Summary
Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Tradução do RNAm em proteínas é um processo complexo que envolve várias camadas do regulamento. Muitas vezes supõe-se que as alterações na transcrição de mRNA refletem alterações na síntese proteica, mas muitas exceções foram observadas. Recentemente, uma técnica chamada Ribossoma perfilação (ou Ribo-Seq) surgiu como um método poderoso que permite a identificação, com alta precisão, quais as regiões de mRNA são traduzidas em proteínas e quantificação de tradução a nível de todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo de generalizadas para quantificação de todo o genoma de tradução usando Ribo-Seq no fermento de brotamento. Além disso, combinar dados Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA nos permite quantificar simultaneamente a eficiência de conversão de milhares de transcrições de mRNA na mesma amostra e comparar alterações desses parâmetros em resposta a experimental manipulações ou nos diferentes Estados fisiológicos. Descreveremos um protocolo detalhado para geração de pegadas de Ribossoma usando digestão nuclease, isolamento de complexos de Ribossoma-pegada intacta através de fracionamento de gradiente de sacarose e preparação de bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo juntamente com o apropriado controles de qualidade necessários para garantir uma análise precisa da tradução na vivo .
Introduction
Tradução de mRNA é um dos processos fundamentais na célula, que desempenha um papel importante na regulação da expressão da proteína. Portanto, a tradução de mRNA é rigidamente controlada em resposta a diferentes estímulos fisiológicos internos e externos, 1,2. No entanto, os mecanismos de regulação traducional permanecem pouco estudados. Aqui, descrevemos o protocolo para a quantificação de todo o genoma da tradução em leveduras brotamento pelo Ribossoma perfilação. O objectivo geral da técnica de criação de perfil ribossoma é estudar e quantificar a tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. Esta técnica usa o sequenciamento de próxima geração para analisar quantitativamente a ocupação do ribossomo ao longo do genoma e permite monitorar a taxa de proteína síntese na vivo no códon única resolução 3,4. Atualmente, este método fornece os meios mais avançados de medição dos níveis de tradução da proteína e provou para ser uma ferramenta de descoberta útil, fornecendo informações que não podem ser reveladas por outras técnicas atualmente disponíveis, por exemplo, microarrays ou Tradução estado matriz análise (TSAA) 5. Como o ribossoma relatórios sobre as alterações combinadas em níveis de transcrição e translação saída de criação de perfil, ele também fornece sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos.
Esta abordagem baseia-se na profundo sequenciamento de fragmentos de mRNA ribossomo-protegido 3. Durante a tradução de proteínas, ribossomas proteger ~ 28 porções de nt do mRNA (chamado pegadas) 6. Determinando a sequência dos fragmentos protegidos Ribossoma, Ribo-Seq pode mapear a posição dos ribossomas no mRNA traduzido e identificar quais as regiões de mRNA são susceptíveis de ser ativamente traduzido em proteína 3,7. Além disso, quantitativamente podemos medir a tradução de mRNA pela contagem do número de pegadas que se alinham para uma determinado transcrição de mRNA.
Para isolar os fragmentos protegidos Ribossoma, lisados celulares são inicialmente tratados com um inibidor de tradução para enrolar os ribossomas seguidos por digestão ribonuclease. Considerando que livre mRNA e porções de mRNAs traduzidos não protegidos por ribossomos são degradadas pela ribonuclease, os fragmentos do mRNA ribossomo-protegido podem ser recuperados por purificar complexos Ribossoma-pegada intacta. Estas pegadas de mRNA são então convertidas em biblioteca de cDNA e analisadas por sequenciamento profundo (Figura 1). Em paralelo ao Ribossoma perfilação, mRNA intacta é extraído da mesma amostra e sequenciados. Comparando o nível de tradução identificado por Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA, podemos identificar os genes que são especificamente acima - ou para baixo-regulado ao nível da tradução e calcular a eficiência da tradução do mRNA a nível de todo o genoma. Enquanto o protocolo descrito neste artigo é específico para o fermento, é também útil para pesquisadores que tentarão estabelecer o protocolo Ribo-Seq em outros sistemas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação do extrato
- Cepas de leveduras de raia de congelados reservas para as colônias única em placas YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2% e 2% de ágar). Incube as placas a 30 ° C durante 2 dias.
- Inocular o fermento de uma placa YPD (uso uma única colônia) em 15 mL de meio YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, 2% de glicose) em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e crescer durante a noite com agitação (200-250 rpm) a 30 ° C.
- Cultura de diluir em 500 mL de meio YPD em um frasco estéril de 2 L, para que o OD600 < 0.1. Desenvolvem-se células de levedura com agitação a 30 ° C, durante 3-5 h até OD600 = 0,5 (fase log de mid).
- Recolha pilhas por filtragem através de filtros de membrana 0,45 μm usando um conjunto de filtro de suporte de vidro. Raspar a pelota com uma espátula, flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° C. O tamanho esperado do sedimento congelado é ~ 0,2 - 0,5 g.
Atenção: O nitrogênio líquido é extremamente baixa temperatura; Use proteção adequada. - Preparar um fresco do lysis (pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 cicloheximida μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) imediatamente antes da utilização, manter no gelo.
- Colocar 3 grânulos de aço cromado (3,2 mm) em um tubo de aço inoxidável de 1,8 mL. Pre-calma em nitrogênio líquido e adicionar pelotas congeladas, cubra com uma tampa de borracha do silicone. Homogeneizar a amostra por cryogrinding por 10 s a 4200 rpm; Repita 10 vezes. Esfriar o tubo em nitrogênio líquido pelo menos 10 s entre cada rodada.
Nota: É importante manter sempre a amostra congelada. - Adicionar 1 mL de tampão de Lise, misture bem por pipetagem. Transferir para um novo tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a 20.000 x g por 5 min a 4 ° C. Enquanto trabalhava no gelo, transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Transferi 100 μL de lisado para um novo tubo de 1,5 mL para o isolamento de mRNA poli. Dirijam-se ao isolamento de RNA ou flash congelar o tubo em nitrogênio líquido. Medida OD260 do resto do lisado, que será usado para a extração de pegada e flash congelar os tubos em nitrogênio líquido. Armazenar os lysates a-80 ° C.
2. pegada extração
- Preparação de gradientes de sacarose
- Prepare soluções para 50%, 40%, 30%, 20% e 10% de sacarose em gradiente tampão (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 cicloheximida μg/mL, 0,5 mM DTT).
- Pipetar 2,2 mL de tampão de sacarose preparada 50% para o fundo do tubo de polyallomer de parede fina de 13,2 mL e congelar a solução durante 10 minutos a-80 ° C (Figura 2). Em seguida, camada 2,2 mL de tampão de sacarose 40% em cima do buffer de sacarose 50% congelado e congelar por 10 min a-80 ° C. Seguir as mesmas instruções, sacarose camada 30%, em seguida, 20% e, finalmente, 10% buffers em cima uns dos outros. Evite fazer bolhas de ar durante a estratificação. Manter os gradientes a-80 ° C até o uso. Os gradientes de sacarose devem ser preparados pelo menos um dia antes do experimento e armazenados a-80 ° C.
- Digestão de nuclease
- Descongele os gradientes de sacarose na noite anterior experiências a 4 ° C.
- Descongele o celular lisado (pegada amostra) no gelo. Transferir uma alíquota de célula lisada contendo 50 unidades de260 OD para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar tampão de Lise fresco até 1 mL. Armazenar o restante lisado a-80 ° C. Adicionar 10 μL RNase eu (100 U/μL) e incube a 1 h em temperatura ambiente com suave rotação em rotacao cabeça-sobresaltos.
- (Opcional) Clarificar as amostras a 20.000 x g por 5 min a 4 ° C e recuperar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
- Ultracentrifugação
- Suavemente a camada lisadas amostras ao topo de um gradiente de sacarose de 10-50%.
- Se o polyallomer tubos a 210.000 x g (35.000 rpm) a 4 ° C por 3 h, usando o rotor Ti SW-41.
- Configuração do sistema de fracionamento de gradiente
- Os componentes e deixe o monitor de UV para aquecimento pelo menos 30 min.
- Se usando um software de gravador digital, inicie o software no computador, defina limites de dimensionamento do gráfico de-0.01 e 1.
- Encha a seringa com a solução de Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% de sacarose), remover quaisquer bolhas de ar dentro da seringa e cânula.
- Instale um tubo se encheu com água livre de RNase. Fure o tubo com a cânula até duas marcas pretas podem ser vistas. Ligue a bomba de seringa de 1 mL/min.
- A água que passa através da célula de fluxo, pressione o botão "Auto Zero" o monitor de UV para ajustar a linha de base para 0. Definir a sensibilidade do monitor UV para "2.0 AU". Depois que foi criada uma linha de base estável, pare a bomba de seringa. Recuperar a solução de Chase e remova o tubo se.
- Isolamento de monosome
- Instalar e perfurar o tubo se contendo o gradiente de sacarose. Ligue a bomba de seringa de 1 mL/min, coletar frações de 1 mL um254 valores de monitoramento. Frações que representam o pico de monosome dos anos 80 em um tubo do pool, manter no gelo (Figura 3).
- Uma vez que Chase solução atinge a célula de fluxo, pare a bomba de seringa. Recuperar a solução de Chase e remova o tubo se. Repita o fracionamento para o resto das amostras começando no ponto 2.5.1.
Nota: Quando terminar, limpe o sistema de fracionamento com pelo menos 30 mL de água livre de RNase. Lave cuidadosamente o tubo, seringa e todos os componentes removíveis com água morna. - Filtrar as frações através de filtros centrífugos de 0,5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e descartar a passagem, repita até que volume é < 100 μL. Adicione 400 μL de tampão de lançamento (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 40 inibidor de RNase U/mL). Mix por pipetagem, incubar por 10 min de gelo e a unidade de transferência para um novo tubo de coleção. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e coletar o escoamento.
- Purificação do fragmento de pegada
- Transferi os escoamento contendo pegada RNA fragmentos do tubo um novo 1,5 mL, adicionar 20 μL de SDS (para uma concentração final de 1%), misture por pipetagem de 20%.
- Adicionar 1 volume de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5), vortex por 10 s.
Cuidado: Ácido-fenol: clorofórmio é tóxico, evite o contacto com a pele e inalação. - Aqueça a 65 ° C por 5 min, Coloque gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo de 1,5 mL.
- Precipitar fragmentos de RNA pegada adicionando volume 1/10 de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%.
3. extração de mRNA poli
- Extração de RNA total
- Descongelar uma alíquota de 100 μL de lisado celular (amostra deRNA Total ) no gelo, adicionar 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e 20 μL de SDS (para uma concentração final de 1%), misture por pipetagem de 20%.
- Adicionar 1 volume (400 μL) de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5) e vórtice por 10 s.
- Aqueça a 65 ° C por 5 min, Coloque gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo de 1,5 mL.
- Realize uma segunda extracção de fenol. Adicionar 1 volume de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5), vórtice para calor s. 10 a 65 ° C por 5 min, colocar no gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL.
- Precipitar o RNA. Para isso adicione volume 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
- Isolamento de mRNA poli
- Centrifugar as amostras de RNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota por 5 min.
- Dissolva a pelota em 300 μL de tampão de Lise/ligação do kit de isolamento do mRNA da poli. Proceda à extração de mRNA poli (a) de acordo com o protocolo de poli mRNA isolamento kit do fabricante.
- Precipitar as amostras de mRNA adicionando volume 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
- fragmentação de mRNA
- Centrifugar as amostras de mRNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 seg, remover o resto do etanol com um carregamento de gel de ponta e ar seco a pelota por 5 min.
- Resuspenda o mRNA em 18 μL de água livre de RNase, adicionar 2 μL de 10x buffer de fragmentação de RNA. Incubar a 5 min a 94° C. Transferi o tubo de gelo.
- Precipitar, adicionando o volume de 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
4. desfosforilação
- Trate a pegada e fragmentada amostras de mRNA com quinase de polinucleotido T4. Para isso, Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com um gel de ponta de carga. Ar seco a pelota por 5 min.
- Resuspenda o pellet em 7,75 µ l de água, adicionar 1 µ l de buffer de quinase 10 x T4 polinucleotídicas, 1 µ l da quinase de polinucleotido T4 (10.000 U/mL) e 0,25 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l). Incubar a 1 h a 37 ° C.
- (Opcional) Pre-execute um gel de TBE-ureia 15% em 180 V por 15 min, usando 1 x TBE buffer.
- Adicione 10 µ l de 2 X amortecedor de TBE-ureia amostra de 10 µ l de cada amostra de pegada e mRNA. Preparar uma amostra de controle contendo 1 µ l de 10 do oligonucleotide de marcador de tamanho superior de µM (32 nt), 1 µ l de 10 µM menor tamanho marcador do oligonucleotide (28 nt), 8 µ l água e 10 µ l de 2 x amortecedor de TBE-ureia amostra para amostras de pegada. Preparar uma amostra de controle contendo 1 µ l de 10 do oligonucleotide de marcador de RNA de µM (63 nt), 9 µ l água e 10 µ l de 2 x amortecedor de TBE-ureia amostra para amostras de mRNA.
- Incubar as amostras e controles 3 min a 75 ° C, spin para baixo, Coloque gelo por 1 min. carregar cada amostra em 2 poços do gel 15% TBE-ureia, fragmentos de RNA separados por eletroforese em gel de 180 V por 1h.
- Manchar o gel por 5 min com uma mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído em água), proteger da luz.
- Usando um transiluminador de luz azul, cortar a banda adequada entre 28 e 32 marcadores nt para amostras de pegada (Figura 4A) e cerca de 50-70 nt para mRNA amostras (Figura 4B) com uma lâmina de barbear limpa. Congele os pedaços de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante pelo menos 10 min.
- Extraia o RNA do gel de polyacrylamide como segue. Aquecer os pedaços de gel a 70 ° C por 2 min, moer o gel usando macacos descartável da pelota. Eluir RNA com tampão de eluição 300 µ l (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), adicionar 1 inibidor de RNase µ l (20 U / µ l) e incubar a 37 ° C por 3 h.
- Centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e precipitado pela adição de 1/10 de volume de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
5. 3'-adaptador ligadura
- Centrifugar as amostras pegada e mRNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento. Ar seco a pelota por 10 min.
- Resuspenda o pellet em 4,75 µ l de água livre de nuclease, 2 µ l de 50% PEG8000, 1 µ l de tampão de ligase 10 X T4 RNA, 1 µ l de 3'-adaptador (100 ng / µ l), 0,25 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l), 1 µ l de RNA T4 ligase do 2 truncado KQ (200.000 U/mL). Incubar durante uma noite a 16 ° C.
- Na manhã seguinte, retire o excesso de adaptador, adicionando 0,5 µ l de 5'-deadenylase (10 U / µ l) e 0,5 µ l de Rec J do exonuclease (10 U / µ l) diretamente a reação da ligadura. Incubar durante 30 min a 30 ° C.
- Precipitar as amostras. Para isso, adicione 30 µ l de água livre de nuclease, 1 glicogênio µ l (10 mg/mL), volume 1/10 de NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
6. inverter a transcrição
- Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento. Ar seco a pelota por 10 min.
- Resuspenda o pellet em 11,5 µ l de água livre de nuclease, adicionar 0,5 µ l de primer de transcrição reversa 8 µM (primeira demão RT) e 1 µ l de dNTP mix (10 mM). Incubar durante 5 minutos a 65 ° C, Coloque gelo.
- Adicione 4 µ l de 5 X buffer de primeira vertente, 2 µ l de 0,1 M DTT, 0,5 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l), 0,5 µ l de transcriptase reversa (200 U / µ l). Incubar durante 30 min a 48 ° C, 1 minuto a 65 ° C, 5 min a 80 ° C.
- Não precipitar e proceder de imediato à hidrólise de RNA, pela adição de 0,8 µ l de 2 M de NaOH, Incubar 30 min a 98 ° C. Adicionar 0,8 µ l de 2M de HCl para neutralizar a reação.
- Precipitar as amostras.
7. circularização
- Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e ar seco a pelota por 10 min.
- Resuspenda o pellet em 16,75 µ l de água livre de nuclease. Adicionar 2 µ l de buffer de ligase single-stranded DNA (ssDNA), 1 µ l de 50mm MnCl2, 0,25 µ l de ssDNA Ligase de 10x (100 U / µ l). Incubar durante 1 h a 60 ° C, 10 min a 80 ° C. Não precipitar e armazenar o produto da reação da ligadura ssDNA a-20 ° C.
8. PCR amplificação de biblioteca
- Enquanto trabalho no gelo, misture o seguinte em um tubo PCR: 146 µ l de água livre de nuclease, 2 µ l de cartilha para a frente de 20 µM, 2 µ l de primer de indexado reversa 20 µM, 40 µ l de 5 x buffer de plymerase de DNA de alta-fidelidade, 4 µ l de dNTPs (10 mM), 4 µ l do produto da reação da ligadura ssDNA e 2 µ l de DNA polimerase de alta-fidelidade. Escolha um primer indexados reverter diferente para cada amostra que vai ser multiplexado para sequenciamento. Transferi uma alíquota de 50 μL da mistura de PCR para 4 novos tubos de PCR.
- Executar a amplificação por PCR com número variável de ciclos (8, 10, 12, 14) usando as seguintes configurações:
1 min a desnaturação inicial de 98 ° C
8 a 14 ciclos:
15 s a 94 ° C
5 s a 55 ° C
10 s a 65 ° C
2 min a extensão final de 65 ° C - Precipitar o produto do PCR, adicionando o volume de 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
- Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota.
- Resuspenda o pellet em 8 µ l de água livre de nuclease, adicionar 2 µ l de desnaturação não 5X amortecedor da amostra de ácido nucleico. Carrega a amostra em 1 bem de um gel não-desnaturação de TBE 8%. Separe os produtos de DNA por eletroforese em gel de 150 V por 35 min. Como um controle, preparar uma amostra contendo 0,5 µ l de escada de DNA 10 bp (1 µ g / µ l), 7,5 µ l água e 2 µ l de desnaturação não 5X amortecedor da amostra de ácido nucleico e correr em uma pista separada do gel.
- Manchar o gel por 5 min com uma mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído em água), proteger da luz. Usando um transiluminador de luz azul, corte a banda cerca de 150 bp para amostras de pegada e cerca de 180 bp mRNA das amostras (Figura 6) com uma lâmina de barbear limpa. Armazene os pedaços de gel a-80 ° C durante pelo menos 10 min.
- Aquecer os pedaços de gel a 70 ° C por 2 min, moer o gel usando macacos descartável da pelota. Eluir o DNA com 300 µ l de pH de Tris-HCl 20 mM 7.0 e incubar a 37 ° C por 3 h.
- Centrifugar a amostra a 12.000 x g, durante 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e precipitado pela adição de 1/10 de volume de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
- Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota. Finalmente, resuspenda as bibliotecas em 20 µ l de água livre de nuclease e proceder à quantificação, controle de qualidade e sequenciamento.
9. Biblioteca quantificação e arranjar em sequência do elevado-throughput
- Antes de enviar as amostras para sequenciamento, determine o rendimento e a qualidade das bibliotecas PCR amplificados. Perfis representativos para pegada e bibliotecas de sequenciamento de mRNA são mostrados na Figura 7. O tamanho esperado da biblioteca PCR amplificados é bp 148-152 para amostras de pegada e bp 170-190 para amostras de mRNA.
- Se várias amostras com diferentes códigos de barras vão ser agrupadas para sequenciamento, realize quantificação precisa das bibliotecas usando um ensaio de quantificação de biblioteca baseada em qPCR sequenciamento.
- As bibliotecas em relações equimolar da piscina. Calcule o volume total da piscina como 3 µ l x número total de amostras seja agrupado. Determine o volume de cada biblioteca que precisa ser adicionado para que as bibliotecas são misturadas nas relações equimolar para atingir a concentração final de 10 nM da piscina. Adicionar os volumes calculados de cada biblioteca para um novo tubo de 1,5 mL, misturar por pipetagem. Adicione água para atingir o volume total calculado. Bibliotecas de pool de armazenamento-20 ° c.
- Envie uma alíquota da biblioteca em pool para ser sequenciado usando sequenciamento de único-extremidade bp 50 executado em uma plataforma de sequenciamento de Illumina. Nós rotineiramente multiplex 12 amostras em um único sequenciamento executar, quais rendimentos ~ 200 milhões lê por raia de sequenciamento.
Nota: O número final de pegada leituras coletadas por cada amostra depende da quantidade de material a entrada e o nível de contaminação do rRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Encanamentos detalhados para a análise de bioinformatic do Ribossoma dados de perfil tem sido descrito anteriormente 8,9. Além disso, diversos grupos de pesquisa desenvolveram ferramentas de Bioinformática para análise de expressão diferencial do gene e processamento de dados de sequenciamento, que são específicos para o ribossoma perfilação método 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. O primeiro passo na análise de dados Ribo-Seq é demultiplexação e aparar a sequência de adaptador 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT usando Cutadapt software 19. Então lê o sequenciamento está alinhados contra não-codificantes RNAs, tais como o rRNA e tRNA, usando gravata borboleta 20 para remover contaminantes sequências, e leituras que não alinham então são mapeadas para o genoma da levedura. Ler a contagem por gene então pode ser avaliada por HTseq-contagem de software 21, e genes diferencialmente expressos são identificados usando DESeq2 22.
A Figura 8 mostra resultados representativos de análise quantitativa de tradução em hbs1Δ 23,24 fermento exclusão mutante que foram obtidos usando nosso protocolo. Primeiro, foram avaliados o número e a proporção de leituras que correspondem a RNA não-codificante (por exemplo, rRNAs) obtido após a sequenciação de pegada e mRNA bibliotecas geradas por células do tipo selvagem e o mutante hbs1Δ. Descobrimos que, mesmo sem qualquer rRNA depleção passos (discutidos abaixo), de 50 a 60% de todas as leituras sequenciais em nossa pegada bibliotecas correspondem a fragmentos de pegada Ribossoma-protegido (Figura 8A). Em contraste, apenas 3% dos fragmentos de RNA ribossomal-derivados foram observadas nas bibliotecas de mRNA demonstrando que isolamento do mRNA poli permite eliminação eficaz de rRNA leituras. Juntos, fomos capazes de obter leituras de pegada mais de 10 milhões para cada uma das amostras pegada por sequenciamento 2 repetições. Para avaliar a variabilidade da geração de biblioteca e reprodutibilidade dos dados, analisamos geralmente pelo menos duas repetições biológicas independentes por cada condição experimental. Bibliotecas de amostra de pegada e o mRNA mostram boa reprodutibilidade com coeficiente de correlação de Pearson R ~ 0,99 entre amostras correspondentes (Figura 8B).
Além de avaliar o nível de proteína Tradução a nível de todo o genoma, Ribossoma criação de perfil permite medir mudanças na eficiência de tradução entre condições experimentais 3. Por isso, uma alíquota do lisado celular (não tratada com ribonuclease) é usada para isolamento de mRNA poli e preparação de uma biblioteca de RNA-Seq. Porque tanto biblioteca de pegada e RNA-Seq biblioteca são preparados nas mesmas condições controladas e podem ser atribuídas a cada indivíduo replicar, Ribo-Seq e RNA-Seq conjuntos de dados podem ser directamente comparados para identificar genes que são regulados pelas mudanças no mRNA transcrição, tradução eficiência, ou por um efeito combinado. Para identificar os genes que são de cima - ou para baixo-regulado especificamente ao nível da tradução de proteínas no mutante hbs1Δ, calculamos as mudanças na eficiência de tradução dividindo valores de pegada rpkm por rpkm de mRNA para cada um dos genes (Figura 8).
Figura 1: visão geral do protocolo Ribo-Seq. O protocolo inteiro pode ser executado em cerca de 11 dias. Tempo estimado para cada etapa é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preparação dos gradientes de sacarose Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: perfis de gradiente de sacarose representativa. (A) perfil de gradiente de sacarose obtidos para controle (não tratados com RNase eu) amostra. (B) a fim de extrair fragmentos de RNA protegidos Ribossoma, lisados celulares são tratados com RNase eu por 1h à temperatura ambiente (RT). Fracções correspondentes ao pico monosomal então são coletadas para extração de pegada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens representativas dos géis de poliacrilamida 15% obtidos após o tratamento de quinase de polinucleotido T4. (A) o tamanho da fatia gel extirpado em torno de 28 e 32 nt é mostrado para amostras de pegada. (B) corte a fatia de gel sobre nt 50-70 para amostras de mRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens representativas de géis de poliacrilamida a 10% obtidos após a transcrição reversa. (A) cortar a banda superior ~ 128 nt para amostras de pegada, correspondente ao produto de transcrição reversa. (B) cortar a banda em torno de 150-170 nt para as amostras de mRNA (banda superior). As bandas inferiores correspondem a cartilha de RT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: purificação do gel de Polyacrylamide de bibliotecas PCR amplificados. Produtos PCR obtidos depois 8, 10, 12 e 14 ciclos de amplificação da biblioteca foram resolvidos em um gel não-desnaturação de TBE 8%.O tamanho das bibliotecas completos pegada é ~ 150 bp, considerando o tamanho das bibliotecas de mRNA é ~ 170-190 BP evitar a banda inferior que não contenha inserir.
Figura 7: análise Bioanalyzer. (A) representante Bioanalyzer perfis da biblioteca pegada PCR amplificados. O tamanho médio da biblioteca pegada é esperado para ser de 148 a 152 nt. (B) representante Bioanalyzer perfis da biblioteca de sequenciamento obtidos para as amostras de mRNA. O tamanho esperado da biblioteca do mRNA é 170-190 nt. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: resultados representativos. (A) número de mRNA, rRNA e pegada leituras obtidas para a amostra do selvagem-tipo e o mutante hbs1Δ. Número combinado de leituras gerados pelo sequenciamento biológico duas repetições é mostrado para o selvagem-tipo pilhas e o mutante hbs1Δ. (B) a reprodutibilidade das medições pegada e abundância de mRNA entre duas repetições. Coeficientes de correlação de Pearson (R) são indicados. (C) Transcriptional e alterações translacionais no hbs1Δ mutante. Significativamente os genes regulados por cima e para baixo-regulado em hbs1Δ são agrupados de acordo com se eles são afetados por uma mudança na transcrição de mRNA, eficiência de tradução, ou por um efeito combinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primeiras demão | Sequência de | Índice | ||||
| 3' adaptador (100 ng / µ l) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| Cartilha de RT | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Cartilha PCR para a frente | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Cartilha de índice 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Cartilha de índice 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Cartilha de índice 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Índice primário 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Cartilha de índice 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Cartilha de índice 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tabela 1: 3' sequências de adaptador e primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A abordagem de Ribo-Seq tem emergido como uma poderosa tecnologia de análise de mRNA tradução na vivo a todo o genoma de nível 3. Estudos utilizando esta abordagem, que permite o monitoramento de tradução com resolução de single-códon, tem contribuído para o nosso entendimento do Regulamento translacional. Apesar de suas vantagens, Ribo-Seq tem várias limitações. Fragmentos de RNA ribossómico (rRNA) são sempre co purificados durante o isolamento de pegadas Ribossoma-protegido, diminuindo o rendimento de leituras de sequenciamento úteis que podem ser obtidos em experimentos de Ribo-Seq 9,25. Nossos dados demonstram que a contaminação de rRNA pode contribuir para até 40-50% de todas as leituras (Figura 8). Uma das maneiras de superar essa limitação é aumentar a profundidade de sequenciamento. Rodadas adicionais de sequenciamento devem ser realizadas até o número necessário de leituras de sequenciamento é alcançado para cada uma das amostras analisadas. Análise das bibliotecas de sequenciamento preparado usando nosso protocolo mostra que mais de 5 milhões de pegada de leituras podem ser obtidas para cada biblioteca de pegada, quando 12 amostras são multiplexadas juntos em um padrão 50-bp único fim de executar na plataforma Illumina HiSeq 2000. No entanto, se for observada uma contaminação significativa com rRNA, uma etapa de remoção do rRNA opcional pode ser realizada.
Uma das estratégias para remover rRNA contaminando fragmentos de bibliotecas de pegada é usar hibridização subtrativa com os oligonucleotides biotinilado conforme descrito anteriormente,, 8,2627. Alternativamente, rRNA contaminando leituras pode ser removidos usando kits de depleção de rRNA comercialmente disponível. Para isso, pesquisadores podem executar depleção rRNA em fragmentos de pegada de 3'-adaptador-ligado purificado da etapa 5.4. Seguir depleção de rRNA, pegada de amostras podem ser precipitadas e usadas diretamente para a transcrição reversa (etapa 6), conforme descrito no protocolo.
Além de purificação de monosomes usando o fracionamento de gradiente de sacarose descrito em nosso protocolo, vários métodos têm sido desenvolvidos que utilizam uma purificação baseada na coluna 28 e ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose 8 ,29. Enquanto esses métodos podem acelerar o processo de preparação de biblioteca de pegada e são menos tecnicamente desafiadoras em relação ao fracionamento de gradiente de sacarose, não permitem a análise qualitativa dos monosomes purificados e eficiência da nuclease etapa da digestão. Recentemente, a escolha de nuclease foi mostrada para afetar a eficiência da purificação de fragmentos de RNA Ribossoma-protegido em diferentes espécies de 30. Enquanto RNase I tem atividade robusta em levedura lisados celulares, sua atividade foi mostrado para afetar a integridade dos ribossomas em tecidos de rato, bem como as moscas de fruta. Portanto, a escolha e a concentração de nuclease devem ser otimizadas quando adopta este protocolo para outras espécies.
Outra consideração importante é o uso de inibidores da tradução. A maioria dos protocolos para perfil de Ribossoma normalmente envolvem tratando as células com inibidores de alongamento, como cicloheximida ou harringtonine, a fim de evitar o escoamento de ribossomos durante a célula colheita 3. Uma das limitações do uso de inibidores de tradução é que as drogas difundem progressivamente na célula, induzindo uma inibição progressiva dos ribossomas 31. Além disso, as drogas não inibem a iniciação da tradução ou rescisão. Como consequência, os ribossomas desproporcionalmente acumulam no códon de início e estão esgotados para o stop códon 8,27,31. Para limitar este artefato, escolhemos a piscar congelar as células em nitrogênio líquido e tratar com cicloheximida no momento da extração em tampão de Lise só.
Apesar de um número relativamente grande de relatórios que utilizaram Ribo-Seq em várias espécies, protocolos padronizados para a realização de análise Ribo-Seq são escassos. Como consequência, Ribo-Seq dados gerados por diferentes laboratórios não podem ser comparados diretamente. Por exemplo, a comparação do Ribossoma publicada perfis de conjuntos de dados revelou discrepâncias significativas nos resultados entre os estudos de 32. Isto é em parte devido à contínuas melhorias que foram feitas como o protocolo evoluiu ao longo dos últimos anos. Além disso, muitos pesquisadores modificado o ribossoma perfilação protocolo para adotá-lo às necessidades específicas de seu estudo ou modelo sistema 9,25. Mais padronizar o ribossoma perfilação protocolo, bem como análise de dados e normalização, permitiria impedir alguns dos enviesamentos experimentais e garantir a quantificação exata e reproduzível da tradução na vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde AG040191 e AG054566 de VML. Esta pesquisa foi realizada enquanto VML foi bolseiro de investigação um AFAR da Federação Americana para pesquisa do envelhecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
