Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.
Abstract
מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.
Introduction
היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה1. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים2. לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר3, 4. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים5. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.
כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה "הפצוע" מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס"מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה11. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור "הפצוע" לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור "הפצוע" יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור12.
בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.
בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) - 1c13, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון16. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)17 של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR12, 18 הוא דיווח.
לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא הכנה
- זרע 2.5x106 תאים 10 מ"ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ג/מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, בדוק המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
הערה: התאים המשמשים את הניסוי הם מונצחים הסמפונות אפיתל תאי אדם transduced עם וקטור lentiviral היוועצות התנגדות puromycin. הם מבטאים stably תפקודית CFTR14,15. - לאחר זרימה התאים הגיעה 90-100%, תשאף האמצעי הבקבוקון ואת למחוק אותו לתוך בקבוק פסולת תחת מחלקה בקבינט בטיחות ביולוגית II. לשטוף את התאים עם 6 מ של פוספט buffered מלוחים ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS). בעדינות סלע את הבקבוקון ידנית ולמחוק CMF-PBS.
הערה: יש להיזהר לא לגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה. - להוסיף 10 מ ל- CMF-PBS, דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 דקות.
- האחות CMF-PBS וזורקים אותו. לאחר מכן להוסיף 2 מ של טריפסין/EDTA הבקבוקון.
- רוק בעדינות את הבקבוק, המאפשר את הפתרון לחלוטין את התאים ולאחר דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 10 דקות עד התאים מנותקים בעליל תחת מיקרוסקופ.
הערה: בסוף זמן הדגירה, התאים אמורה להופיע מעוגל, לא קשור משטח הפלסטיק. אם התאים נמצאים טוב מנותקת, עצבנות ידנית ייתכן שיהיה צורך. - להוסיף 10 מ של MEMg בתוספת 10% FBS בטל טריפסין ולאסוף את התאים ע י שטיפת החלק התחתון של הבקבוק. להעביר את עוצמת הקול לתוך צינור חרוטי 50 מ.
- Centrifuge את הצינור עבור 5 דקות ב x 80 גרם.
- וארוקן את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 6 מ של MEMg בתוספת 10% FBS. פיפטה שוב ושוב כדי לשבור את כל הגושים.
- להוציא 10 µL של התא השעיה עם micropipette ולהזריק את אמצעי האחסון תחת הזכוכית המכסה בעבר לשים מעל תא Burker או Neubauer.
- לספור את מספר התאים.
2. התא זריעה בתרבות מוסיף
- ב כל טוב של צלחת 12-. טוב, העבר את תותב תרבות עם פינצטה סטרילי (איור 1). השתמש פינצטה כדי ללחוץ לאורך שולי מוסיף על מנת לתקן אותם על פני השטח של הצלחת.
הערה: מוסיף יש התחתון דביק המאפשר הדבקה.
איור 1 : ייצוג סכמטי של התוספות תרבות סיליקון, מכניסים כראוי בארות של צלחת 12-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- כראוי לדלל התליה תא MEMg בתוספת 10% FBS. ממלאים כל תא של הקדמי µL 70 תא השעיה (על 3.5x104 תאים/תא).
הערה: הצפיפות של תאים המוחלת בכל תא תלוי בסוג של תאים. מומלץ להשתמש צפיפות תא שמוביל להשלים זרימה בתוך 24 שעות. - תחת המיקרוסקופ, בדוק כי תאים לא דולפים מן התאים הוספה דגירה לצלחת 12-ובכן במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%2.
3. מדומים הפצע Assay הריפוי
- לאחר דגירה, דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי נוצר תא confluent monolayers.
- מחדש להשעות את מבחן תרכובות (למשל, מגברים) ב 1 מ"ל של MEMg.
הערה: להכין טרי דילולים אמפר החל מהפתרון מניות המאוחסנים ב-20 ° C. - הסר בעדינות את המכסים על ידי פינצטה סטרילי. יש להיזהר לא לשבור את התא monolayers. להעביר את המכסים על נייר סופג.
הערה: כדי להשתמש מחדש את המכסים אותו, לעקר אותם 70% אתנול במשך לפחות 3 שעות. מומלץ לזרוק אותם לאחר מכן. - כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, להוסיף 1 מ"ל של MEMg לכל שימוש טוב של micropipette. סגור את הצלחת, בעדינות לזעזע אותו.
הערה: לא להוסיף בינוני ישירות מעל תא monolayers כדי למנוע הפרעה שלהם. - האחות המדיום ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של MEMg לכל טוב. לסגור את הצלחת והמחש את הפערים נטול תאים (שנוצרו על ידי התוספות) תחת המיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 4, מצוידים עם מצלמת וידיאו. לרכוש תמונות בזמן אפס (T0) ולשמור אותם בתבנית. jpg.
- להסיר את המדיום מן הבארות, לשטוף אותם עם 1 מ"ל ל- PBS, למחוק אותו.
- הוסף את תרכובות מבחן (להכין בשלב 3.2) הבארות. דגימות הבקרה אינו מטופל, הוסיפו 1 מ"ל של MEMg. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2.
- לאחר 15, 20, וטיפול 24 שעות, להתבונן על נדידת תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 4, לרכוש תמונות.
הערה: במהלך שלב זה, לנסות ללכוד תמונות בהאזורים באשר T0. הבחירה של מרווחי זמן שבו נלכדים תמונות תלוי מהירות ההעברה של התא. - כדי לחקור את ההשפעה של כמה מעכבי סלקטיבית, כלומר AG1478, על נדידת תאים, תשאף המדיום של כל תא הוספה לפני הסרת מוסיף.
- לשטוף כל תא עם MEMg טריים ולמלא אותו 70 µL של MEMg בתוספת AG1478.
- לאחר 30 דקות של דגירה-37 ° C ו- 5% CO2, המשך כמתואר מנקודת 3.3.
הערה: במהלך שלב כביסה, רעלני של תאים monolayers עם מעכבי ספציפית, יש להיזהר לא להסיר את התוספות.
4. תמונות ניתוח
- עם סיום הניסוי, בחר תמונות של הדגימות הייצוגי ביותר של הקבוצות השונות ניסיוני, וליצור קובץ zip המכיל תמונות יחיד ב- T0, T15, T20, T24 h.
הערה: תמונות יחיד נלקחות במרווחי זמן נבחר עבור כל הדגימות. הפעל את triplicates עבור כל ניסוי, אשר חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים. בסוף, לקבוצות בכל ניסיוני, מינימום של 3 תמונות ("a", "b", "c", וכד', הנובע ניסוי עצמאית) בנקודת זמן כל מנותחות. - להעלות קובץ ה-zip לתוך התוכנה ניתוח תמונה אשר מספק באופן אוטומטי באמצעות דואר אלקטרוני קובץ סיכום הגיליון האלקטרוני המכילה את הנתונים ניסיוני של אזורים מכוסי תא, גירוד (באחוזים) בנקודות זמן נבחר.
הערה: ההכרה בחוד החנית ואת אזור הפער מבוססת במידה רבה על שיטת זיהוי קצה (המכוון לזיהוי נקודות בו בהירות התמונה חדה משתנה). - לשמור את הנתונים ולאסוף אותם. לנרמל את כל הנתונים ביחס הערך הממוצע בזמן אפס. חישוב הערך הממוצע של הנתונים המנורמל של משכפל כל כל נקודת זמן, השגיאה הסטנדרטית היחסי (SEM). באמצעות ניתוח דו כיוונית השונות (ANOVA), לבצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנת הסטטיסטיקה נכונה. הבדלים בין קבוצות שטופלו פפטיד וקבוצות שליטה במרווחי זמן שונים נחשבים מבחינה סטטיסטית significant עבור p< 0.05.
- להתוות נתונים המתקבלים גרף כמו היסטוגרמה, אשר מציג אחוז מכוסי תא שטח של כל מדגם קבוצות לעומת ממרווחי הזמן שנבחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) - 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך, נוצר פער 500 μm, כל טוב היה מלא MEMg המכיל את פפטיד בריכוזים שונים. הניסוי היה בן ארבע פעמים. כמצוין באיור2, הסגר כמעט מוחלטת של השדה מדומים הפצע מיוצר על טפט תא היה המושרה על ידי שני פפטידים בתוך ה ~ 20 בריכוזים אופטימליים של 1 μM ו- 10 μM עבור Esc(1-21) - 1c ו- Esc(1-21), בהתאמה. אפשרות זו מציינת Esc(1-21) - 1 c יעיל יותר בקידום epithelialization מחדש של פצע מדומה בתאים הסמפונות.
איור 2 : השפעת esculentin-1a נגזר אמפר על הסגר על פצע דמה שנוצרו ב- טפט של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. התאים היו נזרע בכל תא של הקדמי תרבות סיליקון, לאחר הסרתו, התאים צולמו על ראיות של נדידת תאים 15, 20, 24 שעות לאחר התוספת של פפטידים. האחוז של האזור מכוסה תא בכל נקודה חושבה בהשוואה לתאי הבקרה ללא טיפול (Ctrl) ודיווח על ציר y. כל הנתונים הם האמצעי של ניסויים עצמאית 4 ± SEM, לקוחים מן המחקר הקודם14. הרמות של מובהקות סטטיסטית לבדיקות בין דגימות שטופלו ובקרה הם: *p< 0.05, * *p< 0.01, * * *p< 0.001, ו * * *p< 0.0001. Micrographs מציג תוצאות נציג לפני (T0) ו- 20 h לאחר טיפול של תאים עם כל פפטיד-ריכוז μM 1, בהשוואה הפקד, מדווחים גם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי לוודא אם ההפעלה של EGFR שיחק תפקיד לסגירת הפצע Esc-induced, תאים הסמפונות היו preincubated למשך 30 דקות עם 5 μM של AG1478, מעכב סלקטיבי של EGFR, לפני הוספה הסרה. מאז האחוז של האזור מכוסה תא צומצם באופן משמעותי במרווחי זמן כל לעומת התוצאות שנמצאו כאשר התאים היו לא pretreated עם המינהל פפטיד מוקדמת מעכב (איור 3), זה מצביע על פפטיד-induced נדידת תאים כולל הפעלה של EGFR. עם זאת, עוד יותר מחקרים, יהיה צורך להבהיר את האירועים המולקולריים המופעלות על-ידי Esc-פפטידים (למשל, הפעלת EGFR ישירה או טרנס-הפעלת מתווכת על-ידי metalloproteases, אשר הוכחו קליב ליגנדים EGFR המעוגנת קרום 19).
איור 3 : השפעה של AG1478 מעכב על פפטיד-induced ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. לפני הוספה הסרה, התאים היו מראש incubated עם 5 μM AG1478 במשך 30 דקות ולאחר מכן שטופלו פפטיד לבד ריכוז זהה. כל הנתונים לקוחים מתוך העבודה הקודמת שלנו14הינם האמצעי של ארבעה ניסויים עצמאית ± SEM. הרמות של מובהקות סטטיסטית לבדיקות בין הדגימות קבוצה המוצע הם: *p< 0.05; p< 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח של רצף תמונות בכדי לכמת את מהירות ההעברה של התאים שבחרת.
התוצאות שלנו הראו כי היישום של תרבות מוסיף הוא אובייקטיבי ובלתי אמין ניסיוני טכניקת הערכה כמותית של מאפייני ההעברה תא. Assay זה יכול להתבצע על ידי כל קבוצת המחקר עם ציוד מעבדה בסיסית. עם זאת, יש לשקול כמה צעדים קריטיים של הפרוטוקול כדי להשיג הפארמצבטית. לדוגמה, חשוב להגדיר, על-ידי טייס הניסויים, המספר המדויק של תאי זרע בתוך כל תא כדי לקבל באותה המידה של זרימה בתוך כל דוגמאות בודדות. לכוונה זו, יש תאים עם שלב מחזור מסונכרן והימנעות תא גושים לפני זריעה היא קריטית. דרך אפשרית כדי למזער את הצליעה היא מעבר עדין של הבולם התא באמצעות מחט מזרק. עם זאת, להגדיל את גודל הדגימות באופן משמעותי יתרום להפחתת השתנות בין התאים.
בנוסף, היצירה של פער עם רוחב מוגדרים היטב כל דוגמאות חיוני. למטרה זו, מוסיף סיליקון לא אמור מחדש לשמש יותר מפעמיים. יתר על כן, יש להימנע את הצמיחה של תאים מתחת לחומה ההפרדה סיליקון. כדי למנוע בעיה זו, לחץ רך על גבי תותב, פעם להציב לתוך המנה לצלחת/טוב, יכול להיות מיושם באופן ידני באמצעות פינצטה סטרילי כדי להגדיל את הידבקות של התותב, כדי הפלסטיק. הסרת זהיר של הקדמי גם ה"בלתי הגדלה של פני השטח ללא תא עם הפרעה של טפט התא.
עם זאת, לאחר כראוי תותב. הוא ניתק, פצע מדומה מופק בצורה מושלמת, כמה שורות תאים ניתן לנתק מעל פני השטח פלסטיק, במיוחד אם הם מודגרת בתקשורת ללא סרום או תוספי מזון כמו ויטמינים, חומצות אמינו, גורמי גדילה. העדר של גורמים אלה במדיום תרבות תא ניתן להכתיב את העובדה כי הם יכולים להפריע לפעילות קידום ריפוי פצע של תרכובות מבחן כדי לעקוף בעיה זו, בחירה רציונלית של תרבות בינוני הרכב מומלץ מאוד.
צעד קריטי נוסף שיש להביא בחשבון לפני הגדרת ריפוי הליך זה הפצע הוא מהירות העברה שונים שקיים בין סוגי תאים שונים. גם במקרה זה, ניסויים מוקדמים צריך להיות מתוכנן במטרה קביעת מרווחי הזמן הנכון שבו יש תמונות ללכידה. יש גם צורך לשקול כי מגבלה אחת שכרוכות בשיטה זו הוא מוסיף תרבות כזה אינו יכול להיות מועסק ללמוד את ההעברה של תאים שגדלים ההשעיה (למשל, אורך חייהם לויקוציטים).
למרות ריפוי פצע מבחני ביצע עם התרבות סיליקון מוסיף יקרים יותר וזמינותו מאפס קלאסית, הם מאפשרים רפרודוקציה מהיר ומדויק של נתונים על פעילות התא ההעברה. חשוב, לאחר הגדרת המערכת, אותו ניתן להרחיב את הידע על המנגנון המולקולרי שבבסיס הפצע ריפוי פעילות מאולצת מגורמים אקסוגניים או אנדוגני. לשם כך, רעלני של תאים monolayers עם מולקולות ספציפיות (למשל, מעכבי) יכול להתבצע לפני יצירת הפצע מדומה. דוגמה לכך ניתנת על ידי רעלני של תאים עם (i) תא התפשטות חוסם מיטומיצין C לחקור האם הסגר של השדה "הפצוע" המושרה על ידי אמפר מושפע על ידי חלוקת התא קצב מעכבי20 או (ii) metalloprotease כדי לוודא התרומה של metalloproteases הפעלת בתיווך EGFR איתות לשביל12.
חשוב, בתהליך סגירת הפצע, עשוי להיות קבוע ודוגמאות מטופלים עם כתמי המתאים עבור זיהוי שלד התא, גרעינים (phalloidin, דאפי, בהתאמה) כדי לחזות שינויים בהיבט מורפולוגי של תאים (למשל, היווצרות lamellipodia בחוד החנית) על ידי פלורסנט/קונפוקלית. יתר על כן, הטיפול של תאים עם המגבר התווית על-ידי פלורסנט עשוי לאפשר את החזיית הסלולר תפוצתו (משטח רפידה או לוקליזציה תאיים/intranuclear) בזמנים שונים, מאז תחילת הפעילות נדידת תאים. יתר על כן, מוסיף אלה עלול לנצל לניתוח פעילות ריפוי הפצע על תאים אפיתל מקוטב ו הבדיל (למשל, תאים הסמפונות העיקריים ומתוחזק על הממשק אוויר נוזלי), לאחר שיש להציב אותם על transwell מתאימים תומך חדיר.
לסיכום, שיטת המתואר יש פוטנציאל משמעותי לשפר באופן משמעותי את הבנת התכונות הנדידה של סוגים שונים של חסיד בעל חיים תאים/רקמות אפיתל, כמו גם על הבחירה של המבטיחים ביותר-ריפוי הפצע היזמים ו/או מעכבי, תוך זמן קצר, עם רמת דיוק גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון ספיאנצה-אוניברסיטת רומא ועל קרן מחקר סיסטיק פיברוזיס איטלקי (פרוייקט טורבין #11/2014 שאומצה על ידי משלחות מועדון כדורגל מסיינה (siena), כולל Sondrio, Cerea Il Sorriso di ג'ני ו פאביה). חלק מעבודה זו נתמכה גם על-ידי FILAS FILAS פרוט גרנט-RU-2014-1020.
אנחנו אסירי תודה ד ר לורטה פררה (Genova מדיקה, Istituto ג'אנינה Gaslini, U.O.C. Genetica, איטליה) על מתן בתאי אפיתל הסמפונות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
