Summary
ويصف هذا البروتوكول استخدام طراز نشاط الهوس المزمن لممارسة مراقبة تكييفات المستحثة بتحفيز العضلات في اللكتات الفئران.
Abstract
الهيكل العظمى والعضلات أنسجة القدرة على التكيف، كما خصائصه البيوكيميائية والفسيولوجية تتغير إلى حد كبير في الاستجابة لممارسة المزمنة. للتحقيق في الآليات الكامنة التي تجلب عن مختلف العضلات التكيف، استخدمت عددا من البروتوكولات ممارسة مثل المطحنة وتشغيل عجلة القيادة، وممارسة السباحة في الدراسات الحيوانية. ومع ذلك، وهذه ممارسة نماذج تتطلب فترة طويلة من الزمن لتحقيق التكيفات العضلية، التي يجوز أن ينظم أيضا عوامل خلطيه أو عصبية، مما يحد من تطبيقاتها في دراسة التعديلات الناجمة عن انكماش العضلات على حدة. التحفيز غير المباشر ذات التردد المنخفض (10 هرتز) للحث على النشاط الهوس المزمن (CCA) استخدمت كنموذج بديل لممارسة التدريب، كما يمكن أن يؤدي بنجاح إلى تكييفات المتقدرية العضلات في غضون 7 أيام، مستقلة عن العوامل النظمية. هذه الورقة تفاصيل التقنيات الجراحية المطلوبة لتطبيق العلاج للتقييم القطري المشترك على الهيكل العظمى والعضلات للفئران، لتطبيقها على نطاق واسع في المستقبل دراسات.
Introduction
يمكن تكييف الهيكل العظمى والعضلات ممارسة التدريب من خلال التغييرات في الاستقلاب والهيكل المادي1. أحد التعديلات الرئيسية الناجمة عن تدريب التحمل هو نشوء حيوي الميتوكوندريا، التي يمكن تقييمها بزيادة في التعبير عن مكونات الميتوكوندريا (مثلاً، الفسفرة التأكسدية [كوكس] مفارز)، فضلا عن التعبير عن كواكتيفاتور النسخي، PGC-1α2. عدد متزايد من الدراسات قد أشارت إلى أن العديد من عوامل أخرى، بما في ذلك معدل دوران الميتوكوندريا وميتوفاجي، أيضا هامة للتكيفات العضلية. غير أن آليات ممارسة الحادة أو المزمنة التي تنظم هذه العمليات في الهيكل العظمى والعضلات لا تزال غير واضحة.
لتحديد المسارات التي تنظم التعديلات الناجمة عن ممارسة العضلات، كانت مختلف ممارسة نماذج شائعة الاستعمال في دراسات القوارض، بما في ذلك حلقة مفرغة، تشغيل عجلة القيادة، وممارسة السباحة. بيد أن هذه البروتوكولات لها بعض القيود في ذلك ~ 4-12 أسابيع ضرورية لمراقبة هذه التغيرات المظهرية3،،من45. كأسلوب بديل تجريبية، منخفضة التردد الناجم عن تحفيز المزمنة الهوس النشاط (CCA) فعالية استخدمت، فإنه يمكن أن يؤدي إلى تعديلات العضلات في فترة أقصر بكثير (أي، تصل إلى 7 أيام) وتظهر آثارها على أن تكون قابلة للمقارنة إلى، أو حتى أكبر من البروتوكولات الأخرى لممارسة. وعلاوة على ذلك، وجود الهرمونية6، درجة الحرارة7، وآثار عصبية8 قد تجعل من الصعب على فهم الاستجابات الخاصة بالعضلات لممارسة المزمنة. على سبيل المثال، هرمون الغدة الدرقية9،10 ويشبه الأنسولين عامل النمو (IGF)-1 تم تحديد11 التوسط من أجل التعديلات الناجمة عن تدريب العضلات، التي قد تنظم أيضا مسارات إشارات أخرى في الهيكل العظمى العضلات. جدير بالذكر أن الآثار الناجمة عن التقييم القطري المشترك الحد الأدنى ينظم العوامل النظامية، مما يتيح التركيز على استجابة مباشرة للهيكل العظمى والعضلات للنشاط الهوس.
الوحدة الخارجية للتقييم القطري المشترك قدم لأول مرة قبل تايلر ورأيت12، وقد تم تطويره مع التعديلات12. باختصار، الوحدة تتكون من ثلاثة أجزاء رئيسية: كاشف الأشعة تحت حمراء التي يمكن تشغيل وإيقاف تشغيله بواسطة التعرض للأشعة تحت الحمراء، ومولد نبض، ومؤشر نبض (الشكل 1). وقد تم تصميم الدوائر التفصيلية لوحدة مشجعا الموصوفة سابقا13. يمكن العثور ملامح مفصلة ومحددة للتقييم القطري المشترك في زيادة التعمق في عدد من استعراض المواد14،15،،من1617. بإيجاز، تم تصميم البروتوكول التحفيز لتنشيط العصب الشظوي المشترك في الترددات المنخفضة (أي 10 هرتز)، وتجبر العضلات إينيرفاتيد (الظنبوبي الأمامي [تا] وعضلة باسطة أصابع طويلة [مؤسسة كهرباء لبنان]) على عقد مسبقاً تحديد طول الفترة الزمنية (مثلاً، ح 3-6). مع مرور الوقت، هذه التحولات العضلات المذكورة آنفا إلى النمط الظاهري أكثر هوائية، أظهرت زيادة في كثافة شعري18 و المحتوى المتقدرية19،،من2021. وهكذا، هذا الأسلوب نموذج ثبت لتقليد بعض التكيفات تدريب التحمل الرئيسية داخل الهيكل العظمى والعضلات للفئران.
وتعرض هذه الورقة إجراء مفصل لجراحة زرع قطب كهربائي للحث على التقييم القطري المشترك حيث أن الباحثين يمكن تطبيق هذا النموذج في دراساتهم ممارسة. التقييم القطري المشترك نموذج ممتاز لدراسة مسار الوقت التكيفات العضلية، مما يوفر أداة فعالة لتحقيق الأحداث الجزيئية وإشارات مختلفة في كل من النقاط الزمنية المبكرة ولاحقا بعد بدء ممارسة التدريب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استعراض جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وأقرته "لجنة رعاية الحيوان جامعة نيويورك". عند الوصول إلى مرفق الحيوان في جامعة نيويورك، منحت جميع الفئران كحد أدنى لمدة خمسة أيام التأقلم للبيئة الخاصة بهم قبل العملية الجراحية، مع الأغذية المقدمة الإعلانية libitum. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد طبق سابقا على سائر الأنواع15،،من1722، يبني على العمل الريادي لبيت والزملاء23 الورقة الحالية ويركز على نموذج الفئران، على وجه التحديد.
1. إعداد وحدة النشاط الهوس المزمن
- استخدام الفولتميتر، التحقق من إمكانات بطاريات الليثيوم عمله.
ملاحظة: يجب أن تكون إمكانات كل بطارية 3.0 ± 0.10 الخامس. - إدراج اثنين أو ثلاث بطاريات في الفتحة الوحدة حيث يكون احتمال مجموع الخامس 6-9.
ملاحظة: الأمر متروك لتقدير الباحثين للنظر في مدى إمكانية (6 أو 9 الخامس) للحفاظ على أثناء الإجراء التجريبي كله. اعتماداً على تصميم الدراسة، وشدة الحافز المطلوب، يمكن استخدام البطاريات أما 2 أو 3. - تحقق من أن تعمل الوحدة بشكل صحيح عن طريق مؤشر النبض، بتعريض الوحدة لنبض 1 المنبعثة من ضوء الأشعة تحت حمراء محمولة القوية.
2-الجراحة للنشاط الهوس المزمن
ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل إجراء العمليات الجراحية. على حد سواء أثناء وبعد الجراحة مباشرة، ودرجة حرارة الجسم للفئران تحتفظ وسادة تدفئة. من المستصوب إجراء العملية الجراحية على ثني جراحية. الجراح يجب ارتداء القفازات الجراحية المعقمة، فضلا عن معطف مختبر نظيفة. إذا لزم الأمر، من المستحسن ارتداء قناع تنفس المتاح.
- تخدير الفئران تحت 1-3% استنشاق إيسوفلوراني مع الأكسجين، والذي يجري تشغيله بنظام غاز المبخر. وتؤكد تماما هو مخدراً الحيوان عن طريق فحص قرصه تو اللكتات وعن طريق مراقبة عمق التنفس ومعدل. تطبيق مواد التشحيم العين في العينين لتجنب جفاف. تطبيق ميلوكسيكام (0.5 ملغ/مل) بحقن تحت الجلد 2 مغ/كغ.
ملاحظة: من المستحسن أيضا يكون لديك تطبيق النقل المتعدد وسائط من التسكين (مثلاً، ميلوكسيكام بالإضافة إلى ليدوكائين) لتقليل أي ألم أثناء وبعد الجراحة. - بلطف يحلق اللكتات اليسرى، فضلا عن قطاع من حول الجذع من الجزء الخلفي الرقبة، حوالي خلف الأمامية وعبر القفص الصدري الأمامي. امسح برفق مناطق حلق مع اليود والكحول الاثيلي لتطهير.
- مع الحيوان زرع في المعدة، جعل شق صغير (~0.5 سم) في الجزء الخلفي الرقبة في وسط منطقة حلق (منطقة الملموس بين ريش الكتف) باستخدام مشرط (بليد رقم 10).
- قم بتحديد موقع العصب الشظوي المشترك.
- لفة الحيوان على الجانب الأيمن وجعل سم ~ 2-3-قطع طويلة في جلد اللكتات اليسرى. استهداف منطقة شق حول مجموعات العضلات الفخذ العلوي هو لاندماركيد بين نقرة الركبة والظهر قريبة من أصل الذيل.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم تلويث منطقة الشق الأول عند تغيير موضع الجسم. - استخدام مقلوب بلانت منحنى المقص الجراحي، تشريح منطقة تحت الجلد على نطاق واسع ~3.5-4 سم، يفصل الجلد عن العضلات الأساسية بغية جعل جيب بين فتح الجلد والعضلات الأساسية. فتح الجلد من الأنسجة الكامنة حول محيط كامل من الشق (~1.5 سم2).
- جعل شق صغير (أقل من 0.5 سم) في العضلات الفخذية ذات الرأسين مع المقص الجراحي، ضمان أن يتم قطع نصائح المقص مباشرة أسفل من خلال العضلات.
- فتح منطقة قطع بلطف حتى المجموعات العضلية الداخلية والعصب الشظوي المشترك مرئية (عمق أنسجة العضلات الخارجية (أي، العضلة ذات الرأسين الفخذية) حوالي ~0.5 سم). استخدام الملقط، بلطف اللمس/رشة العصب مرئية ومراقبة ردود الفئات المستهدفة العضلات (مثلاً، تا العضلات) وأصابع (عطف ظهري مرئية) التأكد من أن العصب الشظوي المشترك معزولة.
ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يتم بحذر شديد لتجنب قطع أو إتلاف العصب. - إصلاح النافذة عن طريق سحب مفتوحة مع الكامشات معدنية مثل أن حجم الإطار هو ~1.5 سم2 مع العصب الشظوي الكذب في وسط الإطار. استخدام خطاطيف معدنية صغيرة تعلق على الأشرطة و/أو الأربطة المطاطية التي يتم تثبيتها إلى أسفل إلى السطح الجدول (أو مجلس الجراحة) (الشكل 2 أ).
- لفة الحيوان على الجانب الأيمن وجعل سم ~ 2-3-قطع طويلة في جلد اللكتات اليسرى. استهداف منطقة شق حول مجموعات العضلات الفخذ العلوي هو لاندماركيد بين نقرة الركبة والظهر قريبة من أصل الذيل.
- إرفاق السلك لكلا الجانبين للعصب.
- إعداد ~ 50-60 سم تترافلوروايثيلين (PTFE)-مغلفة بغرامة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ، وإضعاف ذلك في نصف.
ملاحظة: قد يكون من المفيد لفضح الأسلاك المغلفة بتفا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل الجراحة. - ربط الجزء مطوية من الأسلاك في الشق من قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ 30 سم طويلة. تمرير القضيب، جنبا إلى جنب مع السلك، تحت الجلد من جيب مفتوحة من اللكتات اتجاه منطقة شق صغير في الجزء الخلفي من الرقبة، في نمط L-شكل الساق وعلى طول وسط الظهر.
- العثور على طرفي السلك في اللكتات. قطاع الأسلاك نظراً لكل الأسلاك المعزولة PTFE. استخدام مشرط، بعناية قطاع نهايات الأسلاك من سم ~1.5. إذا أصبح المتوترة الأسلاك، قطع منها وإعادة قطاع. التفاف من نهايات الأسلاك جردت حول إبرة 21-ز يتثلم (5 مرات)، مما يجعل لفائف. وبمجرد لفائف مصنوعة بشكل صحيح، الإفراج عن الإبرة منها.
- استخدام حجم 6-0 الجراحية الحرير، تأمين كل اللفات على جانبي العصب الشظوي المشترك (الشكل 2A).
- عقده في نهاية جداً من اللولب، وخياطة أنه على الجانب الأيسر للعصب. تأكد من أن اللولب 1.5 2.5 ملم من العصب.
- لتأمين اللولب، تطبيق اثنين أو ثلاثة خيوط إضافية على طول اللولب.
- كرر هذه الخطوات على الجانب الأيسر من العصبية.
- تطبيق 2-3 قطرات حل المضادات الحيوية (الأمبيسلّين في المحلول الملحي؛ 132 مغ/مل)، وثم بعناية خياطة الإطار باستخدام الحجم 5-0 الحرير (أي أنسجة العضلات الفخذية ذات الرأسين).
- إعداد ~ 50-60 سم تترافلوروايثيلين (PTFE)-مغلفة بغرامة أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ، وإضعاف ذلك في نصف.
- ريح فضفاضة الركود المتبقية من الأسلاك (حول قطر السبابة) ودفع إلى جيب تحت الجلد أعلاه شق ستورد عضلة ذات الرأسين الفخذية (تقريبا فوق الورك).
- تطبيق 2-3 قطرات من المضادات الحيوية الحل مرة أخرى (الأمبيسلّين في المحلول الملحي؛ 132 مغ/مل). أغلق فتح الجلد التدبيس.
- قم بتوصيل الأسلاك (الخروج من منطقة شق الرقبة) مشجعا التقييم القطري المشترك.
- قم بتوصيل مقابس مع الأسلاك.
- قطع الأسلاك الحلقة القادمة من الشق في الجزء العلوي من الرقبة لإنشاء نهايات الأسلاك 2 (هذه تؤدي إلى لفائف خياطة إلى جانبي للعصب الشظوي).
- استخدام مشرط، قطاع قبالة نهايات الأسلاك التي ~0.5 سم. قص قبالة الأسلاك المتوترة، أن وجدت.
- ببطء ودفع أجزاء جردت من الأسلاك في حفرة المقابس، واستخدام لحام حديد، اللحيم الأسلاك على مأخذ دبوس.
- بشكل اختياري، تحقق من توصيل الأسلاك.
- قم بتوصيل الدبابيس وحدة مشجعا benchtop كبيرة عبر مقاطع التمساح.
- تسليم نبضة واحدة من 9 الخامس (0.1 مللي ثانية، 10 هرتز) للتأكد من أن العقود العضلات تا واليسار القدم دورسيفليكسيس.
- تمرير نهايات توصيل الأسلاك دبوس من خلال لوحة شاش معقم ~ 4 سم × 4 سم.
- قم بتوصيل الدبابيس وحدة مشجعا التقييم القطري المشترك.
- تمرير الأسلاك من خلال الثقب في قاعدة مربع مشجعا.
ملاحظة: هذا المربع دائرة محلية الصنع لوحدة مشجعا التقييم القطري المشترك وهو 3.5 × 3.5 سم × 2.5 سم13. - إدراج الدبابيس في اتصال مأخذ على وحدة التقييم القطري المشترك. برفق وضع وحدة التقييم القطري المشترك في الدائرة. استخدم مساراً لزجة لتأمين وحدة التقييم القطري المشترك في الجزء السفلي من الدائرة.
- تمرير الأسلاك من خلال الثقب في قاعدة مربع مشجعا.
- باستخدام الشريط الجراحية المسامية أو أشرطة رياضية، إصلاح الدائرة مع الشريط حول الجذع حلق. إغلاق الجزء العلوي من الدائرة مع ثلاث طبقات من تسجيل والانتهاء بالتفاف شريط حول جوانب مربع مشجعا لتأمين المربع (الشكل 2).
- قم بتوصيل مقابس مع الأسلاك.
- تحقق إذا كان التقييم القطري المشترك يعمل بتعريض الوحدة إلى نبضة واحدة من الأشعة تحت الحمراء (الطول الموجي الطيف > 770 نانومتر) التي تنبعث من ضوء الأشعة تحت حمراء محمولة القوية.
ملاحظة: إذا كان التقييم القطري المشترك يعمل بشكل صحيح، ستكون قادراً على رؤية يتم التعاقد عضلات اللكتات (أي، تا) ردا على ضوء الأشعة تحت الحمراء الباحثين. - مراقبة الفئران ورصد درجة الحرارة حتى تماما قد استعاد وعيه. البيت كان في قفص واحد-المحتل لمنع أي ضرر من الحيوانات الأخرى ولا تترك أي أنفاق أو الأجسام البلاستيكية في القفص لما تبقى من هذه الدراسة للتخفيف من خطر الأضرار بوحدة مشجعا أو الضرر للحيوان. تزويد زجاجة مياه، وتشمل أموكسيسيلين (0.5 ملغ/مل).
- تطبيق جرعة 1 ملغ/كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد كل 24 ساعة بعد الجراحة، الذي ما زال على الأقل ح 72.
3-المزمنة النشاط القلوصي
- بعد الجراحة، تسمح على الأقل 5-7 أيام للشفاء التام من شق وخياطة المناطق في أنحاء عضلات الهيكل العظمى.
ملاحظة: أثناء وبعد إجراء التقييم القطري الموحد، دقة تحقق الشرط كل الحيوانات بمراقبة سلوكهم (مثلاً الأكل الشرب و/أو نقل). وبالإضافة إلى ذلك، تحديد أي ضغط شديد أو الآثار الضارة عن طريق التحقق من تغيير وزن الجسم قبل وبعد إجراء التقييم القطري المشترك. - في اليوم من التحفيز التقييم القطري المشترك، بدوره في التقييم القطري المشترك بتعريض وحدة مشجعا لنبضه واحدة من الأشعة تحت الحمراء (الطول الموجي > 770 نانومتر) بضوء الأشعة تحت حمراء محمولة القوية.
- تطبيق ح 3 أو 6 من 10 هرتز التحفيز التقييم القطري المشترك.
ملاحظة: الإطار الزمني لتحفيز متروك للباحث. تم تغيير تواتر التحفيز ابدأ في هذه التجارب وقد لوحظت تحسينات متواضعة جداً فقط في التكيف المتقدرية بتوسيع الحفز من 3 ح 6/يوم، في تجربتنا. إذا كان ذلك ممكناً، تحقق من التحفيز والحيوان كل 30-60 دقيقة. - عقب فترة التقييم القطري المشترك المطلوب، قم بإيقاف تشغيل وحدة التقييم القطري المشترك عن طريق التعرض للضوء للأشعة تحت الحمراء (نفس إجراء تحول في الوحدة).
- إذا كان تطبيق عدة أيام، كرر الخطوة 3، 2. إلى 3.4.
- تحديد توقيت جمع الأنسجة. على سبيل المثال، جمع الأنسجة 24 ساعة بعد بداية المباراة النهائية للتقييم القطري المشترك (أي، ح 18 بعد تنشيط التقييم القطري المشترك الأخير من ح 6)، التي تجري تحت التخدير كما فعلت خلال العملية الجراحية التقييم القطري المشترك. فورا بعد جمع جميع الأنسجة، euthanize الحيوانات بنسق القلب بينما الحيوان لا يزال تحت التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد أظهرنا أن النشاط الهوس المزمن (CCA) أداة فعالة للحث على التكيفات المتقدرية مواتية داخل الهيكل العظمى والعضلات. عرض الفئران تعرض لمدة 7 أيام للتقييم القطري المشترك (6 ساعات يوميا) تعزيز نشوء حيوي المتقدرية في حفز العضلات بالمقارنة مع اللكتات unstimulated contralateral (التحكم). تتم الإشارة إلى هذه الزيادة في نشوء حيوي المتقدرية بالبروتين زيادة التعبير عن PGC-1α (الشكل 3 أ)، يعتبر المنظم الرئيسي لنشوء حيوي المتقدرية، جنبا إلى جنب مع ارتفاعات بروتينات المتقدرية الأخرى الرئيسية كوكس-الأول والرابع كوكس، هي عناصر هامة في سلسلة النقل الإلكتروني. وعلاوة على ذلك، زادت السيتوكروم ج أوكسيديز (كوكس) نشاط إنزيم، مؤشرا مفيداً لمحتوى المتقدرية، حوالي 30% بعد 7 أيام للتقييم القطري المشترك (الشكل 3B). وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم التغيرات في الوظيفة المتقدرية استخدام ألياف العضلات بيرميبيليزيد لقياس القدرة التنفسية المتقدرية ووجدت أن التقييم القطري الموحد أسفرت عن زيادة في الجهاز التنفسي الأعلى (أي الدولة 3) قدرة العضلات وتعرض لمدة 7 أيام للتحفيز بالنسبة إلى مراقبة العضلات (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، كل السكان الميتوكوندريا، سوبساركوليمال (SS) وإينتيرميوفيبريلار (صندوق النقد الدولي)، زاد بعد 7 أيام للتقييم القطري المشترك (الشكل 4 أ وب)، ووجدنا الكسور صندوق النقد الدولي من العضلات التي تتعرض يوما إلى 7 أيام نشاط القلوصي أن عندئذ أكثر أحمر في لون من تلك المستمدة من عضلة التحكم (CON) باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، يفترض أن تشير إلى مستويات أعلى من الميوجلوبين، الهيم، والعناصر الأخرى ذات الصلة بالأكسجين (الشكل 4).
التعديلات على أوتوفاجي ونظم تعويض أيضا يمكن أن يتحقق بالتقييم القطري المشترك. على وجه الخصوص، أننا لاحظنا زيادة في وفرة البروتين عامل النسخ EB (تفيب؛ الشكل 5A)، المنظم الرئيسي لنشوء حيوي الليزوزومية، بالتقييم القطري المشترك في جميع الأوقات النقاط (أي 1 و 3 و 7 أيام)، فضلا عن علامات الليزوزومية أخرى مثل البروتين غشاء الليزوزومية المرتبطة 1 (LAMP1؛ الشكل 5 (ب)). من المثير للاهتمام، وقد أظهرت دراستنا أن تحدث تعديلات على أوتوفاجي، ميتوفاجي، ونظم تعويض قبل نشوء حيوي المتقدرية.
رقم 1. رسم تخطيطي يوضح المكونات الرئيسية مشجعا التقييم القطري المشترك المحمولة unit. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكاهاشي et al. 13-الأشعة تحت الحمراء، الأشعة تحت الحمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. زرع قطب كهربائي ومشجعا. (أ) نافذة لتوصيل الأسلاك في كلا الجانبين للعصب الشظوي المشترك. (ب) صورة نموذجية لما أبدته من تجميع وحدة التقييم القطري المشترك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. PGC-1alpha والتنفس المتقدرية ونشاط إنزيم مع التقييم القطري المشترك- (أ) التقييم القطري المشترك يدفع التكيفات المتقدرية في الهيكل العظمى والعضلات، كما يتضح من زيادة مستويات البروتين من PGC-1α. يتم عرض صورة تمثيلية وصمة عار جنبا إلى جنب مع ß-أكتين كتحميل عنصر التحكم. يخدع يشير إلى عنصر التحكم، أي، اللكتات contralateral لا تخضع للتقييم القطري المشترك، وتم الحصول على بيانات التغيير حظيرة بتطبيع النتائج بالنسبة للاشتراكات في يوم 1. (ب) النشاط كوكس و (ج) بيرميبيليزيد ريسبيراتيونس العضلات وكانت أيضا زيادة 7 أيام التالية للتقييم القطري المشترك. يتم عرض كافة البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (N = 6-8). †ف < 0.05، تأثير التفاعل بين التقييم القطري المشترك والوقت؛ §ف < 0.05، التأثير الرئيسي للتقييم القطري المشترك؛ ف < 0.05، فرق كبير مقابل التحكم في يوم 1. الشكل 3 ألف وقد تم تعديل و 3B من كيم وهود19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. دليل على نشوء حيوي المتقدرية في العضلات مع التقييم القطري المشترك- (أ وب) الصور المجهرية إلكترون تشير إلى وحدات التخزين الموسع من سوبساركوليمال (SS) وإينتيرميوفيبريلار (صندوق النقد الدولي) الميتوكوندريا في الهيكل العظمى والعضلات في الفئران المعرضة إلى التقييم القطري المشترك لمدة 7 أيام. وقد تم تعديل هذه الصورة من ليوبيسيتش وآخرون. 21، وأشرطة مقياس تشير إلى 1 ميكرومتر. A (ج) المقارنة بين العضلات فراكتيونيشنز الميتوكوندريا بين عنصر التحكم (CON) وتحفز (CCA) العضلات بعد 7 أيام تحفيز التقييم القطري المشترك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. هو نظام الليزوزومية upregulated قبل 7 أيام للتقييم القطري المشترك- يدل على ذلك زيادة في وفرة البروتين في تفيب (أ) و (ب) LAMP1. يتم إظهار النتائج كما اثنِ التغييرات بتطبيع البيانات المتعلقة بالاشتراكات في يوم 1. (ج) يتم عرض الصور التمثيلية وصمة عار وجابده عنصر تحكم تحميل. §ف < 0.05، التأثير الرئيسي للتقييم القطري المشترك. يتم عرض كافة البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (N = 8)؛ ¶P < 0.05، التأثير الرئيسي للوقت؛ ف < 0.05، والفرق كبير مقابل التحكم (CON) في يوم 1. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وهود19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طراز نشاط الهوس المزمن (CCA) العملية، ومن خلال العضلات منخفضة التردد التحفيز في فيفو، نموذج ممتاز لدراسة التعديلات المظهرية العضلات ممارسة13،،من2425 , 26-كما هو مبين في الدراسات السابقة20،27، التقييم القطري المشترك هو أداة فعالة التي يمكن التحكم في وحدات التدريب والترددات (أي الوقت والأيام) الباحثين والتحقيق المختلفة البيوكيميائية و/أو الجزيئية الأحداث على مدى من نوبات متكررة من الهوس النشاط. واحدة من أفضل سمات لهذا النموذج هو أن عضلات اللكتات contralateral وتستخدم كرقابة داخلية، مما يساعد على تقليل التباين بين الحيوانات. وعلاوة على ذلك، أظهرت لنا التجارب العديدة على مدى عقد من الزمان أن وحدة التقييمات الخارجية لا يحد من أنماط سلوكية الحيوان العادية (مثل، التجوال، والأكل، والنوم)، ويسمح باستخدام علاجات تجريبية إضافية مثل حقن المخدرات. وبالتالي، يمكن تطبيق الباحثين بروتوكول التقييم القطري المشترك في دراساتهم التدريب مع التعديلات التجريبية الخاصة بها.
هذا البروتوكول القطري له عدة خطوات حاسمة، وعلى الرغم من أن جميع الخطوات قد تتطلب تركيز رفيع المستوى بسبب طابع الجراحة البقاء على قيد الحياة. أنه مهم بشكل خاص لتوصيل الأسلاك في مواقع متسقة، ويوصي بشدة أن يكون الباحث ماهراً نفس إجراء عملية جراحية للحفاظ على الاتساق في لاندماركينج نفس المكان على العصب، خياطة الأسلاك على المسافة نفسها من الأعصاب، إلخ. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري لتأكيد أمان تسجيل قبل وأثناء تطبيق التقييم القطري المشترك، لأن الشريط خففت أو تهالك قد يؤدي إلى فشل الإجراء.
هذا نموذج التقييم القطري المشترك على بعض القيود البسيطة. حيث يتم إصلاح وحدة التحفيز التقييم القطري المشترك بتسجيل، يحمل بعض الحيوانات تهيج الجلد الطفيفة حول منطقة تسجيل. وهذا يمكن تحسينها في الدراسات المستقبلية من خلال استخدام ارتداء سترة التي ستحل محل الدائرة التقييم القطري المشترك بدون تسجيل، ولكن لم يتح لنا النجاح مع هذه السترات. وبدلاً من ذلك، يمكن مزروع مشجعا في الفضاء داخل لتجنب إجراء تسجيل28، على الرغم من أن هذا الإجراء أكثر الغازية. وباﻹضافة إلى ذلك، صمم وحدة وصف خارجي مشجعا التحكم بواسطة الكشف بالأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، إذا فشلت وحدة الاستجابة للأشعة تحت الحمراء، قد يشير هذا إلى تغييرات في المتانة أو حساسية للوحدة بعد فترة طويلة من الاستخدام. تنفيذ شريحة صغيرة في نهاية المطاف قد تجنب استخدام الأشعة تحت الحمراء وسوف تسمح لجميع المعلمات التقييم القطري المشترك المبرمجة وتخزينها، مما يتيح التقييم القطري المشترك لتطبيقها بطريقة دقيقة والتي تسيطر عليها أكثر. كل دراسة التصاميم ينبغي أن تنظر أيضا في استخدام أطرافهم contralateral الشام جراحة لاستبعاد أي من النتائج المحتملة الناجمة عن العملية الجراحية نفسها.
فمن المجدي مواصلة التحقيق في كيف يمكن تنظيم التقييم القطري المشترك العضلات الجماهيري والنمط الظاهري بعد فترات من الإهمال المزمن في العضلات، أو في سياق الأمراض العضلية الأخرى. كما هو مبين في الدراسات السريرية الأخيرة29،30، يمكن أيضا تطبيق التقييم القطري المشترك لدراسة فعاليتها على آليات إرسال الإشارات الابتنائية في الشيخوخة السكانية. وفي الختام، فإننا نشجع الباحثين للاستفادة من استخدام هذا البروتوكول التقييم القطري المشترك في دراستهم، حيث أنها يمكن أن التحقيق في مختلف الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات لممارسة المزمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون تيرون ليام للخبراء قراءة المخطوطة. وأيد هذا العمل التمويل من العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) "دال ألف غطاء محرك السيارة". دال هود ألف هو أيضا صاحب كرسي أبحاث كندا في "فيزيولوجيا الخلية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain 400 | |
| Chronic contractile activity unit | Home-made | n/a | |
| CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) | Home-made | n/a | Box should be made of opaque material or covered in an opague tape |
| Coin lithium ion batteries (3V) | Panasonic | CR2016 | |
| Medwire | Leico Industries | 316SS7/44T | |
| Solder pin (socket) | Digi-Key | ED6218-ND | |
| Zonas porous tape | Johnson & Johnson | 5104 | |
| Suture silk (Size 5) | Ethicon | 640G | |
| Suture silk (Size 6) | Ethicon | 706G | |
| Curved blunt scissor (11.5 cm Length) | F.S.T. | 14075-11 | |
| Curved blunt scissor (15 cm Length) | F.S.T. | 14111-15 | |
| Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) | Lawton | 06-0230 | |
| Scalpel | Feather | 3 | |
| Curved forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) | Home-made | n/a | Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin |
| Clip applying forceps | KLS Martin | 20-916-12 | |
| Staples (clips) | Bbraun | BN507R | |
| Metal hooks/retractor | Home-made | n/a | |
| Povidone-iodine (500 mL) | Rougier | #NPN00172944 | |
| Ampicillin sodium | Novopharm | #DIN00872644 | |
| Metacam | Boehringer | #DIN02240463 | |
| Digital multimeter (voltmeter) | Soar Corporation | ME-501 | |
| LED digital stroboscope | Lutron Electronic Enterprise | DT-2269 |
References
- Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
- Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
- Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
- Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
- Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
- Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
- Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
- Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
- Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
- Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
- Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
- Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
- Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
- Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
- Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
- Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
- Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).
- Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
- Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
- Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
- Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
- Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
- Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
- Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
- Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
- Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
- Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).
- Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
- Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).
- Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).
