. Trods sine fordele har Ribo-Seq flere begrænsninger. Ribosomale RNA (rRNA) fragmenter er altid Co renset under isolation af ribosomet-beskyttet fodspor faldende udbytte af nyttige sekventering læser, der kan opnås i Ribo-Seq eksperimenter 9,25. Vores data viser, at rRNA kontaminering kan bidrage til så mange som 40-50% af alle læser (figur 8). En af de måder at overvinde denne begrænsning er at øge sekventering dybde. Yderligere runder af sekventering bør udføres, indtil det nødvendige antal sekventering læser er opnåede for hver af de analyserede prøver. Analyse af sekventering biblioteker udarbejdet ved hjælp af vores protokollen viser, at mere end 5 millioner fodaftryk læser kan fås for hvert fodaftryk bibliotek, da 12 prøver er multipleksede sammen i en standard 50-bp single-ende køre på Illumina HiSeq 2000-platformen. Men hvis betydelig forurening med rRNA er observeret, en valgfri rRNA fjernelse trin kan udføres.
En af strategierne til at fjerne rRNA forurener fragmenter fra fodaftryk biblioteker er at bruge subtraktiv hybridisering med biotinylated oligonukleotider som tidligere beskrevet 8,26,27. Alternativt, rRNA forurener læser kan fjernes ved hjælp af kommercielt tilgængelige rRNA udtynding kits. For dette, forskere kan udføre rRNA udtynding på renset 3'-adapter-forbundet fodaftryk fragmenter fra trin 5.4. Følgende rRNA udtynding, fodaftryk prøver kan udfældes og anvendes direkte til reverse transkription (trin 6), som beskrevet i protokollen.
Ud over rensning af monosomes ved hjælp af saccharose gradient fraktionering beskrevet i vores protokol, er der blevet udviklet flere metoder, der udnytter et kolonne-baserede rensning 28 og ultracentrifugering gennem en saccharose pude 8 ,29. Mens disse metoder kan fremskynde processen med fodaftryk bibliotek forberedelse og er mindre teknisk udfordrende i forhold til saccharose gradient fraktionering, tillader de ikke kvalitativ analyse af de oprensede monosomes og effektiviteten af nukleasen fordøjelsen trin. For nylig, valget af nukleasen har vist sig at påvirke effektiviteten af rensning af ribosomet-beskyttet RNA fragmenter i forskellige arter 30. Mens RNase jeg har robust aktivitet i gær cellelysater, dens aktivitet har vist sig at påvirke integriteten af ribosomer i mus væv så godt som bananfluer. Derfor bør valget og koncentration af nukleasen optimeres ved vedtagelsen af denne protokol til andre arter.
En anden vigtig overvejelse er brugen af oversættelse-hæmmere. De fleste protokoller til ribosomet profilering indebærer typisk, behandling af celler med brudforlængelse hæmmere, såsom cycloheximide eller harringtonine, for at forhindre afstrømning af ribosomer under celle høst 3. En af begrænsningerne af brugen af oversættelse hæmmere er, at narkotika diffuse gradvis i cellen, inducerende en progressiv hæmning af ribosomer 31. Derudover hæmme narkotika ikke oversættelse indledningen eller opsigelse. Som en konsekvens, ribosomer uforholdsmæssigt ophobes på start codon og udfiskes på stop codon 8,27,31. For at begrænse denne artefakt, valgte vi at flash fryser cellerne i flydende nitrogen og behandle med cycloheximide på tidspunktet for udvinding i lysisbuffer kun.
På trods af et relativt stort antal rapporter, der har udnyttet Ribo-Seq i forskellige arter, der mangler standardiserede protokoller til at udføre Ribo-Seq analyse. Som følge heraf kan Ribo-Seq data genereret af forskellige labs ikke direkte sammenlignes. For eksempel, afsløret sammenligning af offentliggjorte ribosomet profilering datasæt væsentlige afvigelser i resultaterne blandt undersøgelser 32. Dette skyldes delvis løbende forbedringer, der er foretaget som en protokol udviklet sig over de sidste mange år. Derudover ændrede mange forskere ribosomet profilering protokol for at vedtage det til de specifikke behov i deres undersøgelse eller model system 9,25. Yderligere standardisering ribosomet profilering protokol samt ville som dataanalyser og normalisering, gøre det muligt at forebygge nogle af de eksperimentelle skævheder og sikre nøjagtige og reproducerbare kvantificering af i vivo oversættelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de nationale kontorer i sundhed tilskud AG040191 og AG054566 til VML. Denne forskning blev udført mens VML var en AFAR forskning tilskud modtager fra den amerikanske sammenslutning for aldring forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
