Summary
本议定书描述的使用慢性收缩活动模型的运动, 观察刺激诱导骨骼肌适应在大鼠后肢。
Abstract
骨骼肌是一种高度适应性的组织, 因为它的生物化学和生理特性在对慢性运动的反应中有很大的改变。为了研究导致各种肌肉适应的基本机制, 在动物研究中使用了许多运动协议, 如跑步机、轮子跑步和游泳练习。然而, 这些运动模型需要很长的时间来实现肌肉适应, 这也可能受体液或神经因素的调节, 从而限制了他们的应用研究肌肉特定收缩诱导的适应。间接低频刺激 (10 Hz), 以诱导慢性收缩活动 (共同国家评估) 已被用作运动训练的替代模型, 因为它可以成功地导致肌肉线粒体适应在7天内, 独立于系统性因素。本文详细介绍了应用治疗大鼠骨骼肌的外科技术, 以便在今后的研究中得到广泛的应用。
Introduction
骨骼肌肉可以适应运动训练, 通过改变其生物和物理结构1。耐力训练带来的主要改变之一是线粒体生物, 可以通过增加线粒体成分的表达 (例如,细胞色素 c 氧化酶 [COX] 亚基) 来评估, 以及表达转录因子, PGC-1α2。越来越多的研究表明, 许多其他因素, 包括线粒体翻转和 mitophagy, 也是重要的肌肉适应。然而, 急性或慢性运动在骨骼肌中调节这些过程的机制还不清楚。
为了描述调节运动性肌肉适应的途径, 各种运动模式在啮齿类动物研究中普遍使用, 包括跑步机、跑步轮和游泳运动。但是, 这些协议有一些限制, 因为需要 4-12 周来观察这些表型变化3,4,5。作为一种替代实验方法, 低频刺激引起的慢性收缩活动 (共同国家评估) 得到了有效的使用, 因为它可以导致肌肉适应在一个极短的时期 (即, 7 天), 其影响似乎与其他运动协议相比, 甚至更大。此外, 荷尔蒙6、温度7和神经效应8的存在可能使人们难以理解针对慢性运动的肌肉特异性反应。例如, 甲状腺激素9,10和胰岛素样生长因子 (igf-i)-111已被确定, 以调停训练诱导肌肉适应, 这也可能调节其他信号通路的骨骼肌肉.值得注意的是, 由全身因素对共同国家评估产生的影响进行了最低限度的调节, 使重点放在骨骼肌对收缩活动的直接反应上。
外部单位为共同国家评估首先介绍了由泰勒和怀特12, 并且已经开发了以修改12。简而言之, 该装置由三主要部件组成: 红外线探测器, 可通过接触红外线、脉冲发生器和脉冲指示器 (图 1) 打开和关闭。该刺激器单元的详细电路设计已在前面介绍过13。在许多审阅文章14、15、16、17中, 可以更深入地发现共同国家评估的详细和具体功能。简言之, 刺激协议的目的是激活腓总神经在低频 (即, 10 Hz), 和支配肌肉 (胫骨前 [TA] 和伸肌肌腱长长 [EDL] 肌肉) 被迫合同为预定的时间长度 (例如, 3-6 h)。随着时间的推移, 这将上述的肌肉转移到一个更有氧的表型, 显示了增加的毛细管密度18和线粒体内容19,20,21。因此, 这种方法是一个经验证的模型, 模仿一些主要的耐力训练适应大鼠骨骼肌中。
本文介绍了电极植入术的详细过程, 以使其在运动研究中得以应用。共同国家评估是研究肌肉适应时间过程的一个很好的模型, 从而为在运动训练开始后的早期和后期的各种分子和信号事件的研究提供了一个有效的工具。
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Protocol
所有与动物有关的程序都经过约克大学动物保护委员会的审查和批准。在抵达约克大学的动物设施, 所有的老鼠被给予至少五天, 适应到他们的环境之前, 在手术过程中, 与食物提供的ad 随意。虽然此协议已被应用于其他物种15,17,22, 目前的论文建立在 Pette 和同事们的开创性工作23上, 并着重于大鼠模型, 特别是。
1. 慢性收缩活动单位的制备
- 使用电压表, 检查硬币锂电池的潜力。
注: 每个电池的电位应为3.0 ± 0.10 v - 将两个或三电池插入单元的插槽中, 使总电位为 6-9 v
注意: 这是由研究人员斟酌决定在整个实验过程中保持多少潜能 (6 或9伏)。根据研究的设计和预期的刺激强度, 可以使用2或3电池。 - 通过脉冲指示器验证该单元是否正常工作, 将该单元暴露为便携式红外线闪光灯发出的1脉冲。
2. 慢性收缩活动的手术方法
注: 在手术前对所有手术工具进行消毒。在手术后和术后立即, 大鼠的体温由加热垫维持。在外科手术的褶皱上进行手术是可取的。外科医生应该戴上无菌的外科手套以及干净的实验室大衣。如有需要, 建议佩戴一次性口罩。
- 1-3% 异氟醚吸入氧麻醉大鼠, 由气体汽化器系统操作。确认动物是完全镇静通过检查后肢脚趾捏和观察呼吸深度和速率。将眼部润滑剂涂抹在眼睛上, 避免干燥。应用皮下注射昔 (0.5 毫克/毫升) 在2毫克/千克。
注意: 它也建议有一个多模态应用的镇痛 (如, 昔加利多卡因), 以减少任何疼痛期间和手术后。 - 轻轻地剃去左后肢, 以及从颈部后面的躯干, 在前肢后面和胸前。用碘和乙醇轻轻擦拭剃光区域消毒。
- 与动物躺在它的胃, 做一个小切口 (〜0.5 厘米), 在颈部背部的中心, 剃光区域 (在肩胛骨之间的可触及区域) 使用手术刀 (No. 10 刀片)。
- 找到腓总神经。
- 将动物卷到右侧, 在左后肢的皮肤上做一个 2-3 厘米长的切口。靶切口区域周围的大腿上部肌肉组是地标之间的酒窝的膝盖关节和背部接近的起源的尾巴。
注意: 在改变身体位置时, 要注意不要污染第一个切口区域。 - 使用钝尖的弯曲手术剪刀, 解剖皮下面积广泛〜 3.5-4 厘米, 分离皮肤的基础肌肉, 以使一个口袋之间打开的皮肤和潜在的肌肉。在切口的整个圆周周围打开皮肤 (~ 1.5 厘米2)。
- 做一个小切口 (少于0.5 厘米) 对肱二头肌肌肉与外科剪刀, 确保剪刀的秘诀是直接削减通过肌肉。
- 轻轻打开切口区域, 直到内部肌肉组和腓总神经可见 (外部肌肉组织 (即,股二头肌) 的深度约为0.5 厘米)。使用镊子, 轻轻触摸/捏的可见神经和观察的目标肌肉群 (如, TA 肌肉) 和脚趾 (可见背) 的反应, 以确认腓总神经是孤立的。
注意: 这一步应该采取极端谨慎的做法, 以避免切割或损害神经。 - 用金属器打开窗口, 使窗口的大小为1.5 厘米2 , 而腓神经位于窗口的中心。使用连接到表面 (或手术板) 的带和/或橡皮筋的小金属钩 (图 2A)。
- 将动物卷到右侧, 在左后肢的皮肤上做一个 2-3 厘米长的切口。靶切口区域周围的大腿上部肌肉组是地标之间的酒窝的膝盖关节和背部接近的起源的尾巴。
- 把电线连接到神经的两侧。
- 准备〜 50-60 厘米聚四氟乙烯 (PTFE) 涂层精细不锈钢线, 并对折它一半。
注意: 在手术前, 在紫外线照射下暴露 PTFA 涂层的导线可能会有帮助。 - 将铁丝的折叠部分钩入30厘米长的不锈钢棒的狭缝中。通过杆, 连同导线, 从后肢的开放口袋的皮下向小切口区域在后面的颈部, 在 L 形模式上的腿和沿背部的中心。
- 在后肢找到导线的两端。因为所有的电线都是聚四氟乙烯绝缘的, 所以要剥线。使用手术刀, 小心地剥去铁丝的两端1.5 厘米。如果电线磨损, 把它们切掉, 再重新带上。包裹剥线结束周围一个钝21克针 (5 次), 使线圈。一旦线圈是正确的, 松开他们的针头。
- 使用大小6-0 的外科手术丝, 确保腓总神经两侧两侧的线圈 (图 2A)。
- 在线圈的末端做一个结, 并且缝合它在神经的左手边。确保线圈是从神经的 1.5-2.5 毫米。
- 为了保证线圈的安全, 在线圈上应用两个或三条附加的缝合线。
- 在神经的右手边重复这些步骤。
- 应用 2-3 滴抗生素溶液 (氨苄西林生理盐水; 132 毫克/毫升), 然后仔细缝合窗口 (即,肱二头肌组织) 使用大小5-0 丝绸。
- 准备〜 50-60 厘米聚四氟乙烯 (PTFE) 涂层精细不锈钢线, 并对折它一半。
- 松散的风剩余的电线 (约直径的食指) 和推入皮下的口袋上方的缝合切口的二头肌肌肉 (约在臀部)。
- 再次应用 2-3 滴抗生素溶液 (生理盐水中的氨苄西林; 132 毫克/毫升)。通过装订关闭打开的皮肤。
- 将导线 (从颈部的切口区域出来) 连接到共同评估刺激器。
- 将针脚插座与电线连接。
- 切断从颈部顶端的切口的导线回路, 以创建2线端 (这些导线通向腓神经两侧缝合的线圈)。
- 使用手术刀, 剥去电线的两端0.5 厘米, 切断磨损的电线, 如果有的话。
- 将导线的剥离部分慢慢地推入销钉插座的孔中, 并使用烙铁, 将针脚插座上的导线焊上。
- (可选) 检查电线的连接。
- 通过鳄鱼夹子将针脚连接到大型台式刺激器单元。
- 提供一个9伏 (0.1 毫秒, 10 赫兹) 的单脉冲, 以确认 TA 肌肉收缩和左脚 dorsiflexes。
- 通过针连接线两端通过无菌纱布垫, 是〜 4 cm x 4 厘米。
- 将针脚连接到共同国家评估刺激装置。
- 通过在刺激盒底部的孔导线。
注: 此框为共同国家评估刺激单元的家庭制作室, 3.5 cm x 3.5 cm x 2.5 cm13。 - 将针脚插入到共同国家评估单位的连接插座中。将共同国家评估单位轻轻放进会议厅。使用粘性的粘性, 以确保在会议厅底部的共同国家评估单位。
- 通过在刺激盒底部的孔导线。
- 使用运动胶带或多孔的外科手术带, 在剃光的躯干周围用胶带固定房间。关闭的顶部三层的录音和完成通过包装在刺激盒两侧的磁带, 以确保框 (图 2B)。
- 将针脚插座与电线连接。
- 检查共同国家评估是否在工作, 将该单位暴露在一个单脉冲红外光 (波长频谱 > 770 nm), 这是由便携式红外线闪光灯发射。
注: 如果共同国家评估工作正常, 研究人员将能够看到后肢肌肉 (即, TA) 是为了响应红外线而收缩的。 - 观察鼠并监测它的温度, 直到它完全恢复知觉。将其放在单人笼内, 以防止其他动物受到任何伤害, 并在余下的研究中不留任何隧道或塑料物件, 以减轻对刺激装置或动物造成损害的危险。供应含阿莫西林的水瓶 (0.5 毫克/毫升)。
- 1毫克/千克剂量的昔皮下每24小时的手术后, 至少持续72小时。
3. 慢性收缩活动
- 手术后, 允许至少 5-7 天, 以充分恢复切口和缝合区/周围的骨骼肌肉。
注意: 在评估过程中和之后, 通过观察它们的行为 (例如,进食、饮酒和/或移动), 彻底检查每种动物的状况。此外, 通过检查在共同国家评估程序之前和之后的体重变化来确定任何严重的压力或不良影响。 - 在共同国家评估的刺激之日, 通过便携式红外线闪光灯将刺激装置暴露在单一的红外线脉冲 (波长范围 > 770 nm) 上, 打开共同国家评估。
- 应用3或 6 h 的10赫兹共同国家评估刺激。
注: 刺激的时间范围由研究员负责。在这些实验中, 刺激的频率从未改变过, 在我们的经验中, 通过将刺激从3延长到6小时, 在线粒体适应方面只有非常适度的增强。如果可能的话, 检查刺激和动物每 30-60 分钟。 - 在预期的共同国家评估期之后, 通过红外线曝光 (与在单位上打开相同的程序) 关闭共同国家评估单位。
- 如果应用多天, 请重复步骤3.2。到3.4。
- 确定组织收集的时间。例如, 收集组织24小时后, 在最后一回合的共同国家评估 (即, 18 小时后, 最后的共同国家评估刺激的6小时), 这是在麻醉下进行的, 在共同评估的手术过程中进行。在收集所有的组织, 安乐动物通过切除心脏, 而动物仍在麻醉。
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Representative Results
我们已经表明, 慢性收缩活动 (共同国家评估) 是一种有效的工具, 以诱导良好的线粒体适应在骨骼肌肉。大鼠接受7天的共同国家评估 (每天6小时) 显示增强的线粒体生物在受激肌肉与刺激对侧 (控制) 后肢。线粒体生物的增加是由 PGC-1α蛋白表达增加 (图 3A), 被认为是线粒体生物的主调节器, 以及其他关键线粒体蛋白 cox I 和 cox IV 的升高,这是电子传输链的重要组成部分。此外, 细胞色素 c 氧化酶 (COX) 活性, 一个有用的指标的线粒体内容, 增加约30% 后7天的共同国家评估 (图 3B)。此外, 我们评估线粒体功能的变化使用化肌纤维来测量线粒体呼吸能力, 并发现, 共同国家评估导致最大的呼吸 (即,状态 3) 的肌肉能力的增加受7天的刺激相对于控制肌肉 (图 3C)。此外, 线粒体的数量, subsarcolemmal (SS) 和 intermyofibrillar (imf), 增加了7天的共同国家评估 (图 4A 和 B), 我们发现 IMF 的分数从肌肉受7天的收缩活动显著更红的颜色比从控制 (诈骗) 肌肉使用差异离心, 可能表明更高水平的肌红蛋白, 血红素, 和其他氧相关元素 (图 4C)。
对自噬和溶酶体系统的适应也可由共同国家评估带来。特别是, 我们观察到转录因子 EB 蛋白丰度的增加 (TFEB;图 5A), 溶酶体生物的主要调节器, 在所有时间点 (即1、3和7天), 以及其他溶酶体标记, 如溶酶酶相关的膜蛋白 1 (LAMP1;图 5B)。有趣的是, 我们的研究表明, 对自噬、mitophagy 和溶酶体系统的改变发生在线粒体生物之前。
图1。一个示意图显示了一个便携式的共同国家评估刺激单位的主要组成部分.此图已从高桥et al.中修改13. IR, 红外线。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。电极和刺激器植入.(a)用于连接腓总神经两侧的导线的窗口。(B)演示共同国家评估单位的汇编的模范形象。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。PGC-1alpha, 线粒体呼吸和酶活性与共同国家评估.(A)共同国家评估在骨骼肌中诱导线粒体的适应, 如 PGC-1α蛋白水平的增加所示。？肌动蛋白作为加载控制, 显示有代表性的印迹图像。是指控制,即, 对侧后肢不受共同评估, 和折叠变化的数据得到了正常化的结果相对于1天的骗局。(B) COX 活动和(C)化肌呼吸在7天的共同评估之后也增加了。所有数据显示为平均± SEM (N = 6-8)。†P < 0.05, 共同国家评估与时间之间的互动效应;§P < 0.05, 共同国家评估的主要作用;*P < 0.05, 1 天的显著差异与控制。图 3A和 3B已从 Kim 和引擎盖19中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。线粒体生物的证据在肌肉与共同国家评估.(A 和 B)电子显微图像显示7天的大鼠骨骼肌中 subsarcolemmal (SS) 和 intermyofibrillar (IMF) 线粒体的体积增大。此图像已从柳比西奇et al中进行了修改。21, 刻度线表示1µm. (C)在7天的共同评估刺激下, 对照 (与) 肌肉线粒体分馏的比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。溶酶体系统由7天的共同国家评估上调.在(A) TFEB 和(B) LAMP1 中, 蛋白质丰度的增加表明了这一点。结果显示为折叠的变化, 通过正常化数据相对于1天的骗局。(C)有代表性的印迹图像显示和 GAPDH 是一个加载控制。§P < 0.05, 共同国家评估的主要效果。所有数据显示为平均± SEM (N = 8);¶P < 0.05, 主要影响时间;*P < 0.05, 1 天的显著差异与控制 (欺诈)。此图已从 Kim 和引擎盖19进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
慢性收缩活动 (共同国家评估) 模型的运动, 通过低频肌肉刺激在体内, 是一个优秀的模型研究肌肉表型适应锻炼13,24,25,26. 如前面的研究中所示,20,27, 共同国家评估是一个有效的工具, 研究人员可以控制训练量和频率 (即时间和天数), 并调查各种生物化学和/或分子反复收缩活动过程中发生的事件。这个模型的一个最好的特点是, 对侧后肢的肌肉被用作内部控制, 这有助于减少动物之间的变异性。此外, 我们在过去十年的大量实验表明, 外部共同国家评估单位并不限制动物的一般行为模式 (例如,漫游、进食和睡觉), 并允许使用额外的实验性治疗, 如注射毒品因此, 研究人员可以在他们的训练研究中应用共同国家评估协议, 并进行自己的实验修改。
这项共同国家评估协议有几个关键步骤, 尽管所有步骤可能要求高浓度由于生存手术的性质。这是特别重要的连接线在一致的位置, 它是强烈建议有相同的熟练研究员执行手术, 以保持一致的 landmarking 在同一地点的神经, 缝合线从相同的距离神经,等。此外, 必须在共同国家评估申请之前和期间确认录音的安全性, 因为松动或磨损的胶带可能导致程序的失败。
这种共同国家评估模式有一些小的局限性。由于共同国家评估刺激单位是固定的录音, 一些动物表现出轻微的皮肤过敏周围的录音区域。在今后的研究中, 这可以通过使用可穿戴的夹克来改进, 而不用录音来代替共同国家评估室, 但是, 我们还没有成功使用这种夹克。另外, 刺激器可以植入腹腔空间, 以避免录音程序28, 虽然这个过程是更具侵入性。此外, 所描述的外部刺激器单元的设计是通过暴露在红外光控制。然而, 如果一个单位不能响应红外线, 这可能表明在长期使用后, 单位的耐久性或灵敏度的变化。微芯片的实施可能最终避免使用红外线, 并允许所有的共同国家评估参数被编程和存储, 使共同国家评估能够以更有控制和准确的方式应用。所有的研究设计也应考虑使用对侧肢体假手术, 以排除任何可能的结果, 由手术过程本身。
这是值得继续研究如何评估可以调节肌肉质量和表型后的长期肌肉废弃, 或在其他肌肉疾病的情况下。如最近的临床研究中所示29,30, 也可以应用共同国家评估研究其在衰老人群中合成代谢信号机制的功效。最后, 我们鼓励研究人员利用这一共同国家评估的协议在他们的研究, 据此他们可以研究的各种细胞和分子机制的基础上骨骼肌肉表型适应慢性运动。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢利亚姆泰伦的专家阅读手稿。这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC) 对检察官的资助。检察官胡德也是一个加拿大研究椅子在细胞生理学的持有者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain 400 | |
| Chronic contractile activity unit | Home-made | n/a | |
| CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) | Home-made | n/a | Box should be made of opaque material or covered in an opague tape |
| Coin lithium ion batteries (3V) | Panasonic | CR2016 | |
| Medwire | Leico Industries | 316SS7/44T | |
| Solder pin (socket) | Digi-Key | ED6218-ND | |
| Zonas porous tape | Johnson & Johnson | 5104 | |
| Suture silk (Size 5) | Ethicon | 640G | |
| Suture silk (Size 6) | Ethicon | 706G | |
| Curved blunt scissor (11.5 cm Length) | F.S.T. | 14075-11 | |
| Curved blunt scissor (15 cm Length) | F.S.T. | 14111-15 | |
| Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) | Lawton | 06-0230 | |
| Scalpel | Feather | 3 | |
| Curved forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) | Home-made | n/a | Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin |
| Clip applying forceps | KLS Martin | 20-916-12 | |
| Staples (clips) | Bbraun | BN507R | |
| Metal hooks/retractor | Home-made | n/a | |
| Povidone-iodine (500 mL) | Rougier | #NPN00172944 | |
| Ampicillin sodium | Novopharm | #DIN00872644 | |
| Metacam | Boehringer | #DIN02240463 | |
| Digital multimeter (voltmeter) | Soar Corporation | ME-501 | |
| LED digital stroboscope | Lutron Electronic Enterprise | DT-2269 |
References
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