Summary
यहाँ, हम दमा उपकला कोशिकाओं के प्रवास पर पेप्टाइड्स के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. इस विधि सेल माइग्रेशन और घाव बंद होने की गति पर मात्रात्मक डेटा की तेजी से और अत्यधिक reproducible प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
इस कार्य का उद्देश्य सेल प्रवास को प्रोत्साहित करने के लिए, रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) जैसे कुछ इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक उपंयास विधि दिखाने के लिए है । महत्वपूर्ण बात, कोशिका प्रवास घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान एक दर सीमित घटना है फिर से चोट के बाद ऊतक परतों के अखंडता और सामांय समारोह की स्थापना । शास्त्रीय परख, जो एक सेल monolayer में एक मैंयुअल रूप से बनाया खरोंच पर आधारित है पर इस विधि का लाभ विशेष सिलिकॉन संस्कृति आवेषण दो डिब्बों प्रदान करने के लिए एक सेल मुक्त छद्म एक अच्छी तरह से परिभाषित चौड़ाई के साथ घाव क्षेत्र बनाने के उपयोग है (500 माइक्रोन ). इसके अलावा, एक स्वचालित छवि विश्लेषण मंच के कारण, यह तेजी से घाव बंद करने और सेल प्रवास की गति पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए संभव है । अधिक संक्षेप में, दो मेंढक का प्रभाव-त्वचा के लिए दमा उपकला कोशिकाओं के प्रवास पर AMPs दिखाया जाएगा. इसके अलावा, विशिष्ट अवरोधकों के साथ इन कोशिकाओं के उपचार आणविक ऐसी घटनाओं अंतर्निहित तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करेगा ।
Introduction
यह काफी हद तक जाना जाता है कि पशुओं में घाव भरने के लिए एक मौलिक प्रक्रिया को फिर से स्थापित करने की अखंडता और चोट के बाद ऊतक परतों के सामांय समारोह में1है । उपकला बाहरी वातावरण को उजागर सतहों के बावजूद (जैसे, त्वचा, श्वसन, और जठरांत्र संबंधी इलाकों) शारीरिक और रासायनिक अपमान से एक सुरक्षात्मक बाधा फार्म, घावों का गठन आसानी से हो सकता है, विशेष रूप से बाद सर्जरी या माइक्रोबियल संक्रमण2। एक उदाहरण के रूप में, औपनिवेशीकरण के अवसरवादी जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा फेफड़े के ऊतकों की Pseudomonas aeruginosa, विशेष रूप से सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) में पीड़ित, फलस्वरूप श्वसन विफलता के साथ वायुमार्ग उपकला के नुकसान की ओर जाता है3, 4. घाव भरने एक जटिल मेजबान मरंमत तंत्र के लिए एक घायल ऊतक के सामांय वास्तुकला5बहाल है । यह प्रारंभिक सूजन की विशेषता है, एक पुनर्जनन epithelialization शामिल अवधि के बाद, angiogenesis, और कोलेजन उत्पादन और कोशिका भेदभाव के साथ remodeling ऊतक6,7,8 . उपकला अखंडता को सुनिश्चित करने और माइक्रोबियल प्रसार को नियंत्रित करने के लिए, सभी जीवित जीवों रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs)9,10सहित रक्षा अणुओं, का उत्पादन. घाव भरने की प्रक्रिया सेल मलबे और विभिन्न सेल प्रकार के बीच जटिल बातचीत की कमी के कारण इन विट्रो में अनुकरण करने के लिए बहुत मुश्किल है । हालांकि, उपकला कोशिकाओं के प्रवास उत्तेजक द्वारा एक छद्म घाव के बंद में तेजी लाने के लिए एक पेप्टाइड के इन विट्रो की क्षमता एक समझौता उपकला को चंगा करने की क्षमता का संकेत है. दरअसल, कोशिका प्रवास घाव भरने में एक दर सीमित घटना है, और कारकों है कि सेल प्रवास को प्रभावित कर सकते है का अध्ययन करने में सुधार घाव भरने के लिए उपचार लक्ष्य में मदद मिलेगी ।
यहाँ, एक उच्च reproducible प्रयोगात्मक परख विशेष सिलिकॉन संस्कृति आवेषण के आधार पर इन विट्रो मेंसेल माइग्रेशन का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान की जाती है । यह एक धाराप्रवाह सेल monolayer पर 500 माइक्रोन गैप (छद्म घाव) के निर्माण पर आधारित है । कृत्रिम "घायल" क्षेत्र के किनारे पर कोशिकाओं सेल मुक्त क्षेत्र में पलायन शुरू कर देंगे, नए सेल सेल संपर्क बनाने । संस्कृति डालने तेजी से घाव भरने के प्रयोगों के लिए एक नया उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । एक 500 माइक्रोन दीवार से अलग दो जलाशयों प्रदान की जाती हैं, और वे ठीक से एक 3 सेमी डिश थाली में या एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुआं में रखा जा सकता है । एक सेल निलंबन के साथ डालने के प्रत्येक डिब्बे को भरने की अनुमति देता है, जबकि संगम तक प्रत्येक नामित क्षेत्र में विकसित करने के लिए, डालने के हटाने के लगभग 500 माइक्रोन (जुदाई दीवार के रूप में एक ही चौड़ाई) के एक स्वच्छ कोशिका मुक्त अंतर पैदा करेगा । एक उचित कोशिका संस्कृति मध्यम एक परीक्षण यौगिक के साथ पूरक तो पकवान थाली में जोड़ा जा सकता है/ बाद में, अंतर बंद एक औंधा खुर्दबीन के नीचे अलग समय अंतराल पर visualized किया जा सकता है, अधिमानतः एक छवि अधिग्रहण के लिए एक वीडियो कैमरा के साथ सुसज्जित । अंत में, वेब-आधारित स्वचालित छवि विश्लेषण प्रोग्राम द्वारा कक्ष-आच्छादित क्षेत्र में परिवर्तनों का मापन घाव बंद होने और सेल माइग्रेशन की गति के ठहराव की अनुमति देगा । कुल मिलाकर, इस विधि शास्त्रीय परख, जहां एक खरोंच मैंयुअल रूप से एक बाँझ सुई या एक पिपेट टिप11के साथ incising धाराप्रवाह सेल monolayers द्वारा किया जाता है के संबंध में एक कदम आगे है । दरअसल, पिछले प्रक्रिया डिश प्लेट के प्लास्टिक के नीचे नष्ट कर सकते है/अच्छी तरह से और सतह कोटिंग, बनाने झुर्रियां । इसके अलावा, "घायल" क्षेत्र के अंतर की पूरी लंबाई के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित चौड़ाई नहीं है, के रूप में यह अत्यधिक सुई के लिए शोधकर्ताओं द्वारा लागू दबाव पर निर्भर करता है/ इसके अलावा, बेदखल कोशिकाओं को खरोंच के किनारों पर रहने वाले और मृत कोशिकाओं के झुरमुट फार्म कर सकते हैं; इसके अलावा, "घायल" क्षेत्र में रहने वाले कोशिकाओं के प्रसार सेल प्रवास के वेग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, गैर reproducible परिणाम12पैदा ।
इसके अलावा, एक खरोंच छवि विश्लेषण मंच के लिए धन्यवाद, उपयोगकर्ताओं को तेजी से प्राप्त कर सकते हैं (मिनट के भीतर) अतिरिक्त सॉफ्टवेयर प्राप्त करने की आवश्यकता के बिना चयनित कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार पर मात्रात्मक डेटा. यह मंच कम (~ 5x), मध्यम (~ 10x), और उच्च (~ 20X) आवर्धन के चरण इसके विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों का विश्लेषण करने में सक्षम है । छवियों (* में की एक ज़िप फ़ाइल अपलोड करने के बाद । jpg, *. jpeg, *. jp2, *. png, *. gif, *. tiff स्वरूप) दोनों कक्ष-आच्छादित क्षेत्रों और स्क्रैच क्षेत्रों, और साथ ही कक्ष की गति का प्रतिशत दिखाता है एक सारांश फ़ाइल जनरेट करने के लिए विश्लेषण स्वचालित रूप से किया जाता है अलग समय अंतराल पर प्रवास, ।
इस काम में, एक मेंढक-त्वचा AMP-व्युत्पंन का उपयोग करके, अर्थात esc (1-21) और उसके diastereomer esc (1-21)-1c13, और एक दमा सेल लाइन कार्यात्मक CF व्यक्त करने के लिए transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR)14,15, अनुपचारित (नियंत्रण) नमूनों की तुलना में पेप्टाइड-प्रेरित कक्ष माइग्रेशन का एक उदाहरण प्रदान किया गया है । ध्यान दें कि airway उपकला और CFTR फेफड़ों के समारोह और घाव की मरम्मत को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं16. इसके अलावा, चुनिंदा अवरोधकों के माध्यम से (जैसे, AG1478) एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) के17 , aforementioned पेप्टाइड्स द्वारा प्रेरित कोशिकाओं के प्रवास EGFR12के सक्रियण शामिल है कि सबूत, 18 बताया गया है ।
संक्षेप में, इस प्रक्रिया का लक्ष्य दिखाने के लिए कैसे इस तरह के सिलिकॉन संस्कृति आवेषण का उपयोग एक तेजी से और आसानी से सुलभ परख का प्रतिनिधित्व करता है सही अनुयाई कोशिकाओं के प्रवास का निर्धारण (जैसे, दमा उपकला कोशिकाओं) और आणविक ऐसी घटनाओं को नियंत्रित तंत्र ।
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Protocol
1. सेल की तैयारी
- 2 मिमी glutamine (MEMg) के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) के 10 मिलीलीटर में बीज 2.5 x106 कोशिकाओं, इसके अलावा 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और streptomycin के 0.1 मिलीग्राम/एमएल), और puromycin (0.5 µ g/एमएल के चयन और रखरखाव के लिए सेल लाइन) एक T75 कुप्पी में । 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह 2 दिनों के लिए2 पर कुप्पी की मशीन । प्रयोग शुरू करने से पहले, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं के संगम की जाँच करें ।
नोट: प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को puromycin करने के लिए प्रतिरोध lentiviral वेक्टर के साथ transduced मानव दमा उपकला कोशिकाओं अमर हैं । वे छुरा एक कार्यात्मक CFTR14,15व्यक्तकरतेहैं । - एक बार ' कोशिकाओं संगम 90-100% तक पहुंच गया है, कुप्पी से मध्यम महाप्राण और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट कक्षा द्वितीय के तहत एक बेकार बोतल में इसे त्यागें । कैल्शियम और मैग्नीशियम (CMF-पंजाबियों) के बिना फॉस्फेट के 6 मिलीलीटर में खारा बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें । धीरे से कुप्पी रॉक और CMF-पंजाबियों त्यागें ।
नोट: पिपेट के साथ सेल monolayer को छूने के लिए नहीं सावधान रहें । - CMF-पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 37 ° c और 5% सह 10 मिनट के लिए2 पर कुप्पी मशीन ।
- महाप्राण CMF-पंजाबियों और इसे त्यागें । फिर कुप्पी के लिए trypsin/EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- धीरे से कुप्पी रॉक, समाधान की अनुमति पूरी तरह से कोशिकाओं को कोट करने के लिए, और 37 ° c और 5% सह पर कुप्पी मशीन 10 मिनट के लिए2 जब तक कोशिकाओं को एक खुर्दबीन के नीचे अलग दिख रहे हैं ।
ध्यान दें: मशीन समय के अंत में, कोशिकाओं गोल दिखाई और प्लास्टिक की सतह से जुड़ा नहीं होना चाहिए । यदि कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग नहीं कर रहे हैं, मैनुअल आंदोलन आवश्यक हो सकता है । - 10 मिलीलीटर MEMg प्लस 10% FBS को निष्क्रिय trypsin और कुप्पी के नीचे धोने से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए जोड़ें । एक शंकु 50 मिलीलीटर ट्यूब में वॉल्यूम स्थानांतरित ।
- 80 x gपर 5 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक
- महाप्राण supernatant और कोशिकाओं को पुनः निलंबित MEMg प्लस के 6 मिलीलीटर में 10% FBS । किसी भी झुरमुट को तोड़-मरोड़ कर पिपेट बार ।
- एक micropipette के साथ सेल सस्पेंशन के 10 µ एल बाहर ले लो और पहले से एक Burker या Neubauer चैंबर पर डाल कवर ग्लास के तहत मात्रा सुई ।
- कक्ष संख्या गिनना ।
2. संस्कृति आवेषण में सेल सीडिंग
- एक 12-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में, बाँझ चिमटी के साथ संस्कृति डालने हस्तांतरण (चित्रा 1). प्लेट की सतह के लिए उन्हें ठीक करने के क्रम में आवेषण किनारों के साथ प्रेस करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें ।
नोट: सम्मिलित करता है एक चिपचिपा नीचे कि आसंजन की अनुमति देता है.
चित्र 1 : सिलिकॉन संस्कृति आवेषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, ठीक से एक 12-अच्छी तरह से थाली के कुओं में डाल दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- ठीक से MEMg प्लस 10% FBS में सेल निलंबन पतला । सेल निलंबन के 70 µ एल के साथ डालने के प्रत्येक डिब्बे भरें (के बारे में 3.5 x104 कोशिकाओं/
नोट: प्रत्येक डिब्बे में लागू कोशिकाओं का घनत्व कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर करता है । यह एक कोशिका घनत्व है कि 24 घंटे के भीतर पूरा संगम की ओर जाता है का उपयोग करने की सिफारिश की है । - माइक्रोस्कोप के तहत, कि कोशिकाओं को डालने के डिब्बों से लीक नहीं कर रहे है की जांच करें और 12 के लिए अच्छी तरह से थाली मशीन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर 24 ज के लिए2।
3. छद्म घाव हीलिंग परख
- मशीन के बाद, उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए सत्यापित करें कि धाराप्रवाह सेल monolayers का गठन किया गया है ।
- MEMg के 1 मिलीलीटर में परीक्षण यौगिकों (जैसे, AMPs) फिर से निलंबित.
नोट:-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत स्टॉक समाधान से शुरू ताजा AMPs कमजोर पड़ने तैयार. - धीरे बाँझ चिमटी द्वारा आवेषण निकालें । सेल monolayers को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहें । शोषक कागज पर आवेषण स्थानांतरण ।
नोट: फिर से एक ही आवेषण का उपयोग करने के लिए, उंहें 70% इथेनॉल में कम से कम 3 एच के लिए बंध्याकरण । यह उन्हें बाद में दूर फेंक करने के लिए सिफारिश की है । - गैर-अनुयाई कक्षों को निकालने के लिए, एक micropipette का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से MEMg के 1 मिलीलीटर जोड़ें । थाली बंद करो और धीरे से यह चट्टान ।
नोट: अपने व्यवधान से बचने के लिए सीधे सेल monolayers के शीर्ष पर मध्यम नहीं जोड़ें । - मीडियम को महाप्राण और इसे 1 एमएल के साथ MEMg के हिसाब से बदलें । प्लेट को बंद करें और 4x आवर्धन पर औंधा माइक्रोस्कोप के तहत सेल मुक्त अंतराल (आवेषण द्वारा बनाई गई) कल्पना, एक वीडियो कैमरा के साथ सुसज्जित । समय पर छवियां प्राप्त करें शूंय (टी0) और उंहें एक. jpg प्रारूप में सहेजें ।
- मध् यम को कुएं से निकाल दें, उसे 1 मिलीलीटर पंजाबियों से धो लें, और उसे छोड़ें ।
- परीक्षण यौगिकों जोड़ें (प्वाइंट 3.2 पर तैयार) कुओं के लिए । अनुपचारित नियंत्रण नमूने के लिए, MEMg के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 37 ° c और 5% CO2पर प्लेट की मशीन ।
- 15, 20 और 24 घंटे के उपचार के बाद, 4x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के अंतर्गत सेल माइग्रेशन का निरीक्षण करें और छवियां प्राप्त करें ।
नोट: इस चरण के दौरान, टी0 के लिए के रूप में एक ही क्षेत्रों में छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रयास करें । उस समय अंतराल का चुनाव जिस पर छवियां कैप्चर की जाती है वह कक्ष माइग्रेशन गति पर निर्भर करता है । - कुछ चुनिंदा अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, अर्थात AG1478, सेल माइग्रेशन पर, सम्मिलन हटाने से पहले प्रत्येक सम्मिलित डिब्बे से मध्यम महाप्राण.
- ताजा MEMg के साथ प्रत्येक डिब्बे धोने और AG1478 के साथ पूरक MEMg के 70 µ एल के साथ इसे भरने ।
- 37 ° c और 5% सह पर मशीन के 30 मिनट के बाद2, आगे बढ़ना के रूप में बिंदु 3.3 से वर्णित ।
नोट: वाशिंग कदम और विशिष्ट अवरोधकों के साथ सेल monolayers के इलाज के दौरान, आवेषण को दूर करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
4. छवि विश्लेषण
- प्रयोग के पूरा होने पर, विभिंन प्रायोगिक समूहों के सबसे प्रतिनिधि नमूनों की छवियों का चयन करें, और एक ज़िप टी0, T15, टी-20, और T24 एच पर एकल छवियों युक्त फ़ाइल बनाएं ।
नोट: एकल छवियाँ सभी नमूनों के लिए चयनित समय अंतराल पर लिया जाता है. प्रत्येक प्रयोग के लिए triplicates चलाएं, जो कम से तीन बार दोहराया जाता है । अंत में, सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए, 3 छवियों की एक ंयूनतम ("एक", "बी", "सी", आदि, प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त) विश्लेषण कर रहे हैं । - ज़िप फ़ाइल को छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अपलोड करें जो स्वचालित रूप से ई-मेल द्वारा प्रदान करता है एक स्प्रेडशीट सारांश फ़ाइल जिसमें चयनित समय बिंदुओं पर सेल-कवर और स्क्रैच क्षेत्रों (प्रतिशत के रूप में) का प्रयोगात्मक डेटा शामिल है ।
नोट: अग्रणी धार की मांयता और अंतर क्षेत्र मुख्यतः बढ़त का पता लगाने विधि पर आधारित है (अंक जिस पर छवि चमक तेजी से परिवर्तन की पहचान के उद्देश्य से) । - डेटा सहेजें और उंहें इकट्ठा । समय शूंय पर माध्य मान के संबंध में सभी डेटा को सामांय करें । प्रत्येक समय बिंदु और सापेक्ष मानक त्रुटि (SEM) पर प्रतिकृति सभी के सामान्यीकृत डेटा का औसत मान परिकलित करें । दो तरह के प्रसरण का विश्लेषण का उपयोग करके (ANOVA), एक उचित सांख्यिकी सॉफ्टवेयर के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं । विभिंन समय अंतरालों पर पेप्टाइड-व्यवहार समूहों और नियंत्रण समूहों के बीच अंतर को p< 0.05 के लिए सांख्यिकीय रूप से significant माना जाता है ।
- प्राप्त डेटा को हिस्टोग्राम के रूप में ग्राफ़ में प्लॉट करें, जो चयनित समय अंतराल बनाम सभी नमूना समूहों के कक्ष-आच्छादित क्षेत्र का प्रतिशत दिखाता है.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल को esc (1-21) और esc (1-21) के घाव भरने के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था-1c कोशिका प्रवास कार्यात्मक CFTR व्यक्त की उपकला कोशिकाओं पर प्रेरित गतिविधि के मामले में. इस परख में, संस्कृति आवेषण एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में रखा गया था, और प्रत्येक डिब्बे MEMg में 35,000 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था 10% FBS के साथ पूरक । कक्ष 24 घंटे के भीतर पूरा संगम तक पहुंच गया । बाद में, एक 500 माइक्रोन अंतर उत्पन्न किया गया था, और एक अच्छी तरह से विभिन्न सांद्रता पर पेप्टाइड युक्त MEMg से भरा था. प्रयोग चार बार दोहराया गया । के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया, monolayer सेल में उत्पादित छद्म घाव क्षेत्र के लगभग पूरा बंद करने के लिए दो पेप्टाइड्स द्वारा प्रेरित किया गया था ~ 20 एच, 1 माइक्रोन के इष्टतम सांद्रता पर और esc (1-21) के लिए 10 माइक्रोन-1c और esc (1-21), क्रमशः. यह इंगित करता है कि Esc (1-21)-1c कोशिकाओं में एक छद्म घाव के पुनः epithelialization को बढ़ावा देने में अधिक कुशल है ।
चित्र 2 : esculentin-1a का प्रभाव एक छद्म घाव के बंद होने पर व्युत्पंन AMPs के एक monolayer में पैदा की उपकला कोशिकाओं. कोशिकाओं सिलिकॉन संस्कृति डालने के प्रत्येक डिब्बे में वरीयता प्राप्त थे और, इसके हटाने के बाद, कोशिकाओं के सबूत के लिए फोटो थे सेल माइग्रेशन 15, 20, और 24 एच के अलावा के बाद पेप्टाइड्स. प्रत्येक समय बिंदु पर कक्ष-आच्छादित क्षेत्र का प्रतिशत अनुपचारित नियंत्रण कक्षों की तुलना में परिकलित किया गया था (Ctrl) और y अक्ष पर रिपोर्ट की गई है । सभी डेटा चार स्वतंत्र प्रयोगों ± SEM से मतलब है, और एक पिछले अध्ययन से लिया जाता है14। नियंत्रण और उपचारित नमूनों के बीच परीक्षणों के लिए सांख्यिकीय महत्व के स्तर हैं: *p< 0.05, * *p< 0.01, * * *p< 0.001, और * * * *p< 0.0001 । नियंत्रण की तुलना में 1 माइक्रोन की एकाग्रता पर प्रत्येक पेप्टाइड के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद (टी0) और 20 ज से पहले प्रतिनिधि परिणाम दिखा माइक्रोग्राफ भी सूचित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
EGFR के सक्रियकरण Esc-प्रेरित घाव बंद करने में एक भूमिका निभाई है कि क्या यह सत्यापित करने के लिए, सम्मिलित करने से पहले AG1478 की 5 माइक्रोन, EGFR के एक चयनात्मक अवरोधक, के साथ 30 मिनट के लिए दमा कोशिकाओं की पूर्व-निर्धारित थे । के बाद से सेल के प्रतिशत के क्षेत्र में काफी कम सभी समय अंतराल पर पाया जब कोशिकाओं को अवरोध करनेवाला पूर्व पेप्टाइड प्रशासन के साथ इलाज नहीं किया गया (चित्रा 3), यह बताते है कि पेप्टाइड प्रेरित सेल माइग्रेशन में EGFR का सक्रियण शामिल होता है । हालांकि, आगे की पढ़ाई के लिए Esc-पेप्टाइड्स द्वारा ट्रिगर की गई आणविक घटनाओं को स्पष्ट करने की जरूरत होगी (उदा., प्रत्यक्ष EGFR सक्रियण या metalloproteases द्वारा मध्यस्थता करने वाली ट्रांस-एक्टिवेशन, जिसमें झिल्ली सट-एंकर्ड EGFR लाइगैंडों को दिखाया गया है 19).
चित्र 3 : AG1478 अवरोध करनेवाला का प्रभाव-दमा उपकला कोशिकाओं की पेप्टाइड प्रेरित प्रवास. संमिलित हटाने से पहले, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 5 माइक्रोन AG1478 के साथ पूर्व-मशीन और बाद में एक ही एकाग्रता में अकेले पेप्टाइड के साथ इलाज किया गया । सभी डेटा चार स्वतंत्र प्रयोगों ± SEM से मतलब है और हमारे पिछले काम14से लिया जाता है । संकेत किए गए समूह नमूनों के बीच परीक्षणों के लिए सांख्यिकीय महत्व के स्तर हैं: *p< 0.05; p< 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
कोशिका प्रवास घाव भरने, भ्रूण विकास, और कैंसर मेटास्टेसिस सहित कई शारीरिक और रोग की घटनाओं में एक आवश्यक प्रक्रिया है । इन विट्रो में सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए बुनियादी प्रक्रिया शामिल है: (i) एक कोशिका monolayer का निर्माण, (ii) कोशिकाओं की धाराप्रवाह परत में एक छद्म घाव का उत्पादन, (iii) घाव बंद होने तक विभिन्न समय अंतराल पर छवियों का कब्जा तक पहुँच जाता है , और (iv) चयनित कक्षों के माइग्रेशन गति को बढ़ाता है ताकि छवि अनुक्रम का विश्लेषण ।
हमारे परिणामों से पता चला है कि संस्कृति आवेषण के आवेदन एक उद्देश्य है और सेल प्रवास विशेषताओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए विश्वसनीय प्रायोगिक तकनीक है । यह परख बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किसी भी अनुसंधान समूह द्वारा किया जा सकता है । हालांकि, reproducibility हासिल करने के लिए प्रोटोकॉल के कुछ अहम कदमों पर विचार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, पायलट प्रयोगों द्वारा परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है, प्रत्येक डिब्बे में बीज के लिए कोशिकाओं की सही संख्या क्रम में सभी व्यक्तिगत नमूनों में संगम की एक ही हद तक प्राप्त करने के लिए. इस उद्देश्य के लिए, एक सिंक्रनाइज़ चक्र चरण के साथ कोशिकाओं होने और बोने से पहले कोशिका के झुरमुट से परहेज महत्वपूर्ण है । एक संभव तरीका है झुरमुट को कम करने के लिए एक सिरिंज सुई के माध्यम से सेल निलंबन के एक सौंय बीतने है । हालांकि, नमूनों के आकार में वृद्धि काफी कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में योगदान देगा ।
इसके अलावा, सभी नमूनों में एक अच्छी तरह से परिभाषित चौड़ाई के साथ एक अंतर का निर्माण महत्वपूर्ण है । इस प्रयोजन के लिए, सिलिकॉन आवेषण फिर से दो बार से अधिक इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । इसके अलावा, सिलिकॉन जुदाई दीवार के नीचे कोशिकाओं के विकास से बचा जाना चाहिए । इस परेशानी को रोकने के लिए, डालने के ऊपर नरम दबाव, एक बार पकवान थाली में रखा/ठीक है, मैन्युअल बाँझ चिमटी के माध्यम से लागू किया जा सकता प्लास्टिक के लिए डालने के आसंजन को बढ़ाने के लिए. डालने के सतर्क हटाने भी कोशिका monolayer के विघटन के साथ सेल मुक्त सतह के बढ़ने में बाधा होगी ।
हालांकि, एक बार डालने के सही ढंग से उखाड़ फेंकना है और एक छद्म घाव पूरी तरह से उत्पादित है, कुछ सेल लाइनों प्लास्टिक की सतह से अलग कर सकते हैं, खासकर यदि वे सीरम या विटामिन के रूप में की खुराक के बिना मीडिया में तैयार कर रहे हैं, एमिनो एसिड, और विकास कारकों. एक कोशिका संस्कृति के माध्यम में इन कारकों की अनुपस्थिति तथ्य यह है कि वे परीक्षण यौगिकों की गतिविधि को बढ़ावा देने के घाव भरने के साथ हस्तक्षेप कर सकते है द्वारा तय किया जा सकता है । इस समस्या को दरकिनार, संस्कृति माध्यम संरचना के तर्कसंगत विकल्प अत्यधिक की सिफारिश की है ।
इस घाव भरने की प्रक्रिया को सेट करने से पहले विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम विभिन्न सेल प्रकार के बीच मौजूद है कि अलग माइग्रेशन गति है । इसके अलावा इस मामले में, प्रारंभिक प्रयोगों को सही समय अंतराल निर्धारित करने के उद्देश्य से निर्धारित किया जाना चाहिए जिस पर छवियों को कैप्चर किया जाना है । यह भी विचार करना आवश्यक है कि इस विधि से जुड़ी एक सीमा यह है कि ऐसी संस्कृति आवेषण कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए नियोजित नहीं किया जा सकता है जो निलंबन (उदा., polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स) में वृद्धि करते हैं ।
घाव भरने के बावजूद सिलिकॉन संस्कृति आवेषण के साथ प्रदर्शन किया परख शास्त्रीय खरोंच परख से अधिक महंगे हैं, वे सेल माइग्रेशन गतिविधि पर डेटा के एक त्वरित और सटीक प्रजनन की अनुमति । महत्वपूर्ण बात, एक बार प्रणाली की स्थापना की है, यह या तो अंतर्जात या exogenous कारकों से उत्तेजित घाव भरने की गतिविधि अंतर्निहित आणविक तंत्र पर ज्ञान का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस अंत करने के लिए, कोशिका monolayers के विशिष्ट अणुओं (जैसे, अवरोधकों) के साथ पूर्व उपचार छद्म घाव बनाने से पहले किया जा सकता है । एक उदाहरण के साथ कोशिकाओं के इलाज के द्वारा दिया जाता है (i) सेल प्रसार अवरोधक मीतोमयसीं सी पता लगाने के लिए कि क्या AMPs द्वारा प्रेरित "घायल" क्षेत्र के बंद सेल डिवीजन दर20 या (ii) metalloprotease अवरोधकों द्वारा सत्यापित करने के लिए प्रभावित है EGFR-मध्यस्थता संकेतन मार्ग12के सक्रियकरण में metalloproteases का योगदान.
महत्वपूर्ण बात, घाव बंद करने की प्रक्रिया के दौरान, नमूनों और cytoskeleton और नाभिक डिटेक्शन (phalloidin और DAPI, क्रमशः) कोशिकाओं के रूपात्मक पहलू में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए उपयुक्त दाग के साथ इलाज किया जा सकता है (उदा, lamellipodia के सामने बढ़त पर गठन) फ्लोरोसेंट द्वारा माइक्रोस्कोप/ इसके अलावा, एक फ्लोरोसेंट लेबल AMP के साथ कोशिकाओं के उपचार के सेल प्रवासी गतिविधि की शुरुआत के बाद से, अलग समय पर अपने सेलुलर वितरण (झिल्ली सतह या intracellular/intranuclear स्थानीयकरण) के दृश्य को सक्षम कर सकते हैं । इसके अलावा, इन आवेषण ध्रुवीय और विभेदित उपकला कोशिकाओं पर घाव भरने की गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए शोषण किया जा सकता है (उदा., प्राथमिक अस्थमा कोशिकाओं को हवा में बनाए रखा-तरल अंतरफलक), के बाद उंहें उपयुक्त transwell पर रखा पारगंय समर्थन करता है ।
निष्कर्ष में, वर्णित विधि काफी अनुयाई पशु कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के प्रवासी सुविधाओं पर समझ में सुधार करने के लिए पर्याप्त क्षमता है/उपकला ऊतकों, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सबसे होनहार घाव भरने के चयन पर प्रवर्तकों और/या अवरोधकों, एक कम समय के भीतर और उच्च सटीकता के साथ ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है
Acknowledgments
यह काम रोम के Sapienza विश्वविद्यालय और इतालवी सिस्टिक फाइब्रोसिस रिसर्च फाउंडेशन (सिएना, Sondrio Valchiavenna, Cerea आईएल Sorriso di जेनी, और पविया से FFC प्रतिनिधिमंडलों द्वारा अपनाया परियोजना FFC # 11/2014 से धन द्वारा समर्थित किया गया था) । इस काम का हिस्सा भी FILAS ग्रांट Prot ने सपोर्ट किया था. FILAS-RU-2014-1020 ।
हम डॉ Loretta Ferrera के आभारी है (U.O.C. Genetica मेडिका, Istituto Giannina Gaslini, जेनोवा, इटली) के लिए दमा उपकला कोशिकाओं प्रदान ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
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