Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des Aktivitätsmodells chronische kontraktilen der Übung, skelettartiger Muskel Stimulation induzierte Anpassungen in der Ratte Megalosauridae zu beobachten.
Abstract
Skelettmuskulatur ist ein anpassungsfähiges Gewebe wie seine biochemischen und physiologischen Eigenschaften stark als Reaktion auf chronische Übung verändert werden. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die verschiedenen Muskel-Adaptionen herbeizuführen, haben eine Reihe von Ausübung Protokolle wie Laufband, Rad laufen und Schwimmen-Übung in tierexperimentellen Studien verwendet worden. Jedoch üben diese Modelle erfordern eine längere Zeit zu Muskel-Anpassungen, die humorale oder neurologische Faktoren, wodurch ihre Anwendungen bei der Untersuchung der Muskel-spezifische Kontraktion-induzierte Anpassungen auch geregelt werden kann. Indirekte niederfrequente Stimulation (10 Hz) induzieren chronische kontraktilen Aktivität (CCA) hat als ein alternatives Modell für Übung Training eingesetzt, da es erfolgreich zu Muskel mitochondriale Anpassungen innerhalb von 7 Tagen, unabhängig von systemische Faktoren führen kann. Dieses Papier beschreibt die Operationstechniken der Skelettmuskulatur von Ratten, die Behandlung von CCA zuweisen für weit verbreitete Anwendung in Zukunft Studien erforderlich.
Introduction
Skelettmuskulatur kann anpassen und Ausbildung durch Veränderungen in der Bioenergetik und physikalische Struktur1ausüben. Eines der wichtigsten Veränderungen herbeigeführt durch Ausdauertraining ist mitochondriale Biogenese, welches durch eine Erhöhung der Expression des mitochondrialen Komponenten (z. B. Cytochrom C Oxidase [COX] Untereinheiten) ausgewertet werden kann, sowie der Ausdruck von die transcriptional Coactivator, PGC-1α-2. Eine wachsende Anzahl von Studien haben gezeigt, dass zahlreiche andere Faktoren, einschließlich der mitochondrialen Umsatz- und Mitophagy, auch wichtig für Muskel-Anpassungen sind. Jedoch die Mechanismen durch die akute oder chronische Übung regulieren diese Prozesse in der Skelettmuskulatur sind noch unklar.
Um die Wege abzugrenzen die Ausübung induzierten Muskel Anpassungen zu regulieren, haben verschiedene Übung Modelle in Nagetier Studien, einschließlich Laufband, Rad laufen und Schwimmen Übung gebräuchlich. Diese Protokolle haben jedoch einige Einschränkungen, dass ~ 4-12 Wochen nötig sind, um diesen phänotypischen Veränderungen3,4,5zu beobachten. Als alternative experimentelle Methode, niederfrequente Stimulation-induzierten chronischen kontraktilen Aktivität (CCA) hat effektiv verwendet, da es in einem wesentlich kürzeren Zeitraum zu Muskel Anpassungen führen kann (d. h. bis zu 7 Tagen) und seine Auswirkungen scheinen werden Sie vergleichbar oder sogar größer als andere Übung-Protokolle. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von hormonellen6, Temperatur7und neurologischen Auswirkungen8 Muskel-spezifische Reaktionen auf chronische Übung verstehen erschweren. Zum Beispiel Schilddrüsenhormone9,10 und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF)-111 wurden identifiziert, um Muskel Training-induzierte Anpassungen zu vermitteln, die auch andere Signalwege im Skelett regulieren kann Muskel. CCA-induzierte Effekte sind vor allem minimal systemische Faktoren, so dass Fokus auf die direkte Reaktion des skelettartigen Muskels auf kontraktilen Aktivität geregelt.
Die Außeneinheit für CCA wurde erstmals von Tyler und Wright12und wurde mit Modifikationen12entwickelt. Kurzum, das Gerät besteht aus drei Hauptteilen: einem Infrarotdetektor, die durch die Einwirkung von Infrarotlicht, Impulsgeber und einen Puls-Indikator (Abbildung 1) aktiviert oder deaktiviert werden kann. Die detaillierte Schaltungsdesign des Referats Stimulator wurde zuvor13beschrieben. Die detaillierte und spezifische Merkmale der CCA finden Sie in größerer Tiefe in einer Reihe von Review Artikel14,15,16,17. In Kürze soll die Stimulation Protokoll Peronaeus bei tiefen Frequenzen zu aktivieren (z. B. 10 Hz), und der innervierten Muskulatur (m. Tibialis anterior [TA] und Beinstrecker m.digitorum Longus [EDL] Muskel) sind gezwungen, Verträge für eine vorgegebenen Zeitspanne (z.B. 3-6 h). Im Laufe der Zeit verschiebt dies die genannten Muskeln zu einer mehr aerobe Phänotyp, nachgewiesen durch eine Zunahme der Kapillardichte18 und mitochondriale Inhalt19,20,21. Daher ist diese Methode ein bewährtes Modell, einige der großen Ausdauer Training Anpassungen im skelettartigen Muskel der Ratten zu imitieren.
Dieser Beitrag stellt ein detailliertes Verfahren der Elektrode Implantation Operation, CCA zu induzieren, so dass die Forscher dieses Modell in ihre Übung Studien anwenden können. CCA ist ein hervorragendes Modell für das Studium des zeitlichen Verlauf des Muskels Anpassungen, wodurch ein wirksames Instrument für die Untersuchung von molekularen und Signalisierung Veranstaltungen zu beiden frühen und späteren Zeitpunkten nach Beginn der Übung Training.
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Protocol
Alle tierbezogenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der York University Animal Care Committee. Bei der Ankunft im Tierhaus an der York University erhielten alle Ratten mindestens fünf Tage, bis an ihre Umgebung vor dem chirurgischen Eingriff mit Verpflegung Ad Libitumzu akklimatisieren. Obwohl dieses Protokoll auf andere Arten15,17,22zuvor durchgeführt wurde, das aktuelle Papier baut auf die Pionierarbeit von Pette und Kollegen23 und konzentriert sich speziell auf die Rattenmodell.
1. Vorbereitung des chronischen kontraktilen Leistungseinheit
- Überprüfen Sie mit einem Voltmeter, das Potenzial der Münze Lithiumbatterien.
Hinweis: Sollte das Potenzial eines jeden Akkus 3,0 ± 0,10 V sein. - Legen Sie zwei oder drei Batterien in den Schlitz des Gerätes, so dass das Gesamtpotenzial 6-9 V ist.
Hinweis: Es liegt im Ermessen der Forscher zu prüfen, wie viel Potenzial (6 oder 9 V), weiterhin während der gesamten Versuchsdurchführung. Je nach Design der Studie und der gewünschten Intensität des Reizes können entweder 2 oder 3 Batterien verwendet werden. - Stellen Sie sicher, dass das Gerät über das Puls-Kennzeichen funktionsfähig ist, indem man das Gerät 1 Impuls von einem tragbaren Infrarot-Strobe Licht emittiert.
2. chirurgische Verfahren chronische kontraktilen Aktivität
Hinweis: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem chirurgischen Eingriff. Während und unmittelbar nach der Operation bleibt die Körpertemperatur der Ratten durch ein Heizkissen. Es ist wünschenswert, den chirurgischen Eingriff auf eine chirurgische drapieren durchzuführen. Der Chirurg sollte sterile OP-Handschuhe sowie einen sauberen Kittel tragen. Bei Bedarf empfiehlt es sich, eine Einweg-Atemschutzmaske tragen.
- Betäuben Sie Ratten unter 1-3 % Isofluran Inhalation mit Sauerstoff, der durch ein Gas-Vaporizer-System betrieben wird. Bestätigen Sie, dass Tier vollständig durch Überprüfung Megalosauridae Zeh kneifen und durch Beobachtung der Atemwege Umfang und Tempo sediert ist. Wenden Sie okuläre Schmiermittel auf Augen, Trockenheit zu vermeiden. Wenden Sie eine subkutane Injektion von Meloxicam (0,5 mg/mL) bei 2 mg/kg.
Hinweis: Es wird auch empfohlen, eine Multi-modale Anwendung der Analgesie (z.B. Meloxicam plus Lidocain), keine Schmerzen während und nach der Operation zu minimieren. - Rasieren Sie sanft ein Streifen um den Rumpf von der Rückseite des Halses, der linken Megalosauridae sowie etwa hinter der Vorderbeine und über dem vorderen Thorax. Wischen Sie rasierte Bereichen mit Jod und Äthyl-Alkohol zu desinfizieren.
- Mit dem Tier auf den Bauch legen, machen einen kleinen Schnitt (~0.5 cm) auf der Rückseite des Halses in der Mitte der rasierte Region (tastbare Bereich zwischen den Schulterblättern) mit einem Skalpell (Nr. 10 Blatt).
- Suchen Sie die Peronaeus.
- Tier auf der rechten Seite und eine ~ 2-3 cm-langen Schnitt in der Haut der linken Megalosauridae. Zielbereich der Schnitt um die Oberschenkel-Muskel-Gruppen, die denkmalgeschützte zwischen den Grübchen des Kniegelenks und der Rückseite in der Nähe des Ursprungs der Rute ist.
Hinweis: Achten Sie darauf, den ersten Schnitt-Bereich verunreinigen, wenn die Position des Körpers verändern. - Chirurgische Schere gebogen mit stumpfen Spitzen, sezieren der subkutanen Bereich weit ~3.5 - 4 cm, trennt die Haut vom darunter liegenden Muskeln um eine Tasche zwischen geöffneten Haut und der darunter liegenden Muskeln zu machen. Öffnen Sie die Haut vom darunter liegenden Gewebe rund um den gesamten Umfang des Schnittes (~1.5 cm2).
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (weniger als 0,5 cm) auf den Bizeps Femoris Muskel mit Chirurgische Scheren, um sicherzustellen, dass die Spitzen der Schere direkt nach unten durch den Muskel schneiden.
- Der Schnittbereich sanft zu öffnen, bis die internen Muskelgruppen und der Peronaeus sichtbar sind (die Tiefe des externen Muskelgewebe (z.B. Bizeps Femoris) ist um ~0.5 cm). Mit Pinzette, sanft Touch/Prise Nervus sichtbar und beobachten Sie die Reaktionen der Muskeln Zielgruppen (z. B. TA Muskel) und Zehen (sichtbare Dorsalflexion) zu bestätigen, dass die Peronaeus isoliert ist.
Hinweis: Dieser Schritt sollte mit äußerster Vorsicht zu vermeiden, schneiden oder den Nerv Beschädigung erfolgen. - Befestigen Sie das Fenster durch offen mit Metall Retraktoren ziehen, so dass die Größe des Fensters ~1.5 cm2 mit Nervus Peronaeus liegen in der Mitte des Fensters ist. Verwenden Sie kleine Metallhaken befestigt Gurte und/oder Gummibänder, die auf der Tischfläche (oder Chirurgie Board), nach unten befestigt sind (Abbildung 2A).
- Tier auf der rechten Seite und eine ~ 2-3 cm-langen Schnitt in der Haut der linken Megalosauridae. Zielbereich der Schnitt um die Oberschenkel-Muskel-Gruppen, die denkmalgeschützte zwischen den Grübchen des Kniegelenks und der Rückseite in der Nähe des Ursprungs der Rute ist.
- Befestigen Sie den Draht zu beiden Seiten des Nervs.
- ~ 50-60 cm von Polytetrafluorethylen (PTFE) vorbereiten-feinen Edelstahl-Draht beschichtet und in der Mitte falten.
Hinweis: Es möglicherweise hilfreich, PTFA-beschichtetem Draht unter dem UV-Licht vor der Operation verfügbar zu machen. - Haken Sie den gefalteten Teil des Drahtes in den Schlitz des eine 30 cm lange Edelstahl-Stab. Übergeben Sie die Rute, zusammen mit den Draht, subkutan aus der offenen Tasche der Megalosauridae in den Bereich der kleinen Schnitt an der Rückseite des Halses in einem L-förmigen Muster am Bein und entlang der Mittellinie des Rückens.
- Finden Sie die beiden Enden des Drahtes bei der Megalosauridae. Streifen Sie die Drähte, da alle Leitungen PTFE-isoliert sind. Streifen Sie mit einem Skalpell, sorgfältig die Enden des Drahtes von ~1.5 cm. Wenn die Drähte ausgefranst werden, schneiden Sie sie aus und wieder Streifen. Wickeln Sie die abisolierte Enden einer abgestumpften 21-G-Nadel (5 Mal), so dass eine Spule. Sobald die Spulen richtig gemacht werden, lassen Sie die Nadel von ihnen.
- Mit einer Größe 6-0 chirurgische Seide, sichern Sie jeweils der Spulen auf beiden Seiten der Peronaeus (Abbildung 2A).
- Machen Sie einen Knoten am Ende der Spule, und auf der linken Seite des Nervs Naht. Sicherstellen Sie, dass die Spule bei 1,5-2,5 mm vom Nerv.
- Um die Spule zu sichern, gelten Sie zwei oder drei zusätzliche Nähte entlang der Spule.
- Wiederholen Sie diese Schritte auf der rechten Seite des Nervs.
- 2-3 Tropfen antibiotische Lösung (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL), und dann vorsichtig das Fenster (z.B. Bizeps Femoris Muskelgewebe) Größe 5-0 Seide mit Naht.
- ~ 50-60 cm von Polytetrafluorethylen (PTFE) vorbereiten-feinen Edelstahl-Draht beschichtet und in der Mitte falten.
- Lose wind den verbleibenden Durchhang der Draht (über den Durchmesser des Zeigefingers) und in der subkutanen Tasche über die genähten Inzision des Bizeps Femoris Muskels (etwa oberhalb der Hüfte) einschieben.
- Geben Sie 2-3 Tropfen antibiotische Lösung wieder (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL). Schließen Sie die geöffnete Haut durch Heften.
- Verbinden Sie die Drähte (aus dem Schnitt am Hals) mit der CCA-Stimulator.
- Verbinden Sie Pin Buchsen mit den Drähten.
- Schneiden Sie die Drahtschlinge, die aus der Schnitt an der Spitze des Halses zu 2 Kabelenden (Dies führt zu den Spulen zu beiden Seiten des Nervus Peronaeus vernäht) erstellen.
- Mit einem Skalpell, Streifen Sie die Enden der Drähte von ~0.5 cm. Cut off ausgefranste Drähte ab, wenn überhaupt.
- Langsam schieben Sie die abisolierten Teile der Drähte in das Loch der Pin Buchsen, und mit einem Lötkolben, Löten Sie der Drähte auf die Pin-Buchsen.
- Optional, überprüfen Sie die Verbindung von Drähten.
- Verbinden Sie die Stifte mit eine große Benchtop-Stimulator-Einheit über Krokodilklemmen.
- Ein Einzelimpuls von 9 V (0,1 ms, 10 Hz) um zu bestätigen, dass TA Muskel Verträge und den linken Dorsiflexes Fuß zu liefern.
- Übergeben Sie die Pin verbunden-Drahtenden durch die sterile Gaze-Pad, die ~ 4 x 4 cm.
- Verbinden Sie die Stifte mit der CCA Stimulator Einheit.
- Übergeben Sie die Kabel durch das Loch im Boden des Feldes Stimulator.
Hinweis: Dieses Feld ist eine hausgemachte Kammer für die CCA-Stimulator-Einheit und 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13. - Legen Sie die Pins in den Anschlussbuchsen am Gerät von CCA. Die CCA-Einheit legte sanft in die Kammer. Verwenden Sie eine stickige Tack, um das CCA-Gerät an der Unterseite der Kammer zu sichern.
- Übergeben Sie die Kabel durch das Loch im Boden des Feldes Stimulator.
- Befestigen Sie mit eine sportliche Band oder poröse chirurgische Band der Kammers mit Klebeband um den rasierte Rumpf. Die Spitze der Kammer mit drei Schichten des Tapings schließen und beenden durch das Einwickeln von einer Bands um die Seiten der Stimulator Box, die Box (Abb. 2 b) zu sichern.
- Verbinden Sie Pin Buchsen mit den Drähten.
- Überprüfen, ob die CCA funktioniert indem man das Gerät in einen einzigen Impuls des Infrarot-Lichtes (Wellenlängenspektrum > 770 nm), die von einem tragbaren Infrarot-Stroboskop ausgegeben.
Hinweis: Wenn die CCA ordnungsgemäß funktioniert, werden Forscher in der Lage sein zu sehen, dass die Megalosauridae Muskeln (z. B. TA) als Reaktion auf das Infrarotlicht öffentliche Auftraggeber sind. - Beobachten Sie die Ratte zu und überwachen Sie die Temperatur, bis es vollständig Bewusstsein wiedererlangt hat. In einem Single-Insassen Käfig um Schaden von anderen Tieren zu verhindern Haus und lassen Sie keine Tunnel oder plastische Objekte in den Käfig für den Rest der Studie um das Risiko der Beschädigung des Geräts Stimulator oder Verletzung des Tieres. Versorgung mit einem Amoxicillin-inklusive Trinkflasche (0,5 mg/mL).
- Gelten Sie Dosis von 1 mg/kg von Meloxicam subkutan alle 24 h nach der Operation, die mindestens 72 h nach wie vor.
3. chronische kontraktilen Aktivität
- Können Sie nach der Operation mindestens 5-7 Tage für eine vollständige Wiederherstellung der Schnitt und Naht Gebiete in/um die Skelettmuskulatur.
Hinweis: Während und nach CCA Verfahren gründlich überprüfen Sie jedes Tier Zustand durch die Beobachtung ihrer Verhaltensweisen (z. B. Essen, trinken und/oder verschieben). Darüber hinaus bestimmen Sie schweren Stress oder Nebenwirkungen durch eine Veränderung des Körpergewichts vor und nach dem CCA-Verfahren überprüfen. - Am Tag der CCA-Stimulation, CCA durch die Aufdeckung der Stimulator-Einheit in einen einzigen Impuls von infrarotem Licht einschalten (Wellenlängenbereich > 770 nm) durch ein tragbares Infrarot-Stroboskop.
- 3 oder 6 h 10 Hz CCA Stimulation anwenden.
Hinweis: Der zeitliche Rahmen für die Stimulation obliegt der Forscher. Die Häufigkeit der Stimulation nie geändert wurde in diesen Experimenten und durch die Ausweitung der Stimulation von 3 bis 6 h/Tag, nach unserer Erfahrung nur sehr bescheidene Verbesserungen in der mitochondrialen Adaption eingehalten worden. Wenn möglich, überprüfen Sie die Stimulation und Tier alle 30-60 Minuten. - Schalten Sie nach der gewünschten Zeit CCA das CCA-Gerät per Infrarot-Licht Exposition (gleicher Vorgang wie das Gerät einschalten).
- Wenn Sie mehrere Tage beantragen, wiederholen Sie den Schritt 3.2. bis 3.4.
- Zeitplan für die Erhebung der Gewebe zu bestimmen. Zum Beispiel sammeln Sie Gewebe 24 h nach Beginn der letzten Kampf des CCA (d.h.18 h nach der letzten CCA-Stimulation von 6 h), die unter der Narkose durchgeführt wird, wie bei den CCA chirurgischen Eingriff. Sofort nach dem Sammeln aller Gewebe, Tiere einschläfern von Herzen besteuert, während das Tier noch in Narkose ist.
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Representative Results
Wir haben gezeigt, dass chronische kontraktilen Aktivität (CCA) ein wirksames Instrument zur günstigen mitochondriale Anpassungen im skelettartigen Muskel induzieren ist. Ratten, die 7 Tage der CCA (6 h pro Tag) unterzogen anzeigen verbesserte mitochondriale Biogenese in der stimulierten Muskulatur im Vergleich zu den Megalosauridae unstimulierte kontralateralen (Kontrolle). Dieser Anstieg der mitochondrialen Biogenese wird durch erhöhte Protein-Expression von PGC-1α (Abbildung 3A), als der master Regulator der mitochondrialen Biogenese zusammen mit Höhen von anderen wichtigen mitochondrialen Proteinen COX-I und COX-IV, Das sind wichtige Bestandteile der Elektronentransport-Kette. Darüber hinaus erhöht die Cytochrom C Oxidase (COX) Enzym-Aktivität, ein nützlicher Indikator für mitochondriale Inhalt ca. 30 % nach 7 Tagen nach CCA (Abb. 3 b). Darüber hinaus bewerten wir Veränderungen in der mitochondrialen Funktion mit permeabilized Muskelfasern zu messen mitochondriale Atemvolumen und festgestellt, dass eine Erhöhung der maximalen Atemwege (d. h. Zustand 3) CCA führte Kapazität des Muskels 7 Tage der Stimulation im Vergleich zu Kontrolle Muskel (Abbildung 3) unterzogen. Darüber hinaus beide mitochondriale Populationen, Subsarcolemmal (SS) und intermyofibrillar (IWF), erhöht, nach 7 Tagen nach CCA (Abb. 4A und B), und wir fanden die IMF-Fraktionen aus Muskel unterzogen 7 Tage der kontraktilen Aktivität zu Energieübertragungen mehr rot in der Farbe als die aus der Kontrolle (CON) Muskel mit differentielle Zentrifugation, vermutlich zeigt höhere Myoglobin, Häm und andere Sauerstoff-bezogene Elemente (Abbildung 4) abgeleitet.
Anpassungen an die Autophagie und lysosomale Systeme können auch von CCA herbeigeführt werden. Insbesondere haben wir eine Erhöhung in der Protein-Fülle des Transkriptionsfaktors EB (TFEB; beobachtet. ( Abb. 5A), der wichtigste Regulator der lysosomalen Biogenese von CCA überhaupt Zeitpunkten (z.B. 1, 3 und 7 Tage), sowie andere lysosomale Marker wie lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (LAMP1; Abbildung 5 b). Interessanterweise hat unsere Studie gezeigt, dass Änderungen an der Autophagie, Mitophagy und lysosomale Systeme vor der mitochondrialen Biogenese auftreten.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung zeigt die Hauptkomponenten eines tragbaren Stimulator CCA Einheit Diese Zahl wurde von Takahashi Et Al. modifiziert 13. IR, Infrarot. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Elektrode und Stimulator Implantation. (A) ein Fenster für den Anschluss von Leitungen auf beiden Seiten der peronaeus. (B) eine beispielhafte Bild für den Nachweis einer Baugruppe der CCA-Einheit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. PGC-1alpha, mitochondriale Atmung und Enzymaktivität mit CCA. (A) CCA induziert mitochondriale Anpassungen in der Skelettmuskulatur, dargestellt durch Erhöhungen der Proteingehalt der PGC-1α. Eine repräsentative Fleck Bild erscheint zusammen mit ß-Actin als das Steuerelement laden. CON bezieht sich auf Kontrolle, d. h., kontralaterale Megalosauridae CCA nicht unterworfen, und Falte Änderungsdaten wurde durch die Normalisierung der Ergebnisse im Vergleich zu CON am Tag1 erhalten. (B) COX-Aktivität und (C) permeabilized Muskel Atmungen waren auch erhöhte nach 7 Tagen CCA. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM (N = 6-8). †P < 0,05, Wirkung der Interaktion zwischen CCA und Zeit; §P < 0,05, Hauptwirkung des CCA; P < 0,05, signifikanter Unterschied vs. Kontrolle am Tag1. Abbildung 3A und 3 b wurden von Kim und Haube19geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Nachweis der mitochondrialen Biogenese im Muskel mit CCA. (A und B) Elektron mikroskopische Aufnahmen zeigen vergrößerte Volumen des Subsarcolemmal (SS) und intermyofibrillar (IWF) Mitochondrien in der Skelettmuskulatur von Ratten CCA 7 Tage ausgesetzt. Dieses Bild wurde von Ljubicic Et al.modifiziert. 21und Maßstabsleisten zeigen 1 µm. (C) ein Vergleich der mitochondrialen Fractionations Muskel zwischen Kontrolle (CON) und stimuliert (CCA) Muskel nach 7 Tagen der CCA-Stimulation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Die lysosomale System ist hochreguliert von 7 Tagen nach CCA. Dies wird durch Erhöhung der Protein-Häufigkeiten in TFEB (A) und (B) LAMP1. Ergebnisse werden angezeigt, wie Änderungen Falten durch die Normalisierung der Daten in Bezug auf CON am 1. Tag. (C) repräsentative Fleck Bilder angezeigt werden und GAPDH ist ein Steuerelement laden. §P < 0,05, Haupteffekt von CCA. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM (N = 8); ¶P < 0,05, Haupteffekt Zeit; P < 0,05, signifikanter Unterschied vs. Kontrolle (CON) am 1. Tag. Diese Zahl wurde von Kim und Haube19geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die chronische kontraktilen (CCA) Aktivitätsmodell der Übung durch niederfrequente Muskel Stimulation in Vivo, ist ein hervorragendes Modell für das Studium Muskel phänotypische Anpassungen zur Ausübung von13,24,25 , 26. wie in früheren Studien20,27, CCA ist ein effektives Werkzeug, mit dem Forscher Steuern Training Volumen und Frequenzen (z. B. Uhrzeit und Tage) und verschiedene biochemische und molekulare untersuchen können, Veranstaltungen im Laufe des wiederholten Anfällen von kontraktilen Aktivität. Eines der besten Features dieses Modells ist, dass die Muskeln des kontralateralen Megalosauridae als interne Kontrolle, verwendet werden, die hilft, um Variabilität zwischen den Tieren zu minimieren. Darüber hinaus haben unsere zahlreiche Experimente mehr als zehn Jahren gezeigt, dass das Außengerät CCA kein Tier normale Verhaltensmuster (z. B. roaming, Essen und schlafen schränkt) und die Verwendung von zusätzlichen experimentelle Behandlungen so ermöglicht als Medikament spritzen. Somit können Forscher die CCA-Protokoll in ihrer Ausbildung Studien mit eigene experimentelle Änderungen gelten.
Das CCA-Protokoll hat einige wichtige Schritte, obwohl alle Schritte eine hochrangigen Konzentration aufgrund einer Art überleben Chirurgie verlangen können. Es ist besonders wichtig, die Drähte an konsistenten Speicherorten zu verbinden, und es wird dringend empfohlen, haben die gleiche geschickten Forscher operieren um Konsistenz in Landmarking der gleichen Stelle des Nervs, Nähen Leitungen den gleichen Abstand von der Nerv, etc.. Darüber hinaus ist es notwendig, die Sicherheit des Tapings vor und während der CCA-Anwendung zu bestätigen, da gelockert oder verschlissene Band zu einem Scheitern des Verfahrens führen kann.
Das CCA-Modell hat einige kleine Einschränkungen. Da die CCA-Stimulationseinheit durch Abkleben fixiert ist, zeigen einige Tiere kleinere Hautirritationen rund um den aufnehmenden Bereich. Dies könnte in zukünftigen Studien durch eine tragbare Jacke, die die CCA-Kammer ohne Tapen ersetzen würde verbessert werden, aber wir hatten Erfolg mit solchen Jacken. Alternativ kann der Stimulator in der intraperitonealen Raum zur Vermeidung der aufnehmenden Verfahren28, implantiert werden, obwohl dieses Verfahren mehr invasiv ist. Darüber hinaus soll die beschriebenen externen Stimulator-Einheit gesteuert werden, indem man Infrarot-Licht. Jedoch, wenn ein Gerät nicht auf Infrarotlicht reagieren, kann dies Änderungen in die Haltbarkeit oder die Empfindlichkeit des Gerätes nach langjähriger Nutzung hinweisen. Die Umsetzung eines Mikrochips können letztlich vermeiden Sie die Verwendung des Infrarot-Lichtes und ließen sich alle CCA Parameter programmiert und gespeichert, so dass CCA kontrolliert und präzise angewandt werden. Alle Studiendesigns sollten auch die Verwendung der kontralateralen Gliedmaße Schein Chirurgie, alle möglichen Ergebnisse, die durch den chirurgischen Eingriff selbst auszuschließen.
Es lohnt sich weiterhin untersuchen, wie CCA Muskel regulieren kann Masse und Phänotyp nach Perioden der chronischen Muskel Nichtnutzung oder im Zusammenhang mit anderen Muskelerkrankungen. Wie im jüngsten klinischen Studien29,30gezeigt, kann CCA auch angewendet werden, um seine Wirksamkeit auf anabole Signalisierung Mechanismen in alternden Bevölkerung zu untersuchen. Abschließend empfehlen wir Forscher nutzen mit diesem CCA-Protokoll in ihren Studien, wobei sie die verschiedenen zellulären und molekularen Mechanismen Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen an chronischen Übung untersuchen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für seine kompetente Lektüre des Manuskripts Liam Tyron. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC), D. A. Haube. D. A. Hood ist auch der Inhaber einer Canada Research Chair in Zellphysiologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain 400 | |
| Chronic contractile activity unit | Home-made | n/a | |
| CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) | Home-made | n/a | Box should be made of opaque material or covered in an opague tape |
| Coin lithium ion batteries (3V) | Panasonic | CR2016 | |
| Medwire | Leico Industries | 316SS7/44T | |
| Solder pin (socket) | Digi-Key | ED6218-ND | |
| Zonas porous tape | Johnson & Johnson | 5104 | |
| Suture silk (Size 5) | Ethicon | 640G | |
| Suture silk (Size 6) | Ethicon | 706G | |
| Curved blunt scissor (11.5 cm Length) | F.S.T. | 14075-11 | |
| Curved blunt scissor (15 cm Length) | F.S.T. | 14111-15 | |
| Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) | Lawton | 06-0230 | |
| Scalpel | Feather | 3 | |
| Curved forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) | Home-made | n/a | Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin |
| Clip applying forceps | KLS Martin | 20-916-12 | |
| Staples (clips) | Bbraun | BN507R | |
| Metal hooks/retractor | Home-made | n/a | |
| Povidone-iodine (500 mL) | Rougier | #NPN00172944 | |
| Ampicillin sodium | Novopharm | #DIN00872644 | |
| Metacam | Boehringer | #DIN02240463 | |
| Digital multimeter (voltmeter) | Soar Corporation | ME-501 | |
| LED digital stroboscope | Lutron Electronic Enterprise | DT-2269 |
References
- Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
- Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
- Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
- Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
- Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
- Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
- Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
- Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
- Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
- Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
- Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
- Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
- Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
- Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
- Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
- Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
- Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).
- Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
- Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
- Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
- Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
- Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
- Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
- Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
- Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
- Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
- Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).
- Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
- Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).
- Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).
