Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van de chronische contractiele activiteitsmodel van oefening om het observeren van de skeletspieren stimulatie-geïnduceerde aanpassingen in het stuk van de rat.
Abstract
Skeletspieren is een hoogst aanpasbaar weefsel, zoals de biochemische en fysiologische eigenschappen worden sterk gewijzigd in reactie op de chronische oefening. Om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen die tot verschillende aanpassingen van de spier leiden, zijn een aantal oefening protocollen zoals loopband, wiel hardlopen en zwemmen oefening gebruikt in de dierproeven. Echter, deze uitoefenen modellen vereisen een lange periode van tijd om aanpassingen van de spier, die ook kunnen worden geregeld, door humorale of neurologische factoren, dus de beperking van hun toepassingen in het bestuderen van de spier-specifieke contractie-geïnduceerde aanpassingen. Indirecte lagefrequentie stimulatie (10 Hz) voor het opwekken van chronische contractiele activiteit (CCA) is gebruikt als een alternatief model voor de uitoefening opleiding, als het met succes tot spier mitochondriale aanpassingen binnen 7 dagen, onafhankelijk van systemische factoren leiden kan. Deze paper detailleert de chirurgische technieken vereist de behandeling van CCA beroep openstaan bij de skeletspieren van ratten, voor grootschalige toepassing in de toekomst studies.
Introduction
Skeletspieren kunt aanpassen om inspanninstraining door veranderingen in de Bioenergetica en de fysieke structuur1. Een van de grote veranderingen teweeggebracht door duurtraining is mitochondriale biogenese, die kan worden geëvalueerd door een stijging van de uitdrukking van mitochondriale onderdelen (bijvoorbeeld cytochroom c oxidase [COX] subeenheden), alsmede de uitdrukking van de transcriptionele coactivator, PGC-1α2. Een groeiend aantal studies hebben aangegeven dat tal van andere factoren, met inbegrip van mitochondriale omzet en mitophagy, ook belangrijk voor de aanpassingen van de spier zijn. Nochtans, de mechanismen door welke acute of chronische oefening regelen deze processen in skeletspieren zijn nog onduidelijk.
Om de trajecten die oefening geïnduceerde spier aanpassingen regelen af te bakenen, hebben diverse modellen van de oefening zijn gebruikte in knaagdier studies, met inbegrip van de loopband, hardlopen wiel, en zwemmen van oefening. Deze protocollen hebben echter enkele beperkingen in dat ~ 4-12 weken nodig zijn om te observeren deze fenotypische wijzigingen3,4,5. Als een alternatieve experimentele methode, lagefrequentie-stimulatie-geïnduceerde chronische contractiele activiteit (CCA) heeft zijn effectief gebruikt, kan dit leiden tot aanpassingen van de spier in een aanzienlijk kortere termijn (dat wil zeggen, tot 7 dagen) en de gevolgen ervan lijken te zijn vergelijkbaar met, of zelfs groter dan andere oefening protocollen. Bovendien, de aanwezigheid van hormonale6, temperatuur7en8 van de neurologische effecten kan maken het moeilijk om te begrijpen van de spier-specifieke reacties op chronische oefening. Bijvoorbeeld, schildklier hormoon9,10 en insuline-achtige groei factor (IGF) -111 zijn geïdentificeerd om te bemiddelen opleiding-geïnduceerde muscle aanpassingen, die ook andere signaalroutes in skelet kunnen regelen spier. Met name, zijn CCA-geïnduceerde effecten minimaal geregeld systemische factoren, waardoor de nadruk worden gelegd op de directe reactie van de skeletspieren contractiele activiteit.
De externe eenheid voor CCA is geïntroduceerd door Tyler en Wright12, en is ontwikkeld met wijzigingen12. Kortom, de eenheid bestaat uit drie hoofdonderdelen: een Infrarood detector die kan worden omgezet in- en uitschakelen door blootstelling aan infrarood licht, een puls generator en een pulse-indicator (Figuur 1). Het ontwerp van de gedetailleerde circuit van de eenheid van de stimulator heeft geweest eerder13beschreven. De gedetailleerde en specifieke kenmerken van CCA kunnen worden gevonden meer diepte in een aantal review artikelen14,15,16,17. Kortom, het stimulatie-protocol is ontworpen om te activeren van de gemeenschappelijke peroneale zenuw op lage frequentie (dat wil zeggen, 10 Hz), en de bezenuwde spieren (tibialis anterior [TA] en extensor digitorum longus [EDL] spier) worden gedwongen om contract voor een vooraf bepaalde lengte van tijd (bijvoorbeeld 3-6 h). Na verloop van tijd dit hiermee de bovengenoemde spieren verschuift naar een meer aërobe fenotype, aangetoond door een toename van de capillaire dichtheid18 zowel mitochondriale inhoud19,20,21. Dus, deze methode is een bewezen model na te bootsen van sommige van de grote uithoudingsvermogen training aanpassingen binnen de skeletspieren van ratten.
Dit document stelt een gedetailleerde procedure voor de elektrode implantatie chirurgie voor het opwekken van CCA zodat de onderzoekers dit model in hun studie oefening kunnen toepassen. CCA is een uitstekend model voor het bestuderen van het tijdsverloop van muscle aanpassingen, waardoor een doeltreffend instrument voor het onderzoek van diverse gebeurtenissen op het gebied van moleculaire en signalering op beide punten van de vroege en latere tijd na het begin van de opleiding van de oefening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier-gerelateerde procedures werden herzien en goedgekeurd door de York Universiteit Animal Care Comité. Bij aankomst in het dier faciliteit aan de York University, alle ratten kregen minimaal vijf dagen acclimatiseren aan hun omgeving vóór de chirurgische ingreep, met voedsel verstrekt ad libitum. Hoewel dit protocol eerder op andere soorten15,17,22 toegepast is, wordt het huidige papier bouwt voort op het pionierswerk van de Pette en collega's23 en richt zich op het model van de rat, specifiek.
1. bereiding van chronische contractiele activiteit eenheid
- Controleer met een voltmeter, het potentieel van de munt lithiumbatterijen.
Opmerking: Het potentieel van elke batterij moet 3,0 ± 0,10 V. - Plaats twee of drie batterijen in de sleuf van de eenheid, zodat het totale potentieel 6-9 V is.
Opmerking: Het is aan de discretie van de onderzoekers te overwegen hoeveel potentieel (6 of 9 V) te handhaven tijdens het hele experimentele procedure. Afhankelijk van het ontwerp van de studie en de gewenste intensiteit van de stimulus, kunnen 2 of 3 batterijen worden gebruikt. - Controleer of dat het apparaat via de pols-indicator, functioneert door de eenheid aan 1 pulse uitgestoten door een draagbare infrarood strobe licht bloot te leggen.
2. de chirurgische Procedure van chronische contractiele activiteit
Opmerking: Steriliseren alle chirurgische instrumenten vóór de chirurgische ingreep. Zowel tijdens en onmiddellijk na de operatie, wordt de lichaamstemperatuur van de ratten onderhouden door een verwarming pad. Het is wenselijk de chirurgische procedure uitvoeren op een chirurgische draperen. De chirurg moet dragen steriele Operatiehandschoenen evenals een schone lab-jas. Indien nodig, is het aanbevolen om het dragen van een gasmasker wegwerp masker.
- Anesthetize ratten onder 1-3% Isofluraan inhalatie met zuurstof, die wordt beheerd door een gassysteem van de vaporizer. Bevestigen dier is volledig verdoofd door het stuk teen snuifje controleren en door het observeren van respiratoire diepte en snelheid. Oogbeschadigingen en/of smeermiddel toepassen op om te voorkomen dat droge ogen. Toepassing van een subcutane injectie van Meloxicam (0,5 mg/mL) 2 mg/kg.
Opmerking: Het is ook aanbevolen om een multimodale applicatie van analgesie (bijvoorbeeld Meloxicam plus lidocaïne) te minimaliseren van pijn tijdens en na de operatie. - Zachtjes de linker stuk, evenals een strook rond de romp van de achterkant van de nek, rond achter van de voorpoten en scheren over de voorste thorax. Veeg voorzichtig de geschoren gebieden met jodium en ethyl alcohol om te desinfecteren.
- Met het dier op zijn buik leggen, een kleine incisie (~0.5 cm) te maken op de achterkant van de nek in het midden van de geschoren regio (het tastbaar gebied tussen schouderbladen) met behulp van een scalpel (nr. 10 mes).
- Zoek de gemeenschappelijke peroneale zenuw.
- Roll dier op de rechterkant en maak een ~ 2-3 cm-lang in de huid van de linker stuk gesneden. Bestemd voor het gebied van de incisie rond de bovenbeen spiergroepen die gelandmerkte tussen het kuiltje van het kniegewricht en de achterkant dicht bij de oorsprong van de staart.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te besmetten de eerste snede gebied bij het wijzigen van de positie van het lichaam. - Met behulp van bot-tipped gebogen chirurgische scharen, ontleden de subcutane gebied algemeen ~3.5 - 4 cm, het scheiden van de huid van onderliggende spier om een zakje tussen de geopende huid en onderliggende spieren. Open de huid van onderliggende weefsel rond de gehele omtrek van de incisie (~1.5 cm2).
- Maak een kleine incisie (minder dan 0,5 cm) op de musculus biceps femoris met chirurgische scharen, ervoor te zorgen dat de uiteinden van de scharen zijn kappen rechtstreeks door middel van de spier.
- Het uitgesneden gebied zachtjes open totdat de interne spiergroepen en de gemeenschappelijke peroneale zenuw zichtbaar zijn (de diepte van externe spierweefsels (dat wil zeggen, de musculus biceps femoris) is ongeveer ~0.5 cm). Met behulp van Tang, zachtjes touch/knijp de zichtbaar zenuw- en observeren van de reacties van de spier doelgroepen (bijvoorbeeld TA spier) en de tenen (zichtbaar Dorsaalflexie) om te bevestigen dat de gemeenschappelijke peroneale zenuw geïsoleerd is.
Opmerking: Deze stap moet worden gedaan met uiterste voorzichtigheid te vermijden knippen of beschadigen van de zenuw. - Het oplossen van het venster door te trekken met metalen OPROLMECHANISMEN open zodat de grootte van het venster is ~1.5 cm2 met de peroneale zenuw liggen in het midden van het venster. Gebruik kleine metalen haken gekoppeld aan bandjes en/of elastiekjes die zijn vastgemaakt naar beneden naar de tabel oppervlak (of de operatie kamer) (figuur 2A).
- Roll dier op de rechterkant en maak een ~ 2-3 cm-lang in de huid van de linker stuk gesneden. Bestemd voor het gebied van de incisie rond de bovenbeen spiergroepen die gelandmerkte tussen het kuiltje van het kniegewricht en de achterkant dicht bij de oorsprong van de staart.
- Hecht de draad aan beide zijden van de zenuw.
- Bereiden van ~ 50-60 cm van polytetrafluorethyleen (PTFE)-gecoat fijne roestvrij staal draad en vouw het in de helft.
Opmerking: Het nuttig kan zijn voor bloot PTFA-gecoate draad onder de UV-licht vóór de operatie. - Haak het gevouwen deel van de draad in de gleuf van een 30 cm lange roestvrijstalen staaf. Het doorgeven van de staaf, samen met de draad, subcutaan uit de open zak van het stuk naar de ruimte van de kleine incisie aan de achterkant van de nek, in een L-vormig patroon van het been en langs het midden van de rug.
- De twee uiteinden van de draad bij het stuk te vinden. Strip de draden, aangezien alle draden PTFE-geïsoleerd. Met behulp van een scalpel, strip zorgvuldig de uiteinden van de draad door ~1.5 cm. Als de draden worden gerafeld, knip ze uit en opnieuw strip. Wikkel de draaduiteinden van de gestripte rond een afgestompte 21-G naald (5 keer), waardoor een spoel. Zodra de spoelen zijn goed, de naald van hen vrij.
- Met een grootte 6-0 chirurgische zijde, beveiligen elk van de spoelen aan weerszijden van de gemeenschappelijke peroneale zenuw (figuur 2A).
- Maak een knoop aan het eind van de spoel, en het suture aan de linker kant van de zenuw. Zorg ervoor dat de spoel op 1,5 tot 2,5 mm van de zenuw.
- Toepassing om de spoel, twee of drie extra hechtingen langs de spoel.
- Herhaal deze stappen aan de rechterkant van de zenuw.
- 2-3 druppels van antibiotische oplossing (ampicilline in een zoutoplossing; 132 mg/mL) van toepassing, en vervolgens zorgvuldig suture het venster (dat wil zeggen, musculus biceps femoris spierweefsel) met behulp van grootte 5-0 zijde.
- Bereiden van ~ 50-60 cm van polytetrafluorethyleen (PTFE)-gecoat fijne roestvrij staal draad en vouw het in de helft.
- Wind losjes de overgebleven toegestane vertraging van de draad (over de diameter van de wijsvinger) en duw in de subcutane zak boven de sutured insnijding van de musculus biceps femoris (ongeveer boven de heup).
- Toepassing van 2-3 druppels van antibiotische oplossing weer (ampicilline in een zoutoplossing; 132 mg/mL). Sluit de geopende huid door nieten.
- Sluit de draden (komt uit het gebied van de insnijding van de nek) aan de CCA stimulator.
- Sluit de pin aansluitingen met de draden.
- Knip de draad lus coming out van de incisie aan de bovenkant van de nek maken 2 draaduiteinden (deze leiden tot de spoelen ingehecht aan weerszijden van de peroneale zenuw).
- Met behulp van een scalpel, strip uit de uiteinden van de draden door ~0.5 cm. Knip uit versleten draden, indien van toepassing.
- Langzaam duwen van het gestripte deel van de draden in het gat van de pin aansluitingen en met behulp van een soldeerbout, soldeer de draden op de pin aansluitingen.
- Optioneel, Controleer de aansluiting van draden.
- De pinnen verbinden met een grote benchtop stimulator eenheid via alligator clips.
- Leveren van een enkele puls van 9 V (0.1 ms, 10 Hz) om te bevestigen dat TA spier contracten en de linker dorsiflexes voet.
- Het doorgeven van de pin verbonden-draaduiteinden via het steriele gaas-stootkussen thats ~ 4 x 4 cm.
- Sluit de pinnen aan de CCA stimulator eenheid.
- De draden doorheen het gat in de basis van het vak stimulator.
Opmerking: Deze rubriek is een eigengemaakte kamer voor de CCA stimulator eenheid en is 3,5 cm × 3.5 cm × 2,5 cm13. - Plaats de pinnen in de verbinding-aansluitingen op de CCA-eenheid. Voorzichtig zet de CCA-eenheid in de kamer. Gebruikt een kleverige tack te beveiligen de CCA-eenheid op de bodem van de kamer.
- De draden doorheen het gat in de basis van het vak stimulator.
- Met behulp van een atletische tape of de poreuze chirurgische tape, het herstellen van de kamer met tape rond de geschoren romp. Sluit de bovenkant van de kamer met drie lagen van taping en eindigen door inwikkeling een tape rond de zijkanten van de doos van de stimulator teneinde het vak (figuur 2B).
- Sluit de pin aansluitingen met de draden.
- Controleren of de CCA werkt door de eenheid aan een enkele puls van infrarood licht bloot te leggen (golflengte spectrum > 770 nm) die wordt uitgestoten door een draagbare infrarood strobe licht.
Opmerking: Als het CCA correct werkt is, onderzoekers zal kunnen zien (dat wil zeggen, TA) de stuk spieren zijn verdragsluitende in reactie op de infrarood licht. - De rat observeren en volgen van de temperatuur, totdat het volledig bewustzijn heeft herwonnen. Het huis in een single-bewoner kooi ter voorkoming van schade van andere dieren en laat niet alle tunnels of plastic objecten in de kooi voor de rest van de studie te beperken van het risico van schade aan de Spierstimulator eenheid of letsel aan het dier. Voorzien van een waterfles amoxicilline-inbegrepen (0,5 mg/mL).
- Toepassing 1 mg/kg dosis Meloxicam subcutaan elke 24 uur na de ingreep, die tenminste gedurende 72 uur blijft.
3. chronische contractiele activiteit
- Na de operatie, toestaan ten minste 5-7 dagen voor een volledig herstel van de ingesneden en hechtdraad gebieden in/rond de skeletspieren.
Opmerking: Tijdens en na de CCA procedure, grondig van elk dier conditie controleren door het observeren van hun gedrag (b.v., eten, drinken en/of verplaatsen). Bovendien bepalen elke ernstige stress of schadelijke effecten door het controleren van een verandering van lichaamsgewicht vóór en na de CCA-procedure. - Op de dag van CCA stimulatie, inschakelen CCA door bloot te leggen van de eenheid van de stimulator aan een enkele puls van infrarood licht (golflengtebereik > 770 nm) door een draagbare infrarood strobe licht.
- 3 of 6 h van 10 Hz CCA stimulatie van toepassing.
Opmerking: Het tijdsbestek voor stimulatie is aan de onderzoeker. De frequentie van stimulatie is nooit veranderd in deze experimenten en slechts zeer bescheiden verbeteringen in de mitochondriale aanpassing zijn waargenomen door de stimulatie van 3 tot 6 uur/dag, in onze ervaring uit te breiden. Indien mogelijk, Controleer de stimulatie en dier elke 30-60 min. - Uitschakelen na de gewenste CCA-periode, de CCA eenheid via infrarood-lichte blootstelling (dezelfde procedure als het inschakelen van de eenheid).
- Als meerdere dagen toe te passen, herhaalt u de stap 3.2. aan 3.4.
- Het bepalen van de timing van weefsel collectie. Verzamelen bijvoorbeeld weefsels 24 uur na het begin van de laatste aanval van CCA (d.w.z., 18 h na de laatste CCA stimulatie van 6 h), die wordt uitgevoerd onder de verdoving zoals gedaan tijdens de CCA chirurgische ingreep. Onmiddellijk na het verzamelen van euthanaseren alle weefsels, dieren door middendoor van het hart, terwijl het dier is nog steeds onder verdoving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben aangetoond dat chronische contractiele activiteit (CCA) een doeltreffend instrument is voor het opwekken van gunstige mitochondriale aanpassingen binnen de skeletspieren. Ratten onderworpen aan 7 dagen van CCA (6 uur per dag) weergegeven verbeterde mitochondriale biogenese in de gestimuleerd spier ten opzichte van het stuk ongestimuleerde contralaterale (control). Deze toename van de mitochondriale biogenese wordt aangegeven door expressie van de verhoogde eiwit van PGC-1α (figuur 3A), beschouwd als de master regulator van mitochondriale biogenese, samen met verhogingen van andere belangrijke mitochondriale eiwitten COX-I en COX-IV, dat zijn belangrijke onderdelen van de keten van het elektronentransport. Bovendien steeg de cytochroom c Oxidase (COX) enzymactiviteit, een nuttige indicator van mitochondriale inhoud, ongeveer 30% na 7 dagen van CCA (figuur 3B). Daarnaast, wij beoordeeld veranderingen in mitochondriale functie met behulp van spiervezels permeabel voor het meten van mitochondriale respiratoire capaciteit en gevonden dat CCA in een stijging in de maximale luchtwegen (dat wil zeggen, staat 3 resulteerden) capaciteit van spier onderworpen aan de 7 dagen na stimulatie ten opzichte van de controle spier (Figuur 3 c). Bovendien, beide mitochondriale populaties, subsarcolemmal (SS) en intermyofibrillar (IMF), verhoogd na 7 dagen van CCA (figuur 4A en B), en we vonden het IMF breuken uit spier onderworpen aan 7 dagen van contractiele activiteit te zijn Observably meer rood van kleur dan die is afgeleid van de spier van de controle (CON) met behulp van differentiële centrifugeren, vermoedelijk met vermelding van hogere niveaus van myoglobine, heem en andere zuurstof-gerelateerde elementen (figuur 4C).
Aanpassingen aan de autophagy en lysosomale systemen kunnen ook worden veroorzaakt door CCA. In het bijzonder, hebben wij geconstateerd een verhoging in de overvloed van de proteïne van de transcriptiefactor EB (TFEB; Figuur 5A), de belangrijkste regulator van lysosomale biogenese, door CCA helemaal tijd punten (dat wil zeggen, 1, 3 en 7 dagen), evenals andere lysosomale markeringen zoals lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (LAMP1; Figuur 5B). Interessant is dat heeft onze studie aangetoond dat aanpassingen aan de autophagy, mitophagy en lysosomale systemen vóór mitochondriale biogenese optreden.
Figuur 1. Een schematisch diagram toont belangrijke componenten van een draagbare stimulator van de CCA apparaat Dit cijfer is gewijzigd van Takahashi et al. 13. IR, infrarood. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Elektrode en stimulator implantatie. (A) een venster voor het aansluiten van de draden aan beide zijden van de gemeenschappelijke peroneale zenuw. (B) een voorbeeldige beeld voor het aantonen van een samenstel van CCA eenheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. PGC-1alpha, mitochondriale ademhaling en enzymactiviteit met CCA. (A) CCA induceert mitochondriale aanpassingen in de skeletspieren, zoals blijkt uit de toename van eiwitniveaus voor PGC-1α. Een representatieve vlek-afbeelding wordt weergegeven samen met ß-actine als het besturingselement laden. CON verwijst naar controle, dat wil zeggen, contralaterale stuk niet onderworpen aan CCA en vouw wijzigen gegevens is verkregen door het normaliseren van resultaten ten opzichte van CON op dag 1. (B) COX activiteit en (C) permeabel spier ademhalingen waren ook verhoogde volgende 7 dagen van CCA. Alle data wordt weergegeven als gemiddelde ± SEM (N = 6-8). †P < 0,05, interactie effect tussen CCA en tijd; §P < 0,05, belangrijkste effect van CCA; P < 0,05, significant verschil vs. controle op dag 1. Figuur 3A en 3B zijn gewijzigd van Kim en kap19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Bewijs van mitochondriale biogenese in spier met CCA. (A en B) Elektronen microscopische beelden geven uitgebreide volumes van zowel subsarcolemmal (SS) en intermyofibrillar (IMF) mitochondriën in skeletspieren van ratten blootgesteld aan CCA voor 7 dagen. Deze afbeelding is gewijzigd van Ljubicic et al. 21en schaal balken geven 1 µm. (C) A vergelijking van de mitochondriale fractioneringen spier tussen controle (CON) en gestimuleerd (CCA) spier na 7 dagen van CCA stimulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. De lysosomale systeem is upregulated door 7 dagen van CCA. Dit wordt aangegeven door de toename van eiwit abundanties in zowel (A) TFEB en (B) LAMP1. Resultaten worden weergegeven als vouwen wijzigingen door het normaliseren van de gegevens ten opzichte van CON op dag 1. (C) vertegenwoordiger vlek afbeeldingen worden weergegeven en GAPDH is een besturingselement laden. §P < 0,05, belangrijkste effect van CCA. Alle data wordt weergegeven als gemiddelde ± SEM (N = 8); ¶P < 0,05, belangrijkste effect van tijd; P < 0,05, significant verschil vs. controle (CON) op dag 1. Dit cijfer is gewijzigd van Kim en kap19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het activiteitsmodel van de chronische contractiele (CCA) van de oefening, via lagefrequentie-spier stimulatie in vivo, is een uitstekend model voor het bestuderen van de fenotypische aanpassingen van de spier uit te oefenen van13,24,25 , 26. zoals blijkt uit eerdere studies20,27, CCA is een doeltreffend instrument waarmee onderzoekers kunnen controle trainingsvolumes en frequenties (dat wil zeggen, de tijd en dagen), en diverse biochemische en/of moleculair onderzoek gebeurtenissen in de loop van de herhaalde aanvallen van contractiele activiteit. Een van de beste features van dit model is dat de spieren van de contralaterale stuk worden gebruikt als een interne controle, die helpt bij het minimaliseren van de variabiliteit tussen de dieren. Bovendien, onze talrijke experimenten meer dan een decennium hebben aangetoond dat de externe CCA-eenheid van een dier gewone gedragspatronen (bijvoorbeeld roaming, eten en slapen) niet beperkt, en voorziet in het gebruik van extra experimentele behandelingen dergelijke als drug injecties. Dus, kunnen onderzoekers de CCA-protocol in hun opleiding studies met hun eigen experimentele wijzigingen toepassen.
Dit protocol CCA heeft verschillende kritische stappen, hoewel alle stappen een op hoog niveau concentratie als gevolg van een aard van overleving chirurgie kunnen verlangen. Het is vooral belangrijk om te verbinden de draden op consistente locaties, en het is sterk aanbevolen om het hebben van de dezelfde bekwame onderzoeker uitvoeren van de operatie om redenen van consistentie in landmarking dezelfde plek van de zenuw, hechten van draden dezelfde afstand tot de zenuw, enz. Daarnaast is het noodzakelijk te bevestigen van de veiligheid van het tapen vóór en tijdens de CCA-toepassing, omdat losgedraaide of versleten band tot een storing van de procedure leiden kan.
Dit model CCA heeft enkele kleine beperkingen. Aangezien de CCA stimulatie eenheid is opgelost door taping, vertonen sommige dieren kleine huidirritaties rond het tape gebied. Dit kan worden verbeterd in toekomstige studies door het gebruik van een draagbare jas die de CCA kamer zonder taping zou vervangen, echter we hebben geen succes gehad met dergelijke jassen. Als alternatief, de stimulator kan worden geïmplanteerd in de intraperitoneaal ruimte om te voorkomen dat de tape procedure28, hoewel deze procedure meer invasief is. Bovendien is de eenheid beschreven externe stimulator ontworpen te worden gecontroleerd door bloot aan infrarood licht. Echter, als een eenheid niet reageert op infrarood licht, deze wijzigingen te worden vermeld in de duurzaamheid of de gevoeligheid van de eenheid na lange tijd gebruik. De uitvoering van een microchip kan uiteindelijk Vermijd het gebruik van de infrarood licht en zou alle CCA parameters worden geprogrammeerd en opgeslagen, waardoor CCA moeten worden toegepast op een meer beheerste en nauwkeurige wijze. Alle ontwerpen van de studie moeten ook overwegen het gebruik van contralaterale ledemaat sham chirurgie uit te sluiten van alle mogelijke uitkomsten als gevolg van de chirurgische ingreep zelf.
Het is de moeite waard om door te gaan onderzoeken hoe CCA spier kan reguleren massa en fenotype na perioden van chronische spier onbruik, of in het kader van andere spierziekten. Zoals blijkt uit recente klinische studies29,30, kan CCA ook worden toegepast om te onderzoeken zijn werkzaamheid op anabole signalering mechanismen in veroudering populaties. Kortom, raden we onderzoekers profiteren van het gebruik van dit protocol CCA in hun studie, waarbij zij de verschillende cellulaire en moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de skeletspieren fenotypische aanpassingen aan chronische oefening kunnen onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Liam Tyron voor zijn deskundige lezing van het manuscript. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) D. A. Hood. D. A. Hood is ook de houder van een Canada Research Chair in celfysiologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain 400 | |
| Chronic contractile activity unit | Home-made | n/a | |
| CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) | Home-made | n/a | Box should be made of opaque material or covered in an opague tape |
| Coin lithium ion batteries (3V) | Panasonic | CR2016 | |
| Medwire | Leico Industries | 316SS7/44T | |
| Solder pin (socket) | Digi-Key | ED6218-ND | |
| Zonas porous tape | Johnson & Johnson | 5104 | |
| Suture silk (Size 5) | Ethicon | 640G | |
| Suture silk (Size 6) | Ethicon | 706G | |
| Curved blunt scissor (11.5 cm Length) | F.S.T. | 14075-11 | |
| Curved blunt scissor (15 cm Length) | F.S.T. | 14111-15 | |
| Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) | Lawton | 06-0230 | |
| Scalpel | Feather | 3 | |
| Curved forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) | Home-made | n/a | Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin |
| Clip applying forceps | KLS Martin | 20-916-12 | |
| Staples (clips) | Bbraun | BN507R | |
| Metal hooks/retractor | Home-made | n/a | |
| Povidone-iodine (500 mL) | Rougier | #NPN00172944 | |
| Ampicillin sodium | Novopharm | #DIN00872644 | |
| Metacam | Boehringer | #DIN02240463 | |
| Digital multimeter (voltmeter) | Soar Corporation | ME-501 | |
| LED digital stroboscope | Lutron Electronic Enterprise | DT-2269 |
References
- Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
- Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
- Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
- Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
- Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
- Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
- Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
- Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
- Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
- Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
- Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
- Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
- Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
- Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
- Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
- Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
- Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).
- Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
- Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
- Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
- Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
- Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
- Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
- Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
- Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
- Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
- Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).
- Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
- Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).
- Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).
