Summary
이 프로토콜 쥐 hindlimb에 골격 근육 자극 유도 적응을 관찰 하는 운동의 만성 수축 성 활동 모델의 사용을 설명 합니다.
Abstract
골격 근육은 매우 적응할 수 있는 조직 응답 만성 운동으로 크게 변경 되는 생화학 및 생리 적 속성. 다양 한 근육 적응에 대해가지고 있는 내부 메커니즘을 조사, 디딜 방 아, 휠 실행, 그리고 수영 운동 등 운동 프로토콜의 여러 동물 연구에서 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 모델 운동 근육 각 색 한, 따라서 특정 근육 수축 유발 adaptations를 공부 하 고 응용 프로그램을 제한 하는 체액 또는 신경 요인에 의해 또한 통제 될 수 있는 달성 하기 위해 오랜 기간 필요. 간접 저주파 자극 (10 Hz) 만성 수축 성 활동 (CCA)를 유도 하기 위해 사용 되었습니다 대체 모델로 운동 훈련에 대 한 성공적으로 이끌어 낼 수 있다 근육 미토 콘 드 리아 적응 7 일 이내 조직 요인의 독립으로. 이 종이 광범위 한 응용 프로그램에서 미래 연구에 대 한 쥐의 골격 근에 CCA의 치료를 적용 하는 데 필요한 수술 기법을 자세히 설명 합니다.
Introduction
골격 근육은 생체에 물리적 구조1변화를 통해 교육 운동에 적응할 수 있습니다. 지구력 훈련에 대 한 가져온 주요 변경 사항 중 하나는의 표현 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 구성 요소 (예: 시 토 크롬 c 산화 효소 [콕스] subunits)의 표현에 증가 하 여 평가할 수 있다 미토 콘 드리 아 속 transcriptional coactivator, PGC-1α2. 연구의 증가 미토 콘 드 리아 회전율과 mitophagy를 포함 하 여 수많은 다른 요인, 근육 적응에 대 한 중요 한 또한 나타내 었 다. 그러나,는 급성 또는 만성 운동 메커니즘은 이러한 규제 골격 근육에서 프로세스는 여전히 명확 하지 않다.
운동 유도 된 근육 적응 조절 경로 윤곽을 그리 다, 다양 한 운동 모델 일반적으로 설치류 연구, 디딜 방 아, 휠, 실행 하 고 수영 운동에에서 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜에는 4 ~ 12 주 phenotypic 변경3,,45관찰 하는 데 필요한 몇 가지 한계를가지고. 대체 실험 방법으로 낮은-주파수 자극 유발 만성 수축 성 활동 (CCA) 효과적으로 사용 되었습니다로 근육 적응 실질적으로 짧은 기간에 발생할 수 있습니다 (즉, 최대 7 일)의 효과를 표시 비교, 또는 다른 운동 프로토콜 보다 더 큰 일. 또한, 호르몬6,7, 온도 및 신경 효과8 의 존재 어려워질 수 있습니다 그것은 만성 운동 근육 특정 응답을 이해 하. 예를 들어 갑 상선 호르몬9,10 와 인슐린 같은 성장 인자 (IGF)-111 또한 골격에서 다른 신호 통로 조절 수 있습니다 훈련 유도 근육 적응을 중재 확인 되었습니다 근육입니다. 특히, CCA 유도 효과 최소한 골격 근육의 수축 성 활동에 직접 응답에 배치에 초점을 수 있도록 조직 요인에 의해 통제 된다.
CCA에 대 한 외부 단위 타일러와 라이트12에 의해 처음 도입 되었다 그리고 수정12와 함께 개발 되었습니다. 즉, 단위는 3 개의 주요 부분으로 구성: 켜고 적외선 빛, 펄스 발생기 및 펄스 표시기 (그림 1)에 노출에 의해 돌릴 수 있다 적외선 감지기. 자극 단위의 상세한 회로 설계 되었습니다13위에서 설명한. CCA의 상세 하 고 특정 기능에서 찾을 수 있습니다 큰 다양 한 검토에에서 깊이 기사14,15,,1617. 간단 하 게, 자극 프로토콜은 낮은 주파수에 일반적인 비 골 신경 활성화 하도록 설계 되었습니다 (즉, 10 Hz), 그리고 innervated 근육 (tibialis 앞쪽 [TA] 신 근 digitorum longus [EDL] 근육)에 대 한 계약을 강요 하는 미리 정해진 시간 (예를 들어, 3-6 h). 시간이 지나면서,이 모 세관 밀도18 에 미토 콘 드리 아 콘텐츠19,,2021증가 의해 입증 더 에어로빅 형 전술 근육 이동 합니다. 따라서,이 방법은 쥐의 골격 근 내 주요 지구력 훈련 적응의 일부를 모방 하는 검증 된 모델 이다.
이 종이 연구원은 그들의 운동 연구에서이 모델을 적용할 수 있도록 CCA 유도 전극 이식 수술의 자세한 절차를 제공 합니다. CCA 운동 훈련의 다음 모두 초기 및 나중 시간 포인트에서 다양 한 분자 및 신호 이벤트의 수사를 위한 효과적인 도구를 제공 하는 따라서 근육 적응의 시간 과정 공부에 대 한 우수한 모델입니다.
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Protocol
모든 동물 관련 절차 검토 및 뉴욕 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 했다. 뉴욕 대학에서 동물 시설에 도착, 모든 쥐 제공 음식 광고 libitum와 수술 전에 그들의 환경에 순응을 최소 5 일을 주어졌다. 이 프로토콜은 이전을 적용 된 다른 종15,,1722현재 종이 Pette과 동료23 의 선구적인 작품에 및 쥐 모델에 특히 초점을 맞추고.
1입니다. 만성 수축 성 활동 단위의 준비
- 전압계를 사용 하 여 동전 리튬 배터리의 잠재력을 확인 하십시오.
참고: 각 배터리의 잠재력 3.0 ± 0.10 V 이어야 한다. - 총 잠재력은 6-9 V 장치의 슬롯에 2 개 또는 3 개의 배터리를 삽입 합니다.
참고:이 (6 또는 9 V)을 유지 하기 위해 얼마나 많은 가능성을 고려 하는 연구자의 재량까지 전체 실험 절차 동안. 연구 설계 및 자극의 원하는 강도 따라 2 또는 3 배터리를 사용할 수 있습니다. - 장치는 제대로 작동 하는지 펄스 표시기를 통해 휴대용 적외선 스트로브 빛 방출 1 펄스를 노출 하 여 확인 합니다.
2. 만성 수축 성 활동의 수술
참고: 수술 전에 모든 수술 도구를 소독. 중과 수술 직후, 쥐의 체온 생리대에 의해 유지 됩니다. 외과 용 드 레이프에서 수술 절차를 수행 하는 것이 바람직합니다. 외과 의사는 깨끗 한 실험실 코트로 서 불 임 수술 장갑을 착용 해야 한다. 필요한 경우, 일회용 인공 호흡기 마스크를 착용 하는 것이 좋습니다.
- Anesthetize 쥐 1-3% 미만 isoflurane 흡입 산소, 가스 기화 기 시스템에 의해 운영 되는. 동물 hindlimb 발가락 핀치를 선택 하 여 및 호흡의 깊이 속도 관찰 하 여 진정 완벽 하 게는 확인 합니다. 건조를 피하기 위해 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 2 mg/kg에서 Meloxicam (0.5 mg/mL)의 피하 주사를 적용 합니다.
참고: 그것은 또한 동안에 그리고 수술 후 통증을 최소화 하기 위해 (예: Meloxicam 플러스 lidocaine) 진통의 멀티 모달 응용 프로그램을 권장. - 부드럽게 면도 목의 뒤쪽에서 몸통 주위 스트립으로 왼쪽된 hindlimb 약 뒤에 앞 발을 앞쪽 흉부에 걸쳐. 부드럽게 요오드와 에틸 알코올 소독 면도 영역을 닦으십시오.
- 동물의 뱃속에 누워, 면도 지역 (양 어깨 사이 만져 서 지역)의 중심에서 목의 뒤에 작은 절 개 (~0.5 cm) 게 메스 (No. 10 블레이드)를 사용 하 여.
- 일반적인 비 골 신경을 찾습니다.
- 동물의 오른쪽 면에 롤 하 고 ~ 2-3 cm-긴 왼쪽된 hindlimb의 피부에 잘라. 무릎 관절의 보조 개는 꼬리의 가까이 다시 사이 landmarked는 위쪽 허벅지 근육 그룹 주변 절 개 지역 대상.
참고: 수 시체의 위치를 변경할 때 첫 번째 절 개 영역을 오염 하지 않도록 주의 하십시오. - 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 곡선 수술가 위, 피하 영역을 널리 해 부 ~3.5-4 cm, 열린된 피부와 기본 근육 사이 주머니를 만들기 위해 기본 근육에서 피부를 분리. 피부 절 개 (~1.5 c m2)의 전체 둘레 기본 조직에서 엽니다.
- 수술가 위,가 위 팁은 근육을 통해 직접 다운 절단 보장 femoris 팔 뚝 근육에 작은 절 개 (미만 0.5 c m)를 확인 합니다.
- 내부 근육 그룹 및 일반적인 비 골 신경 표시 될 때까지 부드럽게 잘라 영역을 열고 (외부 근육 조직 (즉, 팔 뚝 femoris)의 깊이 ~0.5 cm 주변). 집게를 사용 하 여, 부드럽게 터치/핀치 보이는 신경 그리고 일반적인 비 골 신경 분리 되는지 확인 하는 대상 근육 그룹 (예를 들어, TA 근육) 및 발가락 (보이는 dorsiflexion)의 응답을 관찰.
참고:이 단계는 절단 또는 신경 손상 방지 하려면 극단주의 함께 행해져야 한다. - 윈도우의 크기는 ~1.5 cm2 윈도우의 중앙에 누워 비 골 신경 금속 견인 기도 당겨 창 수정. 스트랩 또는 테이블 표면 (또는 수술 보드)에 고정은 고무 줄에 연결 된 작은 금속 후크를 사용 하 여 (그림 2A).
- 동물의 오른쪽 면에 롤 하 고 ~ 2-3 cm-긴 왼쪽된 hindlimb의 피부에 잘라. 무릎 관절의 보조 개는 꼬리의 가까이 다시 사이 landmarked는 위쪽 허벅지 근육 그룹 주변 절 개 지역 대상.
- 신경의 양쪽에 와이어를 연결 합니다.
- 소계 (PTFE)의 50-60 cm를 준비-고급 스테인레스 스틸 와이어 코팅 하 고 반으로 접어.
참고: 수술 전에 자외선 아래 PTFA 코팅 와이어를 노출 하는 데 도움이 수 있습니다. - 30 cm 긴 스테인리스 막대의 슬릿을 와이어의 접힌된 부분을 후크. L 자형 패턴 다리 및 뒤의 중앙에 따라 로드, 와이어, 피하의 작은 절 개 영역, 목 뒤쪽을 향해 hindlimb 오픈 포켓에서에서 함께 전달 합니다.
- hindlimb에 철사의 2 개의 끝을 찾아. 이후 모든 전선은 PTFE 절연 전선을 스트립. ~1.5 cm에 의해 철사의 끝을 스트립 신중 하 게 메스를 사용 하 여. 와이어 마모 될 경우 그들을 잘라 고 다시 스트립. 랩 무딘된 21 G 바늘 주위 벗겨진된 철사 끝 (5 회), 코일을 만들기. 일단 코일은 제대로, 그들 로부터 바늘을 놓습니다.
- 6-0 수술 실크는 크기를 사용 하 여, 일반적인 비 골 신경 (그림 2A)의 양쪽에 코일의 각 보안.
- 코일의 끝에 매듭을 만들고 신경의 왼쪽에 봉합. 코일은 신경에서 1.5-2.5 m m 인지 확인 합니다.
- 확보 하기 위해 코일, 코일을 따라 2 개 또는 3 개의 추가 봉합을 적용 합니다.
- 신경의 오른쪽 측면에서이 단계를 반복 합니다.
- 항 생 (암 피 실린 염 분에; 132 mg/mL), 2-3 방울을 적용 하 고 신중 하 게 봉합 크기 5-0 실크를 사용 하 여 창 (즉, 팔 뚝 femoris 근육 조직).
- 소계 (PTFE)의 50-60 cm를 준비-고급 스테인레스 스틸 와이어 코팅 하 고 반으로 접어.
- 느슨하게 (검지 손가락의 지름)에 대해 와이어 및 팔 뚝 femoris 근육 (엉덩이) 위 약의 sutured 절 개 위에 피하 포켓에 밀어의 나머지 여유 바람.
- 다시 항생제 솔루션 (암 피 실린 염 분에; 132 mg/mL) 2-3 방울을 적용 합니다. 스테이플링 열린된 피부를 닫습니다.
- CCA 자극을 (목의 절 개 면 나오는) 와이어를 연결 합니다.
- 와이어 핀 소켓에 연결 합니다.
- 2 와이어 끝 (비 골 신경의 양쪽을 봉합 하는 코일에 이러한 리드)를 만드는 목의 상단에 절 개를 나오는 와이어 루프를 잘라.
- 있는 경우 메스, ~0.5 cm. 컷 닳은 전선에서 전선의 끝에서 스트립을 사용 합니다.
- 천천히 핀 소켓의 구멍에 철사의 벗겨진된 부분을 밀어 하 고 핀 소켓에 철사를 납땜 납땜을 사용 하 여.
- 필요한 경우 전선의 연결을 확인 합니다.
- 악어 클립을 통해 큰 벤치탑 자극 단위에 핀을 연결 합니다.
- 단일 펄스를 9 V (0.1 ms, 10 Hz) TA 근육 계약 및 왼쪽 발 dorsiflexes 확인을 제공 합니다.
- 핀 연결 와이어 끝 ~ 4 c m x 4cm 멸 균 거 즈 패드를 통해 전달 합니다.
- CCA 자극 단위에 핀을 연결 합니다.
- 자극 기 상자 밑면에 있는 구멍에 전선을 통과.
참고:이 상자는 CCA 자극 단위에 대 한 집에서 만든 챔버 이며 3.5 c m × 3.5 c m × 2.5 c m13. - CCA 단위에 연결 소켓에 핀을 삽입 합니다. 실로 CCA 단위를 넣어 부드럽게. 끈적끈적한 압정을 사용 하 여 챔버의 하단에 CCA 단위 보안.
- 자극 기 상자 밑면에 있는 구멍에 전선을 통과.
- Using 운동 테이프 또는 다공성 외과 테이프, 면도 몸통 주위 테이프로 챔버를 수정 합니다. 녹화의 세 가지 레이어와 챔버의 상단 닫고 테이프 상자 (그림 2B)를 확보 하기 위해 자극 상자의 측의 주위에 포장 하 여 완료 합니다.
- 와이어 핀 소켓에 연결 합니다.
- CCA 적외선 빛의 단일 펄스를 제공 하 여 작동 하는지 확인 (파장 스펙트럼 > 770 nm)는 휴대용 적외선 스트로브 빛으로 방출 된다.
참고: CCA 올바르게 작동 하는 경우 연구원은 됩니다 (즉, TA) hindlimb 근육 응답 적외선 빛으로 계약 하 고 있다 볼 수 있습니다. - 쥐를 관찰 하 고 그것은 완전히 의식이 회복 될 때까지 그것의 온도 모니터링. 그것은 다른 동물에서 어떤 해 든 지 방지 하기 위해 단일 탑승자에에서 하며 자극 단위 또는 동물에 손상의 위험을 완화 하는 연구의 나머지 부분에 대 한 장에 어떤 터널 또는 플라스틱 개체를 떠나 지 마. Amoxicillin 포함 물 병 (0.5 mg/mL)와 함께 제공 합니다.
- 피하 1 mg/kg 복용량 Meloxicam의 모든 24 h 72 h에 대 한 적어도 계속 수술을 적용 합니다.
3. 만성 수축 성 활동
- 수술 후, 절 개 및 봉합에 / 주변 지역 골격 근육의 전체 복구를 위해 적어도 5-7 일 수 있습니다.
참고: 동안 CCA 절차 후, 철저 하 게 확인 각 동물의 상태 (예: 식사, 음주, 또는 이동) 그들의 행동을 관찰 하 여. 또한, CCA 절차 전후 몸 무게의 변화를 확인 하 여 어떤 심한 스트레스 또는 부작용을 결정 합니다. - CCA 자극의 날, CCA에 자극 장치 적외선의 단일 펄스를 제공 하 여 설정 (파장 범위 > 770 nm) 휴대용 적외선 스트로브 빛.
- 10 Hz CCA 자극의 3 또는 6 h를 적용 합니다.
참고: 자극에 대 한 시간 프레임 연구원까지입니다. 이 실험에서 자극의 주파수 변경 되었습니다 결코 고 미토 콘 드리 아 적응에만 매우 겸손 기능 향상 자극 3에서 6 h/일, 우리의 경험을 확장 하 여 관찰 되었습니다. 만약에 가능 하다 면, 자극 및 동물 30-60 분 마다 확인 합니다. - 원하는 CCA 기간에 따라 적외선 빛 노출 (단위에 동일한 절차) 통해 CCA 장치를 해제 합니다.
- 여러 날 경우, 3.2 단계를 반복 합니다. 3.4.
- 조직 컬렉션의 타이밍을 결정 합니다. 예를 들어 CCA CCA 수술 동안 마 취에서 실시 되는 (즉, 6 h의 마지막 CCA 자극 후 18 h)의 마지막 시 합 개시 후 조직 24 h를 수집 합니다. 수집 후 즉시 모든 조직, 동물 마 취의 밑에 아직도 있는 동안 마음을 절 개 하 여 동물을 안락사.
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Representative Results
우리는 만성 수축 성 활동 (CCA) 골격 근육 내 유리한 미토 콘 드리 아 적응을 유도 하는 효과적인 도구입니다 나타났습니다. CCA (하루 6 h)의 7 일 대상이 쥐 unstimulated contralateral (제어) hindlimb에 비해 자극된 근육에서 향상 된 미토 콘 드리 아 속을 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 속에 있는이 증가 다른 키 미토 콘 드리 아 단백질 콕스의 고도가 함께 미토 콘 드리 아 속의 마스터 레 귤 레이 터를 간주 PGC-1α (그림 3A)의 증가 단백질 표정으로 표시 됩니다-난 및 콕스-IV, 이 전자 전송 체인의 중요 한 요소입니다. 또한, 시 토 크롬 c 산화 효소 (콕스) 효소 활동, 미토 콘 드 리아 콘텐츠의 유용한 표시기는 CCA (그림 3B)의 7 일 다음 약 30% 증가. 미토 콘 드리 아 호흡 능력을 측정 하 여 CCA 최대한 호흡기 (즉, 주 3) 증가 결과 발견 permeabilized 근육 섬유를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 기능에 있는 변화를 평가 하는 또한, 근육의 용량 대상이 자극 제어 근육 (그림 3C) 기준으로 7 일. 또한, 두 미토 콘 드 리아 인구, subsarcolemmal (SS) 및 intermyofibrillar (IMF), 다음(그림 4A 와 B), CCA의 7 일 증가 하 고 근육의 수축 성 활동을 7 일에 복종에서 IMF 분수 발견 그 보다 현저 하 게 더 많은 레드 컬러로 아마도 myoglobin, 헤, 및 산소 관련 기타 요소 (그림 4C)의 상부를 나타내는 차등 원심 분리를 사용 하 여 컨트롤 (CON) 근육에서 파생.
Autophagy 및 lysosomal 시스템 적응 또한 CCA에 의해 초래 수 있습니다. 특히, 우리가 녹음 방송 요인 EB (TFEB;의 단백질 풍부에 있는 증가 관찰 해야 그림 5A), CCA에 의해 lysosomal 속의 주 레 귤 레이 터에서 모든 시간 포인트 (즉, 1, 3, 7 일), 관련 lysosomal 막 단백질 1 (LAMP1; 같은 다른 lysosomal 마커 뿐만 아니라 그림 5B)입니다. 흥미롭게도, 우리의 연구 autophagy, mitophagy 및 lysosomal 시스템 변경 미토 콘 드리 아 속 이전 발생을 보이고 있다.
그림 1입니다. 회로도 휴대용 CCA 자극 기의 주요 구성 요소를 보여 줍니다 장치 이 그림에서 다카하시 외 수정 되었습니다. 13. 적외선, 적외선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 전극 및 자극 기 이식. (A) 일반적인 비 골 신경의 양쪽에서 와이어를 연결 하기 위한 창입니다. (B) 시연 CCA 단위의 어셈블리에 대 한 모범적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. PGC 1alpha, 미토 콘 드리 아 호흡 및 CCA와 효소 활동. (A) CCA는 PGC-1α의 단백질 수준의 증가 의해 같이 골격 근육에 있는 미토 콘 드리 아 적응을 유도 합니다. 대표 오 점 이미지 로드 컨트롤로 ß-걸 함께 표시 됩니다. 콘 제어, 즉, contralateral hindlimb CCA, 대상이 되지를 참조 하며 배 변경 데이터 하루 1 콘을 기준으로 결과 표준화 하 여 얻은 했다. (B) 콕스 활동 및 (C) permeabilized 근육 호흡 또한 CCA의 다음 7 일을 증가 했다. 모든 데이터가 평균 ± SEM으로 표시 됩니다 (N = 6-8). †P < 0.05, CCA와 시간; 사이 상호 작용 효과 §P < CCA;의 0.05, 주요 효과 P < 하루 1 제어 대 0.05, 상당한 차이. 그림 3A 그리고 3B 김 및 후드19에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. CCA와 근육의 미토 콘 드리 아 속의 증거. (A와 B) 전자 현미경 이미지 subsarcolemmal (SS)와 7 일 동안 CCA에 노출 하는 쥐의 골격 근육에서 미토 콘 드리 아의 intermyofibrillar (IMF)의 확장 된 볼륨을 나타냅니다. 이 이미지는 Ljubicic 외에서 수정 되었습니다. 21, 스케일 바는 CCA의 7 일 후 1 µ m. (C) A의 비교를 제어 (CON)와 자극된 (CCA) 근육 사이 근육의 미토 콘 드리 아 fractionations 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. Lysosomal 시스템 upregulated CCA의 7 일입니다. 이 단백질 나타났는데 TFEB (A) 와 (B) LAMP1에 있는 증가 의해 표시 됩니다. 결과 하루 1 콘을 기준으로 데이터를 정규화 하 여 변화를 접어으로 표시 됩니다. (C) 대표 오 점 이미지 표시 되 고 GAPDH는 로드 컨트롤입니다. §P < 0.05, CCA의 주요 효과 모든 데이터가 평균 ± SEM으로 표시 됩니다 (N = 8); ¶P < 0.05, 시간;의 주요 효과 P < 0.05, 제어 (CON) 하루 1 대 상당한 차이. 이 그림은 김 및 후드19에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
저주파 근육 자극에서 vivo에서,을 통해 운동, 만성 수축 성 활동 (CCA) 모델은13,,2425 운동 근육 phenotypic 적응 공부에 대 한 우수한 모델 , 26. 같이 이전 연구20,27, CCA는 효과적인 도구는 연구원의 훈련 볼륨과 주파수 (즉, 시간 및 일)를 제어할 수 있고 다양 한 생 화 학적 및 분자를 조사 수축 성 활동의 반복된 관찰 과정 이벤트. 이 모델의 가장 큰 특징 중 하나는 근육 contralateral hindlimb의 내부 제어, 동물 사이 가변성을 최소화 하는 데 도움이로 사용 됩니다. 또한, 10 년 이상 우리의 수많은 실험 외부 CCA 단위 동물의 일반적인 행동 패턴 (예: 로밍, 먹고 자 고), 제한 하지 않습니다와 같은 추가적인 실험적인 치료의 사용에 대 한 수 있습니다 나타났습니다. 으로 마약 주사. 따라서, 연구원은 그들의 자신의 실험 수정 그들의 교육 연구에 CCA 프로토콜을 적용할 수 있습니다.
이 CCA 프로토콜 모든 단계 생존 수술의는 특성상 높은 수준의 농도 요구할 수 있지만 몇 가지 중요 한 단계가, 있다. 그것은 특히 일관 된 위치에 철사를 연결 하는 것이 중요 하 고 좋습니다 같은 숙련 된 연구원 landmarking 전선에서 같은 거리를 봉합 신경의 같은 자리에서에서 일관성을 유지 하기 위해 수술을 수행 하는 신경, 등. 또한, 그것은 불린 또는 닳아 테이프 절차의 실패 이어질 수 있기 때문에 전에 및 CCA 적용 하는 동안 녹화의 보안을 확인 하는 데 필요한.
이 CCA 모델에는 몇 가지 사소한 제한이 있습니다. CCA 자극 단위 테이 핑으로 고정 되어, 이후 일부 동물 테이 핑 주변 경미한 피부 자극을 전시 한다. 그러나이 녹화 없이 CCA 챔버를 대체할 것 이라고 착용 자 켓을 통해 미래 연구에 개량 될 수 있었다,, 우리가 하지 같은 재킷으로 성공을 했습니다. 하지만이 절차는 더 많은 침략 또는 자극을 피하기 위해 테이 핑 절차28복 공간에 이식 수 있습니다. 또한, 설명된 외부 자극 단위는 적외선 빛에 노출에 의해 제어 될 설계 되었습니다. 그러나, 적외선 빛에 대응 하는 단위 못하면이 나타낼 수 있습니다 변경 내구성 또는 단위의 감도에 오랜 사용 후. 마이크로 칩의 구현 궁극적으로 적외선 빛의 사용을 피할 수 있습니다 및 프로그램을 저장 하 고, 모든 CCA 매개 변수 허용 CCA 더 통제 하 고 정확한 패션에 적용할 수 있도록. 모든 연구 디자인 또한 수술 자체에서 발생 하는 모든 가능한 결과 제외 하려면 contralateral 사지 가짜 수술의 사용을 고려 해야한다.
그것은 어떻게 CCA 근육을 통제할 수 있다 조사 계속 가치가 질량과 형 기간 만성 근육 폐기 또는 다른 근육 질병의 맥락에서 다음. 최근 임상 연구29,30같이 CCA 또한 노후화 인구에 근육 신호 메커니즘에의 효능을 검사를 적용할 수 있습니다. 끝으로, 연구를 그들의 연구에서 그것에 의하여 그들은 기본 골격 근육 만성 운동 phenotypic 적응 다양 한 세포질이 고 분자 메커니즘을 조사할 수이 CCA 프로토콜을 사용 하 여 활용 하시기 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 리암 Tyron 원고의 전문가 그의 독서에 대 한 감사입니다. 이 작품은 D. A. 후드를 자연과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에서 자금에 의해 지원 되었다. D. A. 후드 캐나다 연구의 자 세포 생리학에서의 소유자 이기도합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain 400 | |
| Chronic contractile activity unit | Home-made | n/a | |
| CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) | Home-made | n/a | Box should be made of opaque material or covered in an opague tape |
| Coin lithium ion batteries (3V) | Panasonic | CR2016 | |
| Medwire | Leico Industries | 316SS7/44T | |
| Solder pin (socket) | Digi-Key | ED6218-ND | |
| Zonas porous tape | Johnson & Johnson | 5104 | |
| Suture silk (Size 5) | Ethicon | 640G | |
| Suture silk (Size 6) | Ethicon | 706G | |
| Curved blunt scissor (11.5 cm Length) | F.S.T. | 14075-11 | |
| Curved blunt scissor (15 cm Length) | F.S.T. | 14111-15 | |
| Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) | Lawton | 06-0230 | |
| Scalpel | Feather | 3 | |
| Curved forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) | Home-made | n/a | Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin |
| Clip applying forceps | KLS Martin | 20-916-12 | |
| Staples (clips) | Bbraun | BN507R | |
| Metal hooks/retractor | Home-made | n/a | |
| Povidone-iodine (500 mL) | Rougier | #NPN00172944 | |
| Ampicillin sodium | Novopharm | #DIN00872644 | |
| Metacam | Boehringer | #DIN02240463 | |
| Digital multimeter (voltmeter) | Soar Corporation | ME-501 | |
| LED digital stroboscope | Lutron Electronic Enterprise | DT-2269 |
References
- Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
- Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
- Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
- Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
- Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
- Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
- Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
- Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
- Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
- Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
- Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
- Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
- Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
- Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
- Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
- Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
- Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).
- Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
- Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
- Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
- Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
- Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
- Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
- Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
- Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
- Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
- Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).
- Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
- Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).
- Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).
