Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere effekten af peptider for migration af bronchiale epitel celler. Denne metode giver mulighed for hurtig og meget reproducerbare opnåelse af kvantitative data om hastighed i celle migration og sår lukning.
Abstract
Formålet med dette arbejde er at vise en ny metode til at vurdere muligheden af nogle immunmodulerende molekyler, såsom antimikrobielle peptider (AMP'er), at stimulere celle migration. Vigtigere, er celle migration en trafikhastighedsbegrænsning begivenhed i løbet af sårheling processen at genskabe integriteten og normal funktion af væv lag efter skade. Fordelen ved denne metode over klassisk analysen, som er baseret på en manuelt lavet bunden i en celle éncellelag, er brugen af specielle silikone kultur indsætter giver to rum for at oprette en celle-fri pseudo såret felt med en veldefineret bredde (500 μm ). Desuden, på grund af en automatiseret billede analyse platform er det muligt at hurtigt få kvantitative data om hastighed sår lukning og celle migration. Mere præcist, bliver effekten af to frog-hud ampere på migration af bronchiale epitel celler vist. Derudover vil forbehandling af disse celler med specifikke hæmmere give oplysninger om de molekylære mekanismer bag sådanne begivenheder.
Introduction
Det er i vid udstrækning kendt at sårheling hos dyr er en grundlæggende proces at genskabe integriteten og normal funktion af væv lag efter skade1. Trods epitelial overflader udsat for det ydre miljø (fx, hud, luftveje, og mave skrifter) danner en beskyttende barriere fra fysiske og kemiske fornærmelser, dannelsen af sår kan nemt forekomme, især efter kirurgi eller mikrobielle infektioner2. Som et eksempel, kolonisering af lungevæv ved den opportunistiske bakteriel patogen Pseudomonas aeruginosa, især i cystisk fibrose (CF) syge, fører til skader på luftvejene epitel med deraf følgende respirationssvigt3, 4. Sårheling er en kompleks vært reparation mekanisme til at genoprette den normale arkitektur af en skadet væv5. Det er karakteriseret ved indledende betændelse, efterfulgt af en regenerering periode omfatter epithelialization, angiogenese og væv remodellering med kollagen produktionen og celle differentiering6,7,8 . At sikre epitelial integritet og til at styre mikrobielle spredning, producerer alle levende organismer forsvar molekyler, herunder antimikrobielle peptider (AMP'er)9,10. Sårheling proces er meget vanskeligt at simulere in vitro- på grund af manglende celle debris og komplekse interaktioner blandt forskellige celletyper. Men, in vitro- evne et peptid til at fremskynde lukningen af en pseudo-sår ved at stimulere overflytning af epitelceller er betegnende for dens evne til at helbrede en kompromitteret epitel. Faktisk, celle migration er en trafikhastighedsbegrænsning begivenhed i sårheling, og at studere faktorer, der kan påvirke celle migration vil bidrage til at målrette terapier for forbedret sårheling.
Her, leveres en yderst reproducerbare eksperimentelle assay på basis af særlige silikone kultur skær til at evaluere celle migration in vitro. Det er baseret på oprettelse af en 500 μm gap (pseudo sår) på en sammenflydende celle éncellelag. Celler på kanten af feltet kunstige "sårede" vil begynde at migrere ind i området celle-fri, danner nye celle-celle kontakter. Kultur-Indsæt repræsenterer et nyt værktøj til hurtig sårheling eksperimenter. To bassiner adskilt af en 500 μm væg er leveret, og de kan placeres korrekt, i en 3-cm parabol plade eller i godt af en 12-godt plade. Fylde hvert rum af indsatsen med en cellesuspension tillader celler til at vokse i de enkelte udpegede områder indtil sammenløbet, mens fjernelse af indsatsen vil skabe en ren celle-fri hul ca 500 μm (samme bredde som adskillelsesmuren). En ordentlig cellekulturmedium suppleret med en testforbindelsen kan derefter føjes til fadet plade/godt. Bagefter, gap lukning kan visualiseres på forskellige tidspunkter under en inverteret mikroskop, helst en udstyret med et video-kamera til billede erhvervelse. Endelig, måling af ændringer i området celle-dækket af web-baseret automatiseret image analysis program giver mulighed for kvantificering af hastigheden af sår lukning og celle migration. Samlet set er denne metode et skridt fremad med hensyn til den klassiske analyse, hvor en skramme foretages manuelt af incising sammenflydende celle encellelag med en steril nål eller en pipette tip11. Ja, den sidste procedure kan ødelægge plast bunden af fadet plade/brønd og overfladebehandling, oprettelse af rynker. Derudover har området "sårede" ikke en veldefineret bredde langs hele længden af kløften, som dette stærkt afhænger af pres fra forskere til nålen/tip. Derudover kan forrykke cellerne danne klumper af levende og døde celler på kanten af bunden; Derudover kan spredning af levende celler i området "sårede" interferere med hastigheden af celle migration, genererer ikke-reproducerbare resultater12.
Desuden, takket være en ridse billede analyse platform, kan brugere hurtigt modtager (i minutter) kvantitative data om vandrende funktionsmåden for de markerede celler uden at erhverve yderligere software. Denne platform er i stand til at analysere fase kontrast mikroskopi billeder af lav (~ 5 X), medium (~ 10 X) og høj (~ 20 X) forstørrelse. Efter at uploade en zip-fil af billeder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) udføres analysen automatisk for at generere en sammenfattende fil, der viser procentdelen af både celle-dækkede områder og scratch samt hastigheden af celle migration, med forskellige tidsintervaller.
I dette arbejde, ved hjælp af en frog-hud AMP-derivat, dvs Esc(1-21) og sine diastereomer Esc(1-21) - 1 c13og en bronchiale cellelinie udtrykker det funktionelle CF transmembrane ledningsevne regulator (CFTR)14,15, et eksempel på peptid-induceret celle migration sammenlignet med ubehandlet (kontrolprøverne) er fastsat. Bemærk, at luftvejene epitel og CFTR spille en afgørende rolle i at opretholde lungefunktion og sår reparation16. Derudover ved selektiv hæmmere (fx AG1478)17 af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), beviser, at migration af bronkial celler induceret af de førnævnte peptider indebærer aktivering af EGFR12, 18 er rapporteret.
I Resumé er målet med denne procedure at vise, hvordan brugen af sådanne silikone kultur skær repræsenterer en hurtig og lettilgængeligt assay til præcist bestemme migrationen af vedhængende celler (fx bronchiale epitelceller) og den molekylære mekanismer kontrollere sådanne begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Seed 2.5x106 celler i 10 mL af Minimum afgørende Medium (MEM) suppleret med 2 mM glutamin (MEMg), plus 10% føtal bovint serum (FBS), antibiotika (0,1 mg/mL af penicillin og streptomycin) og puromycin (0,5 µg/mL for udvælgelse og vedligeholdelse af den celle linje) i en T75 kolbe. Inkuber i kolben på 37 ° C og 5% CO2 i 2 dage. Før du starter eksperimentet, kontrollere sammenløbet af celler i en inverteret mikroskop.
Bemærk: De celler, der bruges til eksperimentet er udødeliggjort menneskelige bronchiale epitel celler transduced med en lentiviral vektor giver resistens over for puromycin. De udtrykker stabilt en funktionel CFTR14,15. - Når celler sammenløbet har nået 90-100%, Aspirér medium fra kolben og smide det i en affald flaske under en biologisk sikkerhed kabinet klasse II. Cellerne vaskes med 6 mL af phosphat bufferet saltvand uden calcium og magnesium (CMF-PBS). Forsigtigt rock kolben manuelt og kassér CMF-PBS.
Bemærk: Pas på ikke at røre den celle éncellelag med en pipette. - Der tilsættes 10 mL af CMF-PBS og inkuberes i kolben på 37 ° C og 5% CO2 til 10 min.
- Opsug CMF-PBS og kassér den. Derefter tilsættes 2 mL trypsin/EDTA kolben.
- Forsigtigt rock kolben, så løsningen helt pels cellerne, og Inkuber i kolben på 37 ° C og 5% CO2 i 10 min indtil cellerne er synligt adskilt under et mikroskop.
Bemærk: For enden af inkubationstiden cellerne vises afrundet og ikke fastgjort til plastik overflade. Hvis cellerne ikke godt fritliggende, kan manuel agitation være nødvendigt. - Der tilsættes 10 mL af MEMg plus 10% FBS at inaktivere trypsin og indsamle cellerne ved at vaske bunden af kolben. Overføre volumen i en konisk 50 mL tube.
- Der centrifugeres røret i 5 min på 80 x g.
- Opsug supernatanten og cellerne i 6 mL af MEMg plus 10% genopslæmmes FBS. Pipette gentagne gange til at opløse alle klumper.
- Tag 10 µL af cellesuspension med en mikropipette og injicere volumen under cover glas tidligere sat over en Burker eller Neubauer kammer.
- Tælle celle nummer.
2. celle såning i kultur indsætter
- I hvert hul i en 12-godt plade, skal du overføre kultur-Indsæt med sterile pincetter (figur 1). Bruge pincet til at trykke langs Skær kanterne for at løse dem på overfladen af pladen.
Bemærk: Skær har en klæbrig undersiden, der giver mulighed for vedhæftning.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af silikone kultur skær, korrekt sat i wells af en 12-godt plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Korrekt fortyndet cellesuspension i MEMg plus 10% FBS. Fyld hvert rum af indsatsen med 70 µL af cellesuspension (om 3.5x104 celler/afdeling).
Bemærk: Tætheden af celler anvendes i hvert rum, afhænger af typen celler. Det anbefales at bruge en celle tæthed, der fører til komplet sammenløbet inden for 24 timer. - Under mikroskopet, kontrollere, at celler ikke siver ud fra Indsæt rum og Ruger i 12-godt plade i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
3. pseudo-såret helbredende Assay
- Efter inkubationen visualisere celler under den inverterede mikroskop for at kontrollere at sammenflydende celle encellelag er blevet dannet.
- Genopslæmmes test forbindelser (fx ampere) i 1 mL MEMg.
Bemærk: Forberede frisk ampere fortyndinger fra stamopløsningen opbevares ved-20 ° C. - Fjern forsigtigt skærene af steril pincet. Vær omhyggelig med ikke at bryde celle monolag. Overføre skær på absorberende papir.
Bemærk: Hvis du vil genbruge de samme skær, sterilisere dem i 70% ethanol i mindst 3 timer. Det anbefales at smide dem bagefter. - For at fjerne ikke-tilhænger celler, der tilsættes 1 mL MEMg pr. brønd med en mikropipette. Luk pladen og forsigtigt rock det.
Bemærk: Undlad at tilføje medium direkte oven på celle encellelag at undgå deres forstyrrelser. - Opsug mediet og erstatte det med 1 mL MEMg pr. brønd. Luk pladen og visualisere celle-gratis hullerne (lavet af indsætter) under den inverterede mikroskop på 4 X forstørrelse, udstyret med et videokamera. Erhverve billeder på tidspunktet nul (T0) og gemme dem i .jpg-format.
- Fjern mediet fra brøndene, vaske dem med 1 mL PBS og kassér den.
- Tilføje test forbindelser (forberedt på punkt 3.2) brønde. Ubehandlet kontrolprøver, tilsættes 1 mL MEMg. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 15, 20 og 24 h behandling, observere celle migration under mikroskop på 4 X Forstørrelse og erhverve billeder.
Bemærk: Under dette trin skal forsøge at fange billeder i de samme områder som T0. Valget af tidsintervaller, hvor billederne er taget til fange, afhænger af celle migration hastighed. - For at undersøge effekten af nogle selektive hæmmere, Aspirér dvs AG1478, på celle migration, medium fra hver Indsæt rum før du fjerner skær.
- Vask hver rum med friske MEMg og fyld den med 70 µL af MEMg suppleret med AG1478.
- Efter 30 min inkubation ved 37 ° C og 5% CO2, Fortsæt som i punkt 3.3 beskrevne.
Bemærk: Under vask trin og forbehandling af celle encellelag med de specifikke hæmmere, være omhyggelig med ikke at fjerne skærene.
4. billedanalyse
- Ved afslutningen af forsøget, Vælg billeder af de mest repræsentative prøver af de forskellige eksperimentelle grupper, og skabe en zipfil der indeholder enkelt billeder på T0, T15, T20 og T24 h.
Bemærk: Enkelt billeder er taget på de valgte tidsintervaller for alle prøver. Køre tre til hvert eksperiment, som gentages mindst tre gange. Enden for alle eksperimentelle grupper, et minimum af 3 billeder ("en", "b", "c", etc., der hidrører fra hver uafhængig eksperiment) ved hvert tidspunkt analyseres. - Uploade zip-filen ind i billed analyse software, som giver automatisk pr. e-mail en sammenfattende regnearksfil indeholdende forsøgsdata af celle-dækket og bunden områder (som procentdel) på de valgte tidspunkter.
Bemærk: Anerkendelse af forkanten og området kløften er i vid udstrækning baseret på edge detection metode (sigter mod at identificere punkter hvor billedet lysstyrke skarpt ændringer). - Gemme dataene og indsamle dem. Normalisér alle data med hensyn til den gennemsnitlige værdi på tidspunktet nul. Beregn den gennemsnitlige værdi af de normaliserede data for alle replikater på hvert tidspunkt og den relative standardafvigelse (SEM). Ved hjælp af to-vejs variansanalyse (ANOVA), udføre statistiske analyse med en ordentlig statistik software. Forskelle mellem peptid-behandlede grupper og kontrolgrupper på forskellige tidsintervaller anses for at være statistisk betydelig for en p< 0,05.
- Afbilde de fremkomne data i et diagram som et histogram, som viser procentdelen af celle-dækkede område med alle prøve grupper versus de valgte tidsintervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev brugt til at bestemme sårheling effekten af Esc(1-21) og Esc(1-21) - 1 c i celle migration aktivitet induceret på bronchiale epitel celler, der udtrykker den funktionelle CFTR. I denne analyse, kultur skær blev placeret i wells af en 12-godt plade, og hvert rum var seedet med 35.000 celler i MEMg suppleret med 10% FBS. Cellerne nåede komplet sammenløbet inden for 24 h. bagefter, et 500 μm hul blev genereret, og hver godt var fyldt med MEMg som indeholder peptid i forskellige koncentrationer. Eksperimentet blev gentaget fire gange. Som angivet i figur 2er blev næsten fuldstændig lukning af feltet pseudo såret fremstillet i celle éncellelag fremkaldt af de to peptider inden for ~ 20 h, i optimal koncentrationer på 1 μM og 10 μM for Esc(1-21) - 1 c og Esc(1-21), henholdsvis. Dette indikerer, at Esc(1-21) - 1 c er mere effektivt at fremme re epithelialization af en pseudo-sår i bronchiale celler.
Figur 2 : Effekt af esculentin-1a afledt ampere på lukningen af en pseudo-sår lavet i en éncellelag af bronkial epitelceller. Celler var seedede i hvert rum af silikone kultur insert, og efter sin afsked, celler blev fotograferet for tegn på celle migration 15, 20 og 24 timer efter tilsætning af peptider. Procentdelen af celle-dækkede område hver gang punkt beregnedes sammenlignet med ubehandlet kontrol celler (Ctrl) og er rapporteret på y-aksen. Alle data er midler fra fire uafhængige forsøg ± SEM, og er taget fra en tidligere undersøgelse14. Niveauer af Statistisk signifikans for tests mellem kontrol og behandlede prøver er: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, og ***p< 0,0001. Micrographs viser repræsentative resultater før (T0) og 20 h efter behandling af celler med hver peptid i koncentration på 1 μM, i forhold til kontrol, er også rapporteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at kontrollere, om aktivering af EGFR spillede en rolle i Esc-induceret sår lukning, blev bronkial celler forinkubereret for 30 min med 5 μM af AG1478, en selektiv hæmmer af EGFR, før insert fjernelse. Da procentdelen af celle-dækkede område blev reduceret betydeligt på alle tidspunkter i forhold til de resultater fundet når cellerne blev ikke forbehandlet med hæmmer forudgående peptid administration (figur 3), dette påpeger peptid-induceret celle migration indebærer aktivering af EGFR. Dog yderligere undersøgelser vil være nødvendige for at afklare de molekylære hændelser, der udløses af Esc-peptider (f.eks. direkte EGFR aktivering eller trans-aktivering medieret af metalloproteases, som har vist sig at kløve membran-forankrede EGFR ligander 19).
Figur 3 : Effekt af AG1478 hæmmer for peptid-induceret migration af bronkial epitelceller. Før Indsæt fjernelse, var celler pre rugede med 5 μM AG1478 for 30 min og efterfølgende behandlet med peptid alene på den samme fusion. Alle data er midler fra fire uafhængige forsøg ± SEM og er taget fra vores tidligere arbejde14. Niveauer af Statistisk signifikans for tests mellem de angivne gruppe prøver er: *p< 0,05; p< 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle migration er en væsentlig proces i mange fysiologiske og patologiske arrangementer herunder sårheling, embryonale udvikling og kræft metastaser. Den grundlæggende procedure at studere celle migration i vitro omfatter: (i) oprettelsen af en celle éncellelag, (ii) produktionen af en pseudo-sår i sammenflydende lag af celler, (iii) erobringen af billeder på forskellige tidsintervaller indtil såret lukning er nået , og (iv) analysen af billedsekvens for at kvantificere migration hastigheden af de valgte celler.
Vores resultater viser, at anvendelsen af kultur skær er objektiv og pålidelig eksperimentel teknik til kvantitative evaluering af celle migration karakteristika. Denne analyse kan udføres af en forskergruppe med grundlæggende laboratorieudstyr. Dog bør nogle vigtige trin i protokollen overvejes at opnå reproducerbarhed. For eksempel, er det vigtigt at definere af pilotforsøg, det nøjagtige antal celler til frø i hver rum for at få den samme grad af sammenløbet i alle individuelle prøver. I dette øjemed er kuvetter med en synkroniseret cyklus fase og undgå celle klumper før såning afgørende. En mulig måde at minimere Jokke er en blid passage af cellesuspension gennem en sprøjte nål. Dog vil stigende prøver størrelse bidrage væsentligt for at mindske variabiliteten mellem cellerne.
Skabelse af en kløft med en veldefineret bredde i alle prøver er derudover afgørende. Til dette formål, bør silikone skær ikke genanvendes mere end to gange. Derudover bør væksten af celler under silikone adskillelsesmuren undgås. For at forhindre denne plage, bløde pres oven på Indsæt engang placeret i skålen plade/godt, kan anvendes manuelt ved hjælp af steril pincet til at øge vedhæftning af Indsæt plast. Forsigtig fjernelse af indsætte hæmmer også udvidelsen af celle-fri overflade med afbrydelse af cellen éncellelag.
Men når indsatsen er korrekt forskubbet og en pseudo sår er perfekt produceret, nogle cellelinjer kan løsnes fra plastic overflade, især hvis de er udruget i medierne uden serum eller kosttilskud såsom vitaminer, aminosyrer og vækstfaktorer. Fraværet af disse faktorer i en cellekulturmedium kan være dikteret af det faktum, at de kan interferere med sårheling fremme aktiviteten af test forbindelser. For at omgå dette problem, anbefales rationelle valg af næringssubstratet sammensætning.
En anden afgørende skridt til at overveje, før du konfigurerer denne sårheling procedure er forskellige overførsel hastighed, der eksisterer blandt forskellige celletyper. Også i dette tilfælde skal foreløbige forsøg planlægges med det formål at bestemme de korrekte tidsintervaller, hvor billeder må være fanget. Det er også nødvendigt at overveje, at en begrænsning forbundet med denne metode er, at sådanne kultur skær ikke kan anvendes til at studere migration af celler, der vokser i suspension (fx polymorfnukleære leukocytter).
Trods sårheling assays udført med silikone kultur skær er dyrere end den klassisk Skrab assay, de giver mulighed for en hurtig og nøjagtig reproduktion af data på celle migration aktivitet. Vigtigere, når systemet er sat op, kan det bruges til at udvide viden om den molekylære mekanisme bag sårheling aktivitet stimuleres af enten endogene og eksogene faktorer. Med henblik herpå udføres forbehandling af celle encellelag med specifikke molekyler (fx, hæmmere) før oprettelse af pseudo såret. Et eksempel er givet ved forbehandling af celler med (i) den celle spredning blocker mitomycin C til at undersøge, om lukningen af feltet "sårede" induceret af ampere er påvirket af celledeling sats20 eller (ii) metalloprotease hæmmere at kontrollere den bidrag af metalloproteases i aktivering af EGFR-medieret signaling vej12.
Vigtigere, under sår lukning proces, prøver kan være fast og behandles med passende pletter for registrering af cytoskelettet og kerner (phalloidin og DAPI, henholdsvis) at visualisere ændringer i de morfologiske aspekt af celler (f.eks., at dannelsen af lamellipodia på den forreste kant) af fluorescerende/Konfokal mikroskopi. Desuden kan behandling af celler med et fluorescerende-mærket AMP aktiverer visualisering af dets cellulære fordeling (membranen overflade eller intracellulære/intranuclear lokalisering) på forskellige tidspunkter, siden begyndelsen af vandrende celleaktivitet. Desuden, disse skær kan udnyttes til at analysere sår healing aktivitet på polariseret og differentieret epitelceller (fx, primære bronchiale celler holdes på grænsefladen air-liquid), efter at have lagt dem på passende transwell permeable understøtter.
Afslutningsvis har den beskrevne metode betydelige potentiale til at forbedre forståelsen af forskellige typer af vedhængende animalske celler/epitel væv vandrende funktioner, samt om udvælgelsen af de mest lovende sårheling projektledere og/eller hæmmere, inden for en kort tid og med stor nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Sapienza Universitet i Rom og den italienske cystisk fibrose Research Foundation (projekt FFC #11/2014 vedtaget af FFC delegationer fra Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny og Pavia). En del af dette arbejde blev også støttet af FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi er taknemmelige for Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Getica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italien) til at give de bronchiale epitel celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
