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Biochemistry

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Published: December 21, 2017 doi: 10.3791/56820

Summary

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Abstract

Übersetzung von mRNA in Proteine ist ein komplexer Prozess mit mehreren Schichten der Verordnung. Es wird oft angenommen, dass Veränderungen in der mRNA-Transkription in der Proteinsynthese Änderungen, aber viele Ausnahmen eingehalten worden. Vor kurzem hat sich eine Technik namens Ribosom Profilierung (oder Ribo-Seq) eine leistungsfähige Methode entwickelt, die Identifizierung, mit hoher Genauigkeit ermöglicht, welche Regionen der mRNA in Proteine und Quantifizierung des Übersetzungsdienstes der Genom-weite Ebene umgesetzt werden. Hier präsentieren wir Ihnen eine generalisierte Protokoll für genomweite Quantifizierung der Übersetzung mittels Ribo-Seq angehende Hefe. Darüber hinaus ermöglicht Kombination Ribo-Seq-Daten mit mRNA Fülle Messungen gleichzeitig Übersetzung Effizienz von Tausenden von mRNA Transkripte in der gleichen Probe zu quantifizieren und Änderungen dieser Parameter als Reaktion auf experimentelle vergleichen Manipulationen oder in verschiedenen physiologischen Zuständen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Ribosom Fußabdrücke mit Nuklease Verdauung, Isolierung von intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe über Saccharose gradient Fraktionierung und Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für tiefe Sequenzierung zusammen mit entsprechenden Qualitätskontrollen notwendig, genaue Analyse der in Vivo Übersetzung zu gewährleisten.

Introduction

mRNA Übersetzung ist eines der grundlegenden Prozesse in der Zelle, die eine wichtige bei der Regulierung der Proteinexpression Rolle. Daher wird die mRNA Übersetzung als Reaktion auf verschiedene interne und externe physiologischen Reize 1,2streng kontrolliert. Allerdings bleiben die Mechanismen der translationalen Verordnung erforschten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung. Das übergeordnete Ziel der Ribosom Profilerstellungs-Technik ist, zu studieren und die Übersetzung von spezifischen mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen zu quantifizieren. Diese Technik nutzt Next Generation Sequencing, um Ribosom Belegung im gesamten Genom quantitativ zu analysieren und ermöglicht die Überwachung der Rate des Protein-Synthese in Vivo auf der einzigen Codon Resolution 3,4. Derzeit, diese Methode bietet die modernsten Mittel zur Messung der Niveaus von Protein Übersetzung und hat sich als ein nützliches Discovery-Tool die Informationen, die von anderen derzeit verfügbaren Techniken, z.B. Microarrays offenbart werden kann nicht oder Übersetzung Status Array-Analyse (TSAA) 5. Als Ribosom Profilierung Berichte über die kombinierte Veränderungen in Abschrift Ebenen und translationale Ausgabe bietet es auch viel mehr Sensibilität gegenüber anderen Methoden.

Dieser Ansatz basiert auf Tiefe Sequenzierung des Ribosom-geschützte mRNA Fragmenten 3. Während der Protein-Übersetzung, Ribosomen zu schützen ~ 28 nt Teile der mRNA (so genannte Fußabdrücke) 6. Durch die Bestimmung der Reihenfolge der Fragmente Ribosom geschützt, kann Ribo-Seq ordnen Sie die Position der Ribosomen auf die übersetzten mRNA und ermitteln, welche Regionen der mRNA Protein 3,7aktiv übersetzt werden dürften. Darüber hinaus können wir die Übersetzung von mRNA quantitativ messen, durch zählen der Anzahl der Spuren, die zu einem bestimmten mRNA-Transkript ausgerichtet.

Um das Ribosom-geschützten Fragmente zu isolieren, sind Zelle Lysates zunächst mit einem Inhibitor der Übersetzung, die Ribosomen, gefolgt von Ribonuklease Verdauung stall behandelt. Während kostenlose mRNA und Teile der übersetzten mRNAs nicht geschützt von Ribosomen von Ribonuklease abgebaut werden, können die Ribosom geschützt mRNA Fragmenten durch Reinigung intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe wiederhergestellt werden. Diese mRNA Fußabdrücke sind dann in cDNA Bibliothek umgewandelt und durch tiefe Sequenzierung (Abbildung 1) analysiert. Parallel zur Profilerstellung Ribosom ist intakt mRNA aus derselben Probe extrahiert und sequenziert. Durch Vergleich des Übersetzung von Ribo-Seq mit mRNA Fülle Messungen identifiziert, können wir identifizieren Gene, speziell Up - oder Down-reguliert auf der Ebene der Übersetzung und Übersetzung Effizienz der mRNA auf Genom-weite Ebene zu berechnen. Während des Protokolls, die in diesem Artikel beschriebenen spezifisch für Hefe ist, sollte es auch nützlich für Forscher, die versuchen, das Ribo-Seq-Protokoll in andere Systeme zu etablieren.

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Protocol

1. Vorbereitung extrahieren

  1. Streak Hefestämme von gefrorenen Vorräte für einzelne Kolonien auf YPD Platten (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose und 2 % Agar). 2 Tage inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C.
  2. Hefe aus einer YPD-Platte (verwenden Sie eine einzelne Kolonie) in 15 mL YPD Medium (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose) in einem 50 mL konische Zentrifugenröhrchen impfen und wachsen über Nacht mit schütteln (200-250 u/min) bei 30 ° C.
  3. Verdünnen Sie Kultur in 500 mL YPD Medium in einem 2 L sterile Kolben, so dass die OD600 < 0,1. Wachsen Hefezellen unter Schütteln bei 30 ° C für 3-5 h bis OD600 = 0,5 (Mid Log-Phase).
  4. Sammeln Sie Zellen durch Filterung durch 0,45 μm Membranfilter mit Filter Glasaufbau Halter. Kratzen die Pellets mit einem Spatel, Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C. Die erwartete Größe des gefrorenen Pellet ist ~ 0,2 - 0,5 g.
    Achtung: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.
  5. Bereiten Sie einen frischen Lysis Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, MgCl2, 5 mM 100 μg/mL Cycloheximide, 0,5 mM DVB-t, 1 % Triton x-100) unmittelbar vor der Verwendung, halten Sie auf dem Eis.
  6. Genommen Sie 3 Chromstahl Perlen (3,2 mm) in einem Edelstahlrohr 1,8 mL. Pre-chill in flüssigem Stickstoff und gefrorenen Pellets hinzufügen, abdecken mit einer Silikon-Gummikappe. Homogenisieren die Probe durch Cryogrinding für 10 s bei 4200 u/min; Wiederholen Sie 10-Mal. Chill-das Rohr in flüssigem Stickstoff für mindestens 10 s zwischen jeder Runde.
    Hinweis: Es ist wichtig, immer die Probe gefroren zu halten.
  7. Fügen Sie 1 mL Lyse-Puffer, mischen Sie gut durch pipettieren. Übertragen Sie in eine neue 1,5 mL Tube.
  8. Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Während der Arbeit auf dem Eis, übertragen Sie den Überstand in eine neue 1,5 mL Tube. Eine neue 1,5 mL Tube für Poly-mRNA-Isolierung übermitteln Sie 100 μL der lysate. Gehen Sie sofort zur RNA-Isolierung oder Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff das Rohr. Maßnahme OD260 der übrigen lysate, die für Footprint Extraktion verwendet wird, und flash Einfrieren der Rohre in flüssigem Stickstoff. Speichern der Lysates bei-80 ° C.

2. Bilanz Extraktion

  1. Vorbereitung der Saccharose Steigungen
    1. Erarbeiten Sie Lösungen für 50 %, 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Saccharose in Gradient Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL Cycloheximide, 0,5 mM DVB-t).
    2. Pipette 2,2 mL bereit 50 % Saccharose Puffer an der Unterseite der 13,2 mL dünnwandige Polyallomer Röhre und frieren die Lösung für 10 min bei-80 ° C (Abbildung 2). Dann Schicht 2,2 mL 40 % Saccharose Puffer auf den gefrorenen 50 % Saccharose Puffer, und für 10 min bei-80 ° c eingefroren Nach den gleichen Anweisungen Schicht 30 %, dann 20 %, und schließlich 10 % Saccharose puffert oben auf der jeweils anderen. Verhindern Sie, dass Luftblasen während Schichtung. Halten Sie die Steigungen bei-80 ° C bis zur Verwendung. Die Saccharose Steigungen sollten mindestens einen Tag vor dem Experiment vorbereitet und bei-80 ° C.
  2. Nuklease Verdauung
    1. Auftauen der Saccharose Steigungen am Vorabend Experimente bei 4 ° C.
    2. Zelle lysate (Footprint Probe) auf Eis auftauen. Übertragen Sie eine aliquote Zelle lysate, enthält 50 OD260 Einheiten zu einem neuen 1,5 mL Schlauch geben und frische Lysis Puffer bis zu 1 mL. Speichern Sie die restlichen lysate bei-80 ° C. Fügen Sie 10 μl RNase ich (100 U/μl) und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur mit sanften Drehung auf ein Kopf-über-Kopf-Rotator.
    3. (Optional) Klären Sie die Proben bei 20.000 x g für 5 min bei 4 ° C und erholen Sie den Überstand in ein neues 1,5 mL Röhrchen zu.
  3. Ultrazentrifugation
    1. Sanft Schicht lysate Proben an die Spitze eines 10-50 % Saccharose Gradienten.
    2. Ultrazentrifugen der Polyallomer Röhren bei 210.000 x g (35.000 u/min) bei 4 ° C für 3 h mit SW-41 Ti Rotor.
  4. Gradient Fraktionierung Systemeinrichtung
    1. Schalten Sie die Komponenten und ermöglichen Sie die UV-Monitor zum Aufwärmen für mindestens 30 min.
    2. Wenn mit einem digitalen Recorder-Software starten Sie die Software auf dem Computer, legen Sie das Diagramm Skalierungsgrenzen auf -0,01 und 1.
    3. Füllen Sie die Spritze mit Chase Lösung (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60 % Saccharose), entfernen Sie eventuelle Luftblasen in der Spritze und Kanüle.
    4. Installieren einer Ultrazentrifuge Rohres gefüllt mit RNase-freies Wasser. Durchbohren Sie das Rohr mit der Kanüle, bis zwei schwarze Flecken zu sehen. Starten Sie die Spritzenpumpe bei 1 mL/min.
    5. Während das Wasser die Durchflusszelle durchläuft, Taste "Auto Zero" auf dem UV-Monitor Basislinie auf 0 einstellen. Stellen Sie die Empfindlichkeit der UV-Monitor zu "2.0 AU". Nach eine stabilere Basislinie eingerichtet wurde, die Spritzenpumpe zu stoppen. Wiederherstellen Sie die Chase-Lösung und entfernen Sie der Ultrazentrifuge Rohr zu.
  5. Monosome Isolierung
    1. Installieren Sie und durchbohren Sie die Ultrazentrifuge Röhrchen mit der Saccharose-Gradient. Starten Sie die Spritzenpumpe bei 1 mL/min, sammeln Sie 1 mL Fraktionen Überwachung ein254 Werte zu. Pool-Fraktionen vertreten die 80er Jahre Monosome Höhepunkt in einem Rohr, halten Sie auf dem Eis (Abbildung 3).
    2. Chase Lösung die Messzelle erreicht, schalten Sie Spritzenpumpe aus. Chase Lösung zu erholen und der Ultrazentrifuge Rohr zu entfernen. Wiederholen Sie für den Rest der Proben ab Schritt 2.5.1 Fraktionierung.
      Hinweis: Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie die Fraktionierung System mit mindestens 30 mL der RNase-freies Wasser. Schlauch, Spritze und alle austauschbaren Komponenten mit warmem Wasser gründlich zu waschen.
    3. Filtern der Brüche durch 0,5 mL zentrifugale Filter (100 kDa MWCO) bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C und die Durchströmung zu verwerfen, wiederholen, bis Volumen ist < 100 μL. 400 μl des Release-Puffers (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase-Inhibitor) hinzufügen. Mix von pipettieren, brüten auf Eis 10 min und übertragen Sie das Gerät in eine neue Kollektion-Röhre. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C und die Durchströmung zu sammeln.
  6. Fußabdruck Fragment Reinigung
    1. Die Durchströmung mit Fußabdruck RNA Fragmente eine neue 1,5 mL tube, fügen Sie 20 μL 20 % SDS (um eine Endkonzentration von 1 %), mischen, indem Sie pipettieren zu übertragen.
    2. Fügen Sie 1 Volumen von Säure-Phenol: Chloroform (pH 4,5), Wirbel für 10 s.
      Achtung: Säure-Phenol: Chloroform ist giftig, vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Inhalation.
    3. Bei 65 ° C für 5 min erhitzen, auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C gelegt, die wässrige Phase (oben) auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
    4. Fußabdruck-RNA-Fragmente durch Hinzufügen von 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt.
Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(3) Poly-mRNA-Extraktion

  1. Insgesamt RNA-Extraktion
    1. Tauen Sie ein 100 μL aliquoten Zelle lysate (Gesamt-RNS -Probe) auf Eis auf, fügen Sie 300 μl 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und 20 μL 20 % SDS (um eine Endkonzentration von 1 %), mischen, indem Sie pipettieren.
    2. Fügen Sie 1 Volumen (400 μl) von Säure-Phenol: Chloroform (pH 4,5) und Vortex für 10 s.
    3. Bei 65 ° C für 5 min erhitzen, auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C gelegt, die wässrige Phase (oben) auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
    4. Führen Sie eine zweite Phenol Extraktion. Fügen Sie 1 Volumen von Säure-Phenol: Chloroform (pH-Wert 4,5), Wirbel für 10 S. Hitze bei 65 ° C für 5 min auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die wässrige Phase auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
    5. Überstürzen Sie sich die RNA. Dafür fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
  2. Poly-mRNA-Isolierung
    1. Die RNA-Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C zentrifugiert, Ethanol zu entfernen. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und Pellet für 5 min der Luft trocknen lassen.
    2. Das Pellet in 300 μL der Lyse/Bindung Puffer aus dem poly(A) mRNA Isolierungskit auflösen. Fahren Sie mit Poly-mRNA-Extraktion nach poly(A) mRNA isoliert Kit des Herstellers Protokoll.
    3. Die mRNA-Proben durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
  3. mRNA-Fragmentierung
    1. Zentrifugieren Sie die mRNA-Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 sec, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit Gel-Tip und das Pellet für 5 min lufttrocknen.
    2. Aufschwemmen Sie mRNA in 18 μl RNase-freies Wasser, fügen Sie 2 μl 10 x RNA Fragmentierung Puffer. 5 min bei 94° c inkubieren Rohr zu Eis zu übertragen.
    3. Durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(4) dephosphorylation

  1. Footprint und fragmentierten mRNA Proben mit T4-Polynukleotid-Kinase zu behandeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einem Gel laden Tipp. Das Pellet für 5 min der Luft trocknen lassen.
  2. Aufschwemmen Sie das Pellet in 7,75 µL Wasser, fügen Sie 1 µL 10 x T4 Polynukleotid Kinase Puffer, 1 µL T4-Polynukleotid-Kinase (10.000 U/mL) und 0,25 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL). 1 h bei 37 ° c inkubieren
  3. (Optional) Vorab laufen Sie eine 15 %-TBE-Harnstoff-Gel bei 180 V für 15 min mit 1 X TBE Puffer.
  4. 10 µL jeder Fußabdruck und mRNA Probe 10 µL 2 X TBE-Harnstoff Probenpuffer hinzufügen. Bereiten Sie ein Beispiel für ein Steuerelement mit 1 µL 10 µM obere Größe Marker Oligonukleotid (32 nt), 1 µL 10 µM geringer Größe Marker Oligonukleotid (28 nt), 8 µL Wasser und 10 µL 2 x TBE-Harnstoff Probenpuffer für Footprint Proben. Bereiten Sie ein Beispiel für ein Steuerelement mit 1 µL 10 µM RNA Marker Oligonukleotid (63 nt), 9 µL Wasser und 10 µL 2 x TBE-Harnstoff Probenpuffer für mRNA Proben.
  5. Die Proben und Kontrollen 3 min bei 75 ° C inkubieren, spin-down, auf Eis gelegt, für 1 min. jede Probe in 2 Brunnen des 15 % FSME-Harnstoff Gels, getrennten RNA-Fragmente durch Gelelektrophorese bei 180 V 1 h laden.
  6. Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen.
  7. Mit einer blauen Licht Transilluminator, schneiden die richtige Band zwischen 28 und 32 nt Marker für Fußabdruck Proben (Abb. 4A) und rund Proben 50-70 nt für mRNA (Abbildung 4 b) mit einer sauberen Rasierklinge. Frieren Sie die Polyacrylamid-Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.
  8. Extrahieren Sie RNA aus dem Polyacrylamid-Gel wie folgt. Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2 min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren RNA mit 300 µL Elution Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA), fügen Sie 1 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.
  9. Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(5) 3'-Adapter Ligation

  1. Zentrifugieren Sie die Footprint und mRNA Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
  2. Das Pellet in 4.75 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen, 2 µL 50 % PEG8000, 1 µL 10 X T4 RNA Ligase Puffer, 1 µL 3'-Adapter (100 ng/µL), 0,25 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) 1 µL T4 RNA Ligase 2 abgeschnitten KQ (200.000 U/mL). Inkubation über Nacht bei 16 ° C.
  3. Am nächsten Morgen, entfernen Sie das überschüssige des Adapters durch Zugabe von 0,5 µL 5'-Deadenylase (10 U/µL) und 0,5 µL Rec J Exonuclease (10 U/µL) direkt an die Ligatur-Reaktion. 30 min. bei 30 ° c inkubieren
  4. Die Proben auszufällen. Hierzu fügen Sie 30 µL Nuklease-freies Wasser, 1 µL Glykogen (10 mg/mL), 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5) und 2,5 Bände von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(6) reverse Transkription

  1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
  2. Aufschwemmen Sie das Pellet in 11,5 µL Nuklease-freies Wasser, 0,5 µL 8 µM reversen Transkription Grundierung (RT Primer) und 1 µL dNTP-Mix (10 mM). 5 min bei 65 ° C inkubieren, auf Eis legen.
  3. Fügen Sie 4 µL 5 X ersten Strang Puffer, 2 µL 0.1 M DTT, 0,5 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL), 0,5 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL). 30 min bei 48 ° C, 1 min bei 65 ° C, 5 min bei 80 ° c inkubieren
  4. Nicht überstürzen und gehen Sie sofort auf die Hydrolyse von RNA, durch Zugabe von 0,8 µL 2 M NaOH, 30 min bei 98 ° c inkubieren Hinzufügen von 0,8 µL 2M HCl Reaktion zu neutralisieren.
  5. Die Proben auszufällen.
Hierzu fügen Sie 20 µL Nuklease-freies Wasser, 1 µL Glykogen (10 mg/mL), 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5) und 2,5 Bände von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
  • Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
  • Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 µL Nuklease-freies Wasser, fügen Sie 5 µL 2 X Probenpuffer FSME-Harnstoff. 3 min bei 75 ° C inkubieren, spin-down, für 1 min auf Eis gelegt.
  • (Optional) Bereits laufen Sie eine 10 %-TBE-Harnstoff-Gel bei 180 V für 15 min mit 1 X TBE-Puffer.
  • Laden Sie die Probe auf 1 auch von der 10 %-TBE-Harnstoff-Gel. Trennen Sie die Produkte der reversen Transkription Reaktion durch Gelelektrophorese auf 180 V 50 min. Als Kontrolle bereiten Sie eine Probe mit 1 µL 2,5 µM RT Primer, 1 µL 2,5 µM 128 nt Marker Oligonukleotid, 3 µL Wasser und 5 µL 2 X TBE-Harnstoff Puffer zu probieren, und führen Sie auf einer separaten Spur des Gels.
  • Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen. Schneiden Sie mit einem blauen Licht Transilluminator Band rund 128 nt und höher (Abbildung 5) mit einer sauberen Rasierklinge. Frieren Sie die Polyacrylamid-Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.
  • Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren DNA mit 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.
  • Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
  • (7) circularization

    1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
    2. Das Pellet in 16,75 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Fügen Sie 2 µL 10 x einzelsträngiger DNA (SsDNA) Ligase Puffer, 1 µL 50 mM MnCl2, 0,25 µL SsDNA Ligase (100 U/µL). 1 h bei 60 ° C, 10 min bei 80 ° c inkubieren Nicht überstürzen Sie, und speichern Sie das Reaktionsprodukt SsDNA Ligatur bei-20 ° C.

    (8) PCR-Bibliothek-Verstärkung

    1. Während der Arbeit auf dem Eis, mischen die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 146 µL Nuklease-freies Wasser, 2 µL 20 µM Forward Primer, 2 µL 20 µM indiziert Reverse Primer, 40 µL 5 x High Fidelity DNA Plymerase Puffer, 4 µL von dNTPs (10 mM), 4 µL SsDNA Ligatur Reaktionsprodukt , und 2 µL der High-Fidelity-DNA-Polymerase. Wählen Sie verschiedene indiziert Reverse Primer für jede Probe, die für die Sequenzierung gemultiplext werden. Übertragen Sie eine aliquote 50 µL des PCR-Gemisches in 4 neue PCR-Rohre.
    2. Führen Sie die PCR-Amplifikation mit einer unterschiedlichen Anzahl von Zyklen (8, 10, 12, 14) mit folgenden Einstellungen:
      1 min bei 98 ° C erste Denaturierung
      8 bis 14 Zyklen:
      15 s bei 94 ° C
      5 s bei 55 ° C
      10 s bei 65 ° C
      2 min bei 65 ° C letzte Verlängerung
    3. Das PCR-Produkt durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und lufttrocknen Pellet.
    5. Aufschwemmen Sie das Pellet in 8 µL Nuklease-freies Wasser, fügen Sie 2 µL nicht Denaturierung 5 x Probenpuffer Nukleinsäure. Laden Sie die Probe auf 1 auch von nicht-Denaturierung 8 % TBE Gel. Trennen Sie die DNA-Produkte durch Gelelektrophorese auf 150 V für 35 min. Als Kontrolle bereiten Sie eine Probe mit 0,5 µL 10 bp DNA-Leiter (1 µg/µL), 7,5 µL Wasser und 2 µL nicht Denaturierung 5 x Probenpuffer Nukleinsäure und führen auf eine separate Spur des Gels.
    6. Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen. Schneiden Sie mit einem blauen Licht Transilluminator Band rund 150 bp für Fußabdruck Proben und rund 180 bp für mRNA Proben (Abbildung 6) mit einer sauberen Rasierklinge. Speichern Sie die Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.
    7. Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2 min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren DNA mit 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.
    8. Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
    9. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und lufttrocknen Pellet. Zu guter Letzt Aufschwemmen Sie die Bibliotheken in 20 µL Nuklease-freies Wasser und fahren Sie mit Quantifizierung, Qualitätskontrolle und Sequenzierung.

    9. Bibliothek Quantifizierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung

    1. Vor dem Senden der Proben für die Sequenzierung, bestimmen Sie den Ertrag und die Qualität der PCR verstärkt Bibliotheken. Repräsentative Profile für Bilanz und mRNA Sequenzierung Bibliotheken sind in Abbildung 7dargestellt. Die erwartete Größe der PCR verstärkt Bibliothek ist 148-152 bp für Footprint Proben und 170-190 bp für mRNA Proben.
    2. Wenn mehrere Proben mit verschiedenen Barcodes für die Sequenzierung gebündelt werden werden, führen Sie genaue Quantifizierung der Bibliotheken mit einem qPCR-basierte Sequenzierung Bibliothek Quantifizierung Assay.
    3. Bündeln Sie die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnisse. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Pools als 3 µL x Gesamtzahl der Proben, gebündelt werden. Bestimmen Sie die Lautstärke für jede Bibliothek, die hinzugefügt werden, so dass Bibliotheken in der äquimolaren Verhältnisse bis 10 nM Endkonzentration des Pools zu erreichen gemischt werden muss. Fügen Sie die berechneten Mengen jeder Bibliothek in ein neues 1,5 mL Röhrchen, durch Pipettieren mischen. Fügen Sie Wasser hinzu, um die berechneten Gesamtvolumen zu erreichen. Speichern von gepoolten Bibliotheken bei-20 ° C.
    4. Senden Sie ein Aliquot der gepoolten Bibliothek mit 50 bp Einend-Sequenzierung laufen auf einer Plattform Illumina Sequenzierung sequenziert werden. Wir routinemäßig multiplex-12 Proben in einem einzigen Sequenzierung ausgeführt, welche Erträge ~ 200 Millionen pro Sequenzierung Bahn liest.
      Hinweis: Die endgültige Anzahl der Fußabdruck Lesevorgänge pro jede Probe gesammelt richtet sich nach der Menge des verwendeten ein- und rRNA Verschmutzungsgrad.

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    Representative Results

    Detaillierten Rohrleitungen für bioinformatische Analyse der Ribosom Profilerstellungsdaten wurden 8,9beschrieben. Darüber hinaus haben mehrere Forschungsgruppen entwickelt Bioinformatik für differenzielle gen Ausdruck Analyse und Aufbereitung von Sequenzierungsdaten, die spezifisch für Ribosom Profilerstellung Methode 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. Der erste Schritt bei der Analyse der Daten der Ribo-Seq Entpackung und trimmen Adapter Sequenz 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT mit Cutadapt Software 19. Dann orientieren sich die Sequenzierung liest gegen nicht-kodierende RNAs, wie rRNA und tRNA, mit Bowtie 20 um kontaminierende Sequenzen zu entfernen und liest, die nicht ausrichten dann Hefegenoms zugeordnet sind. Anzahl pro gen dann durch HTseq-Count Software 21beurteilt werden kann, und differentiell exprimierten Gene identifiziert mit DESeq2 22zu lesen.

    Abbildung 8 zeigt repräsentative Ergebnisse der quantitativen Analyse der Übersetzung in hbs1Δ 23,24 Hefe Löschung Mutante, die mit unserem Protokoll erzielt wurden. Zunächst untersuchten wir die Anzahl und Anteil der Lesevorgänge, die nicht-kodierender RNA (z. B. rRNAs) erhalten nach der Sequenzierung Fußabdruck und mRNA Bibliotheken generiert für Wildtyp Zellen und die hbs1Δ mutierten entsprechen. Wir fanden, dass, sogar ohne rRNA Erschöpfung Schritte (siehe unten), von 50 bis 60 % der alle sequenzielle Lesevorgänge in unseren Fußabdruck Bibliotheken Ribosom-geschützte Stellfläche Fragmente (Abb. 8A) entsprechen. Im Gegensatz dazu verzeichneten nur 3 % der rRNA-abgeleitete Fragmente mRNA-Bibliotheken zeigen, dass poly(A) mRNA Isolierung effektive Beseitigung der rRNA mal gelesen ermöglicht. Zusammen konnten wir mehr als 10 Millionen Fußabdruck liest für jede der Fußabdruck Proben erhalten durch Sequenzierung 2 Wiederholungen. Um die Variabilität der Bibliothek Generation und Reproduzierbarkeit der Daten zu beurteilen, analysieren wir in der Regel mindestens zwei unabhängige biologische Wiederholungen pro jede experimentelle Bedingung. Platzbedarf und mRNA-Sample-Libraries zeigen gute Reproduzierbarkeit mit Pearson-Korrelationskoeffizient R ~ 0,99 zwischen übereinstimmenden Muster (Abb. 8 b).

    Neben der Bewertung des Proteins des Übersetzungsdienstes der Genom-weite Ebene, ermöglicht Ribosom Profilerstellung Änderungen in Übersetzung Effizienz zwischen experimentellen Bedingungen 3messen. Hierzu wird ein Aliquot der Zelle lysate (nicht mit Ribonuklease behandelt) für poly(A) mRNA isoliert und Vorbereitung einer RNA-Seq-Bibliothek verwendet. Da sowohl Fußabdruck und RNA-Seq-Bibliothek unter den gleichen kontrollierten Bedingungen bereit sind und auf jeden einzelnen replizieren geht, können Ribo-Seq und RNA-Seq Datasets direkt verglichen werden um Gene zu identifizieren, die von den Änderungen im mRNA reguliert werden Transkription, Übersetzung Effizienz, oder durch eine kombinierte Wirkung. Um Gene zu identifizieren, die Up - oder Down-reguliert speziell auf der Ebene der Protein-Übersetzung in die hbs1Δ mutierten, dividiert wir Änderungen in Übersetzung Effizienz Fußabdruck Rpkm Werte durch mRNA Rpkm für jedes der Gene (Abbildung 8).

    Figure 1
    Abbildung 1: Überblick über das Protokoll Ribo-Seq. Das gesamte Protokoll kann in etwa 11 Tage durchgeführt werden. Geschätzte Zeit für jeden Schritt wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2: Vorbereitung der Saccharose Steigungen Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3: repräsentative Saccharose gradient Profile. (A) Saccharose gradient Profil erhalten zur Kontrolle (nicht behandelt mit RNase ich) Probe. (B) um Ribosom geschützt RNA-Fragmente zu extrahieren, werden Zelle Lysates mit RNase behandelt ich für 1 h bei Raumtemperatur (RT). Fraktionen entsprechend dem monosomal Gipfel werden dann zum Fußabdruck Extraktion gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4: repräsentative Bilder 15 % Polyacrylamid-Gele nach T4-Polynukleotid-Kinase-Behandlung erhalten. (A) die Größe der ausgeschnittenen Gel-Schicht um 28 und 32 nt ist für Fußabdruck Proben gezeigt. (B) der Gel-Scheibe schneiden über 50-70 nt für mRNA Proben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5: repräsentative Bilder von der 10 % Polyacrylamid-Gele nach der reversen Transkription erhalten. (A) schneiden Sie das obere Band ~ 128 nt für Fußabdruck Proben entspricht dem Produkt der reversen Transkription. (B) schneiden Sie die Band um 150-170 nt für die mRNA-Proben (obere Band). Die unteren Bänder entsprechen der RT-Primer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 6
    Abbildung 6: Polyacrylamid-Gel Reinigung der PCR verstärkt Bibliotheken. PCR-Produkte nach 8, 10, 12 und 14 Zyklen der Bibliothek Verstärkung erhalten wurden behoben auf einem nicht-Denaturierung 8 % TBE Gel.Die Größe der Full-length-Fußabdruck Bibliotheken ist ~ 150 bp, während die Größe der mRNA Bibliotheken ~ 170-190 ist BP. vermeiden Sie das untere Band, die nicht einfügen enthält.

    Figure 7
    Abbildung 7: Bioanalyzer Analyse. (A) Vertreter Bioanalyzer Profile der PCR verstärkt Präsenz-Bibliothek. Die durchschnittliche Größe der Footprint-Bibliothek wird voraussichtlich von 148 bis 152 nt. (B) Vertreter Bioanalyzer Profile der Sequenzierung Bibliothek für mRNA Proben erhalten. Die erwartete Größe der mRNA-Bibliothek ist 170-190 nt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 8
    Abbildung 8: repräsentative Ergebnisse. (A) Anzahl der mRNA, Platzbedarf und rRNA Lesevorgänge für Wildtyp Probe und die hbs1Δ mutierten erhalten. Gesamtzahl der Lesevorgänge erzeugt durch Sequenzierung, die zwei biologische repliziert werden für Wildtyp Zellen und die hbs1Δ mutierten angezeigt. (B) Reproduzierbarkeit der Fußabdruck und mRNA-Fülle Messungen zwischen zwei repliziert. Pearson Korrelationskoeffizienten (R) sind angegeben. (C) Transcriptional und translational Änderungen in die hbs1Δ mutierten. Deutlich sind oben geregelt und Down-regulierten Gene in hbs1Δ gruppiert, in Übereinstimmung mit, ob sie durch eine Änderung in mRNA-Transkription, Übersetzung Effizienz, oder durch eine kombinierte Wirkung betroffen sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Primer Sequenz Index
    3' Adapter (100 ng/µL) / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC /
    RT-Grundierung pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    Nach vorne PCR-primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG
    Index-Primer 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ATCACG
    Index-Grundierung 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT CGATGT
    Index-Primer 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TTAGGC
    Index-Grundierung 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TGACCA
    Index-Grundierung 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ACAGTG
    Index-Grundierung 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT GCCAAT

    Tabelle 1: 3' Adapter und Primer-Sequenzen.

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    Discussion

    Die Ribo-Seq-Ansatz ist eine leistungsstarke Technologie für die Analyse von mRNA Übersetzung in Vivo bei der Genom-weite Ebene 3entstanden. Studien mit diesem Ansatz, der ermöglicht die Überwachung von Übersetzung mit Single-Codon Auflösung, hat zu unserem Verständnis der translational Regelung beigetragen. Trotz seiner Vorteile hat Ribo-Seq mehrere Einschränkungen. Ribosomale RNA (rRNA) Fragmente sind immer Co gereinigten während Isolierung des Ribosom-geschützte Fußabdrücke verringern den Ertrag der nützliche Sequenzierung liest, die Ribo-Seq Experimente 9,25erzielt werden kann. Unsere Daten zeigen, dass rRNA Kontamination zu weniger als 40-50 % der alle Lesevorgänge (Abbildung 8) beitragen kann. Eine der Möglichkeiten, um diese Einschränkung zu umgehen ist die Sequenzierung Tiefe zu erhöhen. Weitere Runden der Sequenzierung sollte durchgeführt werden, bis die erforderliche Anzahl der Sequenzierung lautet für jeden der analysierten Proben erreicht ist. Analyse der Sequenzierung Bibliotheken bereit, mit unserem Protokoll zeigt, dass mehr als 5 Millionen Fußabdruck liest für jede Präsenz-Bibliothek erhalten können, wenn 12 Proben zusammen in einem standard 50 bp Einend-laufen auf Illumina Leseweite 2000 Plattform gemultiplext werden. Wenn erhebliche Kontamination mit rRNA beobachtet wird, kann ein optionaler Schritt der rRNA-Entfernung durchgeführt werden.

    Eine der Strategien, rRNA verunreinigen Fragmente aus Fußabdruck Bibliotheken zu entfernen ist mit subtraktiven Hybridisierung mit der biotinylierte Oligonukleotiden wie zuvor beschrieben, 8,26,27. Alternativ kann rRNA verunreinigen liest mit kommerziell erhältlichen rRNA Erschöpfung Kits entfernt werden. Hierzu können Forscher rRNA Erschöpfung auf gereinigten 3'-Adapter-ligiert Fußabdruck Fragmente aus Schritt ausführen 5.4. Folgenden rRNA Erschöpfung, Fußabdruck Proben ausgefällt und direkt zum reverse Transkription (Schritt 6) verwendet, wie im Protokoll beschrieben werden können.

    Neben der Reinigung des Monosomes mit Saccharose gradient Fraktionierung in unserem Protokoll beschrieben wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine Spalte-basierte Reinigung 28 und Ultrazentrifugation durch eine Saccharose-Kissen 8 nutzen ,29. Während diese Methoden den Prozess der Fußabdruck Bibliothek Vorbereitung beschleunigen können und sind technisch weniger anspruchsvoll im Vergleich zu Saccharose gradient Fraktionierung, erlauben nicht Qualitative Analyse des gereinigten Monosomes und Effizienz der Nuklease Sie Schritt der Verdauung. Vor kurzem hat die Wahl der Nuklease nachweislich Einfluss auf die Effizienz der Reinigung des Ribosom-geschützte RNA-Fragmente in verschiedenen Arten 30. Während RNase ich robuste Aktivität in Hefe Zelle Lysates, seine Tätigkeit hat gezeigt worden, um die Integrität der Ribosomen in Maus Geweben sowie wie Fruchtfliegen zu beeinflussen. Daher sollte die Wahl und die Konzentration der Nuklease optimiert werden, bei der Annahme dieses Protokolls auf andere Arten.

    Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung der Übersetzung-Inhibitoren. Die meisten Protokolle für die Profilerstellung Ribosom typischerweise Behandlung von Zellen mit Dehnung-Inhibitoren, wie z. B. Cycloheximide oder Harringtonine, um den Abfluss von Ribosomen in Zelle 3ernten vorzubeugen. Die Einschränkungen bei der Verwendung von Translation-Inhibitoren gehört, dass die Medikamente schrittweise in die Zelle diffundieren induzieren eine progressive Hemmung der Ribosomen 31. Die Medikamente hemmt darüber hinaus nicht Übersetzung Einleitung oder Kündigung. Infolgedessen Ribosomen überproportional auf dem Start-Codon ansammeln und bei Stopp-Codon 8,27,31erschöpft sind. Um dieses Artefakt zu begrenzen, wir entschieden uns für Flash-Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren und zum Zeitpunkt der Extraktion in Lyse nur Puffer mit Cycloheximide behandeln.

    Trotz relativ viele Berichte, die in der verschiedenen Sorte Ribo-Seq genutzt haben, fehlen standardisierte Protokolle Ribo-Seq-Analyse durchführen. Folglich können nicht von verschiedenen Labors erzeugte Ribo-Seq-Daten direkt verglichen werden. Vergleich der veröffentlichten Ribosom Profilerstellung Datasets offenbart beispielsweise erhebliche Unterschiede in den Ergebnissen unter Studien 32. Dies liegt teilweise an kontinuierlichen Verbesserungen, die als das Protokoll entwickelte sich in den letzten Jahren gemacht wurden. Darüber hinaus verändert viele Forscher das Ribosom profiling-Protokoll, um auf die spezifischen Bedürfnisse ihrer Studien- oder Modell System 9,25anzunehmen. Weitere Standardisierung das Ribosom Profilerstellung Protokoll sowie Datenanalyse und Normalisierung, würde erlauben, einige der experimentellen Verzerrungen zu verhindern sowie genaue und reproduzierbare Quantifizierung der in Vivo Übersetzung zu gewährleisten.

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    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Stipendien, AG040191 und AG054566, VML unterstützt. Diese Studie wurde durchgeführt, während VML ein AFAR Research Grant von der American Federation for Aging Research erhielt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
    0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
    0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
    10X TBE buffer Invitrogen AM9863
    10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
    15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
    2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
    2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
    3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
    5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
    8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
    Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
    Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
    Cryogrinder Biospec product 3110BX
    Cycloheximide RPI C81040-5.0
    Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
    Glycogen Invitrogen AM9510
    Gradient fractionation system Brandel BR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
    Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
    Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
    Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
    RNA fragmentation buffer NEB E6186A
    RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
    Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
    ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
    Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
    Sucrose RPI S24060-5000.0
    SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
    Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
    T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
    Thermal cycler Bio-Rad 1851148
    Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
    Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
    UV monitor Bio-Rad 7318160
    Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

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