Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Published: January 25, 2018 doi: 10.3791/56827
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Muscle Health Research Centre, York University, 2School of Kinesiology and Health Science, York University, 3National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של הדגם פעילות כויץ כרונית של תרגיל להתבונן הנוצרות על-ידי גירוי שרירי השלד עיבודים ב hindlimb החולדה.

Abstract

שרירי השלד הוא רקמה מאוד, כמו תכונותיו הביוכימי, פיזיולוגיים הם שינו באופן משמעותי בתגובה פעילות גופנית כרונית. לחקור את המנגנונים הבסיסית לגבי עיבודים שרירים שונים, מספר תרגיל פרוטוקולים כגון הליכון, גלגל ריצה ואימון שחייה היו בשימוש במחקרים בבעלי חיים. עם זאת, התרגיל אלה מודלים דורשים תקופה ארוכה של זמן כדי להשיג שרירים עיבודים, אשר עשוי להיות מוסדרים גם על ידי גורמים ההורמונאלית או נוירולוגיות, ובכך יגביל את היישומים שלהם ללמוד עיבודים הנוצרות על-ידי התכווצות של שרירים ספציפיים. גירוי עקיף בתדר נמוך (10 Hz) כדי לעודד פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) שימש כמודל חלופי עבור תרגיל אימונים, כמו זה יכול בהצלחה להוביל עיבודים מיטוכונדריאלי שרירים תוך 7 ימים, עצמאית של גורמים מערכתית. מאמר זה מפרט את טכניקות ניתוחיות הדרוש כדי להחיל את הטיפול של המרכז לאמנות עכשווית שרירי השלד של חולדות, יישום נרחב בעתיד מחקרים.

Introduction

שרירי השלד יכול להסתגל תרגיל אימון באמצעות שינויים ביואנרגיה ואת המבנה הפיזי1. אחד השינויים העיקריים הביא על ידי אימון סבולת הוא להן מיטוכונדריאלי, אשר יכול להיות מוערך על ידי עלייה בביטוי של רכיבים מיטוכונדריאלי (למשל, ציטוכרום c אוקסידאז [קוקס] subunits), כמו גם הביטוי של coactivator תעתיק, PGC-1α2. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי גורמים רבים אחרים, כולל מחזור מיטוכונדריאלי, mitophagy, חשובים גם עיבודים שריר. עם זאת, המנגנון על ידי איזה תרגיל אקוטי או כרוני לווסת את אלה תהליכים בשרירי השלד לא ברורים.

על המסלולים המסדירה שריר הנגרמת עיבודים, מודלים שונים של פעילות גופנית היו בשימוש נפוץ במחקרים מכרסמים, כולל הליכון, גלגל ריצה ושחייה תרגיל. אולם, פרוטוקולים אלה יש כמה מגבלות בכך ~ 4-12 שבועות יש צורך לבחון אלו שינויים פנוטיפי3,4,5. ניסיוני כאמצעי חלופי, תדירות נמוכה הנוצרות על-ידי גירוי כרוני כויץ פעילות (המרכז לאמנות עכשווית) השתמשו ביעילות רבה, כמו זה יכול להוביל עיבודים שרירים תוך תקופה קצרה יותר באופן משמעותי (קרי, עד 7 ימים) ונראה את השפעותיו להיות דומה, או אף יותר מאשר פרוטוקולים אחרים פעילות גופנית. יתר על כן, הנוכחות של הורמונלי6, טמפרטורה7ותופעות נוירולוגיות8 עשוי להקשות להבין תגובות ספציפיות שרירים פעילות גופנית כרונית. לדוגמה, הורמון בלוטת התריס9,10 ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF)-111 זוהו לתווך עיבודים הכשרה-induced שרירים, אשר יכול גם לווסת את איתות המסלולים אחרות בהשלד שריר. ראוי לציין, המרכז לאמנות עכשווית-induced אפקטים מינימלית מוסדרים על ידי גורמים מערכתית, המאפשר מיקוד להניחו על התגובה הישירה של שריר השלד כויץ פעילות.

היחידה חיצוני עבור המרכז לאמנות עכשווית הוצג לראשונה על ידי טיילר, רייט12, פותחה עם שינויים12. בקיצור, היחידה מורכבת משלושה חלקים עיקריים: גלאי אינפרא-אדום זה ניתן להפעיל ולכבות כתוצאה מחשיפה אור אינפרא-אדום, גנרטור הדופק, מחוון הדופק (איור 1). עיצוב מפורט מעגל של היחידה ממריץ היה שתואר לעיל13. המאפיינים המפורטים של המרכז לאמנות עכשווית ניתן למצוא יותר עומק במספר של סקירת מאמרים14,15,16,17. בקצרה, פרוטוקול גירוי נועד להפעיל את שיתוק נפוצות בתדר נמוך (קרי, 10 הרץ), ואת השרירים innervated (השוקתי הקדמי [ת א], השריר פושט האצבעות הארוך [אדי]) נאלצים נכלל בחוזה מראש את משך הזמן (למשל, h 3-6). לאורך זמן, זה משמרות את השרירים הנ ל כדי הפנוטיפ אירובית יותר, הפגינו מעלייה ברמת צפיפות נימי18 והן תוכן מיטוכונדריאלי19,20,21. לכן, בשיטה זו הוא מודל מוכח לחקות חלק עיבודים אימון סיבולת גדולה תוך שרירי השלד של חולדות.

מאמר זה מציג הליך מפורט של הניתוח השרשה אלקטרודה לזירוז המרכז לאמנות עכשווית, כך החוקרים ניתן להחיל את המודל הזה בלימודיהם תרגיל. המרכז לאמנות עכשווית היא דוגמנית מעולה ללמוד מסלול הזמן של עיבודים השריר, ובכך לספק כלי יעיל עבור חקירת האירועים המולקולריים איתות השונים בשתי נקודות זמן מוקדם ומאוחר יותר בעקבות תחילת תרגיל אימונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי יורק האוניברסיטה חיה טיפול הוועדה. עם ההגעה במתקן בעל חיים באוניברסיטת יורק, ניתנו כל העכברושים מינימום של חמישה ימים כדי להתרגל לסביבה שלהם לפני הליך כירורגי, עם מזון המסופק ad libitum. למרות פרוטוקול זה הוחל בעבר ל-17,15,22אחרים מינים, הנייר הנוכחי מתבסס על עבודתה החלוצית של Pette ועמיתיו23 , מתמקד המודל עכברוש, במיוחד.

1. הכנת יחידת פעילות כויץ כרונית

  1. בעזרת וולטמטר, בדוק את הפוטנציאל של סוללות ליתיום מטבע.
    הערה: הפוטנציאל של כל סוללה צריך להיות 3.0 ± 0.10 V.
  2. להוסיף 2-3 סוללות לתוך החריץ של היחידה כך הפוטנציאל הכולל הוא 6-9 V.
    הערה: זה תלוי שיקול הדעת של החוקרים לשקול כמה פוטנציאל (6 או 9 V) כדי לשמור על במהלך ההליך כולו נסיוני. בהתאם תכנון המחקר, את עוצמת הגירוי הרצוי, ניתן להשתמש בסוללות או 2 או 3.
  3. ודא כי היחידה פועלת כהלכה באמצעות מחוון הדופק, על ידי חשיפת את יחידת דופק 1 הנפלטת מנורה אינפרא-אדום נייד.

2. ניתוח של פעילות כויץ כרונית

הערה: לעקר כל כלי ניתוח לפני הליך כירורגי. הן במהלך והן מיד לאחר הניתוח, טמפרטורת הגוף של החולדות מתוחזק על ידי כרית החימום. רצוי לבצע הליך כירורגי על תלוי כירורגי. המנתח צריך ללבוש כפפות כירורגי סטרילי, כמו גם חלוק מעבדה נקייה. במקרה הצורך, מומלץ ללבוש מסיכה מכונת ההנשמה חד פעמיות.

  1. עזים ומתנגד חולדות תחת 1-3% איזופלוריין באינהלציה עם חמצן, אשר מופעל על ידי מערכת מאדה גז. אשר חיה היא הרגעה על-ידי בדיקת hindlimb הבוהן צביטה, על ידי התבוננות עומק הנשימה וקצב. החל עינית חומר סיכה על העיניים כדי למנוע יובש. החל זריקה תת עורית של Meloxicam (0.5 מ"ג/מ"ל) ב- 2 מ"ג/ק"ג.
    הערה: מומלץ גם יישום ומשולבות של שיכוך כאבים (למשל, Meloxicam בתוספת לידוקאין) כדי למזער כל כאב במהלך הניתוח ולאחריו.
  2. בעדינות לגלח את hindlimb שמאל, וכן רצועה מסביב הטורסו מהחלק האחורי של הצוואר, בסביבות מאחור את forelimbs, על פני בית החזה הקדמי. נגב בעדינות את אזורי מגולח עם יוד, אתיל אלכוהול לחיטוי.
  3. עם החיה שוכבת על הבטן שלו, עושים חתך קטן (~0.5 ס מ) בצד האחורי של הצוואר במרכז האזור המגולח (האזור מוחשי בין השכמות) באמצעות אזמל (להב מספר 10).
  4. אתר של שיתוק נפוצות.
    1. רול חיה על הצד השמאלי שלו ולעשות ~ 2-3 ס מזמן חתך בעור של hindlimb השמאלי. מקד את האזור החתך סביב קבוצות שריר הירך זה landmarked בין את גומת חן של הברך משותפת מאחור קרוב המקור של הזנב.
      הערה: יש להיזהר לא לזהם את אזור החתך הראשון בעת שינוי המיקום של הגוף.
    2. באמצעות שקצהו בלאנט מעוקל מספריים כירורגיים, לנתח את האזור תת עורית נרחב ~3.5 - 4 ס מ, להפריד את העור בין השריר שמתחת כדי להפוך כיס בין השריר שמתחת לעור שנפתחו. פתח את העור מן הרקמה הבסיסית סביב כל ההיקף של החתך (~1.5 ס מ2).
    3. עושים חתך קטן (פחות מ 0.5 ס מ) על השריר הדו-ראשי עם מספריים כירורגיים, המבטיח כי קצות המספריים הם כורתים ישירות דרך השריר.
    4. בעדינות לפתוח את האזור לחתוך עד את קבוצות השרירים הפנימיים, של שיתוק נפוצות גלויים (העומק של רקמות שריר החיצוני (קרי, הדו-ראשי) הוא סביב ~0.5 ס מ). באמצעות מלקחיים, בעדינות מגע/קמצוץ העצב גלוי ולצפות תגובות של קבוצות שרירים היעד (למשל, TA שריר) לבין האצבעות (dorsiflexion גלוי) לאשר שיתוק נפוץ הוא מבודד.
      הערה: שלב זה צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע חיתוך או פגיעה העצב.
    5. לתקן את החלון על-ידי משיכתו פתוח עם רטרקטורים מתכת כזה גודל החלון הוא ~1.5 ס מ2 עם שיתוק משקרת במרכז החלון. השתמש קטן ווים ממתכת מחובר הרצועות ו/או גומיות זה הן הידק המשטח (או ניתוח הלוח) (איור 2 א).
  5. לצרף את החוט בשני הצדדים של העצב.
    1. להכין ~ 50-60 ס מ טפלון (PTFE)-מצופה חוט מפלדת בסדר ומקפלים אותו לשניים.
      הערה: זה עשוי להיות שימושי לחשוף חוט מצופה PTFA תחת אור UV לפני הניתוח.
    2. לחבר את החלק מקופל של החוט לתוך הסדק של מוט נירוסטה 30 ס מ באורך. עוברים את המוט, יחד עם הכבל, subcutaneously מכיס פתח hindlimb לכיוון האזור חתך קטן מאחורי הצוואר, תבנית בצורת האות L במעלה הרגל ולאורך במרכז הגב.
    3. למצוא את שני קצות החוט hindlimb. חוטי את היות כל החוטים בידודי PTFE. באמצעות אזמל, בזהירות להסיר את קצות החוט ~1.5 ס מ. אם החוטים הופכות בלויים, לחתוך אותם, להתפשט מחדש. לעטוף את קצות חוט הפשיטו סביב מחט 21-G קהות (5 פעמים), ביצוע סליל. ברגע הגלילים נעשים כראוי, לשחרר את המחט מהם.
    4. שימוש בגודל 6-0 משי כירורגי, לאבטח כל הגלילים משני צדי נפוצות שיתוק (איור 2 א).
      1. קשר בסופו של דבר סליל, האצבעות, בצד שמאל של העצב. ודא הגליל ב 1.5-2.5 מ מ העצב.
      2. כדי לאבטח את הגליל, החל שניים או שלושה תפרים נוספים לאורך הגליל.
      3. חזור על שלבים אלה בצד ימין של העצב.
    5. החל 2-3 טיפות אנטיביוטיות פתרון (אמפיצילין בתוך תמיסת מלח; 132 מ"ג/מ"ל) ולאחר מכן בקפידה תפר את החלון (קרי, השריר הדו-ראשי רקמות) בעזרת חוט משי גודל 5-0.
  6. ברפיון הרוח רפיון יתר של תיל (לגבי הקוטר של האצבע) ולדחוף לתוך הכיס תת עורית מעל החתך sutured של השריר הדו-ראשי (כ מעל המותן).
  7. חלות 2-3 טיפות אנטיביוטיות פתרון שוב (אמפיצילין בתוך תמיסת מלח; 132 מ"ג/מ"ל). לסגור את העור שנפתחו על ידי הידוק.
  8. חבר את החוטים (יוצא באזור החתך של הצוואר) ממריץ המרכז לאמנות עכשווית.
    1. לחבר סיכה sockets עם החוטים.
      1. חותכים את לולאת חוט שיוצא החתך בחלק העליון של הצוואר כדי ליצור חוט 2 הקצוות (אלה להוביל הגלילים sutured על צדי שיתוק).
      2. באמצעות אזמל, מוריד את הקצוות של החוטים על-ידי ~0.5 ס מ. חתך את החוטים מרוטים, אם בכלל.
      3. לאט לאט לדחוף את חלקי הפשיטו החוטים לתוך החור של אדני pin, באמצעות עבודה עם מלחם, הלחמה את החוטים על אדני pin.
    2. לחלופין, בדוק את החיבור של כבלים.
      1. להתחבר הסיכות יחידה ממריץ benchtop גדולים באמצעות סרטונים אליגטור.
      2. לספק יחיד דופק של 9 V (0.1 ms, 10 Hz) כדי לאשר TA שריר חוזים עם השמאל רגל dorsiflexes.
    3. עוברים את הקצוות המחוברים תילים סיכה דרך משטח גזה סטרילית זה ~ 4 ס"מ על 4 ס"מ.
    4. להתחבר הפינים יחידת ממריץ המרכז לאמנות עכשווית.
      1. עוברים את החוטים דרך החור בבסיס של תיבת ממריץ.
        הערה: תיבת זו היא תא תוצרת בית עבור היחידה ממריץ המרכז לאמנות עכשווית והיא 3.5 ס"מ × 3.5 ס"מ × 2.5 ס מ13.
      2. הכנס את הסיכות אדני חיבור על יחידת המרכז לאמנות עכשווית. לשים בעדינות את יחידת המרכז לאמנות עכשווית אל החדר. השתמש נעץ דביק כדי לאבטח את יחידת המרכז לאמנות עכשווית בחלק התחתון של החדר.
    5. באמצעות טייפ אתלטי או הקלטת כירורגי נקבובי, לתקן את התא עם הסרט. הטורסו מגולח. סגור את החלק העליון של התא עם שלוש שכבות של מקליטה וסיום על ידי ליפוף קלטת בצדדים של תיבת ממריץ כדי לאבטח את תיבת (איור 2B).
  9. בדוק אם המרכז לאמנות עכשווית פועלת באמצעות חשיפת את יחידת דופק אחת של אור אינפרא-אדום (ספקטרום אורכי גל > 770 ננומטר) זה נפלט על ידי מנורה אינפרא-אדום נייד.
    הערה: אם המרכז לאמנות עכשווית פועלת כראוי, חוקרים יוכלו לראות ש-hindlimb השרירים (קרי, ת א) הם קבלנות בתגובה האור האינפרא-אדום.
  10. לצפות את החולדה ונטר את הטמפרטורה שלו עד זה מלא שהכרתו. בית זה בכלוב יחיד-הדייר כדי למנוע נזק מבעלי חיים אחרים, אין להשאיר כל מנהרות או אובייקטים פלסטיק בכלוב לאורך כל המחקר כדי לצמצם את הסיכון של נזק יחידת ממריץ או פציעה של החיה. לספק בקבוק מים כלול אמוקסיצילין (0.5 mg/mL).
  11. החל מנה 1 מ"ג/ק"ג של Meloxicam subcutaneously כל 24 שעות לאחר הניתוח, אשר נמשך לפחות 72 h.

3. פעילות כויץ כרונית

  1. לאחר הניתוח, אפשר לפחות 5-7 ימים להתאוששות מלאה של החתך ואזורים בתפר של שרירי השלד מסביב.
    הערה: במהלך ואחרי נוהל המרכז לאמנות עכשווית, ביסודיות לבדוק המצב של כל חיה על ידי התבוננות והתנהגותם (למשל, לאכול, לשתות, ו/או העברה). בנוסף, לקבוע בכל נפשי או תופעות לוואי על ידי בדיקת שינוי במשקל הגוף לפני ואחרי ההליך המרכז לאמנות עכשווית.
  2. ביום של גירוי המרכז לאמנות עכשווית, הפעלת המרכז לאמנות עכשווית על ידי חשיפת את יחידת ממריץ דופק אחת של אור אינפרא-אדום (טווח אורך גל > 770 ננומטר) על ידי מנורה אינפרא-אדום נייד.
  3. החל h 3 או 6 של גירוי המרכז לאמנות עכשווית 10 הרץ.
    הערה: מסגרת הזמן לגירוי זה תפקיד. התדירות של גירוי לא שונתה בניסויים אלה, שיפורים רק צנוע מאוד בהתאמת מיטוכונדריאלי נצפו על-ידי הרחבת הגירוי בין 3 ל 6 שעות ביממה, מניסיוננו. במידת האפשר, בדוק את גירוי ואת חיה כל 30-60 דקות.
  4. בעקבות תקופת המרכז לאמנות עכשווית הרצוי, כבה את יחידת המרכז לאמנות עכשווית בעזרת חשיפה אור אינפרא-אדום (אותו הנוהל כמו הפעלת היחידה).
  5. אם החלת ימים מרובים, חזור על השלב 3.2. ל 3.4.
  6. לקבוע את העיתוי של אוסף רקמה. לדוגמה, לאסוף את רקמות 24 שעות לאחר תחילת הקרב הסופי של המרכז לאמנות עכשווית (קרי, 18 h לאחר גירוי המרכז לאמנות עכשווית האחרון של 6-אייץ '), אשר מבוצע תחת הרדמה כפי שנעשה במהלך ההליך הכירורגי המרכז לאמנות עכשווית. מיד לאחר איסוף כל רקמות, המתת חסד בבעלי חיים על ידי excising בלב בעוד החיה הוא עדיין תחת הרדמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו הראו כי פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) הוא כלי יעיל לזירוז עיבודים מיטוכונדריאלי חיובית תוך שרירי השלד. חולדות נתון 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (6 שעות לכל יום) להציג להן מיטוכונדריאלי משופרת בשריר מגורה לעומת hindlimb unstimulated contralateral (בקרה). עלייה זו להן מיטוכונדריאלי שציין ביטוי חלבון מוגברת של PGC-1α (איור 3 א), נחשב את הרגולטור הראשי של להן מיטוכונדריאלי, יחד עם הגבהים של חלבונים מיטוכונדריאלי מפתח אחרים קוקס-קוקס-IV, ואני אשר הם מרכיבים חשובים של רשת התחבורה אלקטרון. יתר על כן, ציטוכרום c אוקסידאז (קוקס) פעילות אנזים, מחוון שימושי של תוכן מיטוכונדריאלי, עלה כ-30% בעקבות 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (איור 3B). בנוסף, אנחנו להעריך שינויים בתפקוד מיטוכונדריאלי באמצעות סיבי השריר permeabilized כדי למדוד את יכולת הנשימה מיטוכונדריאלי ומצא כי המרכז לאמנות עכשווית, גרמו לעלייה מרבית בדרכי הנשימה (קרי, מצב 3) קיבולת של שריר נתון 7 ימים של גירוי יחסי שליטה בשרירים (איור 3C). יתר על כן, שתי האוכלוסיות מיטוכונדריאלי, subsarcolemmal (הה) ו intermyofibrillar (קרן המטבע), גדל בעקבות 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (איור 4A ו- B), ומצאנו שברים קרן המטבע של שריר נתון 7 ימים של חוסר פעילות. בצבע אדום שצבע יותר מאשר אלה נגזר לשריר שליטה (קון) באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ככל הנראה המציינת רמות גבוהות יותר של מיוגלובין, heme ורכיבים אחרים הקשורים לחמצן (איור 4C).

עיבודים autophagy, מערכות lysosomal יכול גם להיגרם על ידי המרכז לאמנות עכשווית. בפרט, הבחנו בעליה בשפע חלבונים גורם שעתוק EB (TFEB; איור 5A), הרגולטורים העיקריים של lysosomal להן, על ידי המרכז לאמנות עכשווית בכלל נקודות זמן (קרי, 1, 3 ו- 7 ימים), כמו גם סמנים lysosomal אחרים כגון חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (LAMP1; איור 5B). מעניין, המחקר שלנו מראה כי שינויים autophagy, mitophagy, lysosomal מערכות להתרחש לפני מיטוכונדריאלי להן.

Figure 1
איור 1. תרשים סכימטי מראה את המרכיבים העיקריים ממריץ המרכז לאמנות עכשווית נייד ההוראה איור זה שונה מטקהאשי. et al. 13. אינפרא-אדום, אינפרא-אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. אלקטרודה, ממריץ ההשתלה. (א) חלון עבור חיבור חוטים משני צידי שיתוק נפוצות. (B) תמונה מופתית על הפגנת הרכבה של המרכז לאמנות עכשווית יחידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. PGC-1alpha, נשימה מיטוכונדריאלי, פעילות אנזים עם המרכז לאמנות עכשווית- (א) המרכז לאמנות עכשווית גורם עיבודים מיטוכונדריאלי בשרירי השלד, כפי שמוצג על ידי העלאות רמות החלבון של PGC-1α. תמונת הנציגה חשופה מוצג יחד עם ß-אקטין פקד הטעינה. קון מתייחס שליטה, קרי, hindlimb contralateral לא נתון את המרכז לאמנות עכשווית, קיפול משנות נתונים הושג על-ידי נרמול תוצאות ביחס קון-1 יום. (B) קוקס פעילות ו- (ג) permeabilized שרירים הנשימות היו גם מוגברת 7 ימים הבאים של המרכז לאמנות עכשווית. כל הנתונים מוצג זאת אומרת ± SEM (N = 6-8). †P < 0.05, אפקט אינטראקציה בין המרכז לאמנות עכשווית לזמן; §P < 0.05, ההשפעה העיקרית של המרכז לאמנות עכשווית; P < 0.05, הבדל משמעותי לעומת שליטה-1 יום. איור 3 א ו- 3B שונו מ קים, הוד19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. עדות להן מיטוכונדריאלי בשריר עם המרכז לאמנות עכשווית- (A ו- B) אלקטרון מיקרוסקופיות תמונות מצביעים על אמצעי אחסון מוגדל של subsarcolemmal (הה) והן המיטוכונדריה (קרן המטבע) intermyofibrillar בשרירי השלד של חולדות חשופים המרכז לאמנות עכשווית ב 7 ימים. תמונה זו שונתה מ Ljubicic et al. 21, וברים סולם עולה 1 מיקרומטר. א (ג) השוואה של שריר fractionations מיטוכונדריאלי בין שליטה (קון) ושרירים (המרכז לאמנות עכשווית) מגורה לאחר 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. מערכת lysosomal היא upregulated על ידי 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית- זה מסומן על ידי עלייה חלבון abundances TFEB () והן LAMP1 (B) . התוצאות מוצגות כפי מקפלים שינויים על ידי נרמול נתונים ביחס קון-1 יום. (ג) חשופה נציג תמונות מוצגות, GAPDH הוא פקד הטעינה. §P < 0.05, ההשפעה העיקרית של המרכז לאמנות עכשווית. כל הנתונים מוצג זאת אומרת ± SEM (N = 8); ¶P < 0.05, ההשפעה העיקרית של זמן; P < 0.05, הבדל משמעותי לעומת שליטה (קון)-1 יום. איור זה השתנה בין הוד וקים19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדגם פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) של פעילות גופנית, דרך השריר בתדר נמוך גירוי ויוו, הוא מודל מצויין ללמוד שריר עיבודים פנוטיפי לממש24,13,25 , 26. כפי שמוצג מחקרים קודמים20,27, המרכז לאמנות עכשווית הוא כלי יעיל שבו חוקרים יכולים לשלוט תדרים (קרי, זמן וימים) ואמצעי הדרכה ולחקור שונים הביוכימי ו/או מולקולרית אירועים במהלך התקפי חוזרים ונשנים של חוסר פעילות. אחת התכונות הטובות ביותר של מודל זה היא כי שרירי hindlimb contralateral משמשים בקרה פנימית, אשר מסייע כדי למזער את השתנות בין בעלי חיים. יתר על כן, שלנו ניסויים רבים יותר מעשור הראו כי היחידה המרכז לאמנות עכשווית חיצוני אינו מגביל של חיה דפוסי התנהגות רגילה (למשל, נדידה, אכילה ושינה), מאפשר שימוש ניסיוני טיפולים נוספים כאלה כמו זריקות של סמים. לכן, חוקרים ניתן להחיל את פרוטוקול המרכז לאמנות עכשווית במהלך לימודיהם הכשרה עם שינויים ניסיוני משלהם.

פרוטוקול זה המרכז לאמנות עכשווית יש מספר שלבים קריטיים, למרות כל השלבים דורשים ריכוז ברמה גבוהה בשל אופי של ניתוח הישרדות. זה חשוב במיוחד לחבר חוטים במיקומים עקביים, מומלץ לקיים חוקר מיומן אותו לבצע את הניתוח כדי לשמור על עקביות בדו landmarking באותו המקום של העצב, תפירת חוטים המרחק אותו עצב, וכו '. בנוסף, יש צורך לאשר את האבטחה של הדבק לפני ובמהלך היישום של המרכז לאמנות עכשווית, כי הקלטת השתחררו או בלוי עשוי להוביל לכשל של ההליך.

זה המודל המרכז לאמנות עכשווית יש כמה מגבלות קלות. מאז יחידת גירוי המרכז לאמנות עכשווית הוא קבוע על ידי מקליטה, כמה חיות התערוכה גירויים בעור קטין סביב האזור הקלטה. זה יכול להשתפר במחקרים עתידיים באמצעות ג'קט לביש שתחליף את התא המרכז לאמנות עכשווית ללא מדביק, עם זאת, לא היה לנו הצלחה עם מעילים כאלה. לחלופין, ממריץ יכול להיות קטנטנים בחלל בקרום הבטן כדי למנוע את שהשתמש הליך28, למרות ההליך זה פולשניים יותר. בנוסף, היחידה המתוארת ממריץ חיצוני נועד להיות נשלט על ידי חשיפת אור אינפרא-אדום. עם זאת, אם יחידה מצליח להגיב אור אינפרא-אדום, זה עשוי להצביע על שינויים עמידות או רגישות של היחידה לאחר שימוש ותיק. היישום של שבב בסופו של דבר עשוי להימנע משימוש של האור האינפרא אדום, יאפשר כל הפרמטרים המרכז לאמנות עכשווית להיות מתוכנת, מאוחסן, הפעלת המרכז לאמנות עכשווית להיות מיושם באופן מבוקר ומדויק יותר. כל העיצובים המחקר לשקול גם את השימוש של ניתוח דמה האיבר contralateral כדי לא לכלול את כל האפשריות הנובעות הניתוחית עצמה.

כדאי להמשיך ולחקור כיצד המרכז לאמנות עכשווית יכול להסדיר שריר מסה ו בעקבות תקופות של השריר שהעידה, או בהקשר של מחלות שרירים אחרות. כפי שמוצג מחקרים קליניים האחרונה29,30, ניתן להחיל המרכז לאמנות עכשווית גם לבחון את יעילותה על מנגנוני איתות anabolic באוכלוסיות הזדקנות. לסיכום, אנו ממליצים חוקרים כדי לנצל באמצעות פרוטוקול זה המרכז לאמנות עכשווית בלימודיהם, לפיה הם יכולים לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית השונים שבבסיס שרירי השלד עיבודים פנוטיפי לממש כרונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

. אנחנו אסירת תודה ליאם Tyron על קריאתו מומחה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ד א הוד. ד א הוד הוא גם האוחז כיסא מחקר קנדה בפיזיולוגיה של התא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley Rat Charles River Strain 400
Chronic contractile activity unit Home-made n/a
CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) Home-made n/a Box should be made of opaque material or covered in an opague tape
Coin lithium ion batteries (3V) Panasonic CR2016
Medwire Leico Industries 316SS7/44T
Solder pin (socket) Digi-Key ED6218-ND
Zonas porous tape Johnson & Johnson 5104
Suture silk (Size 5) Ethicon 640G
Suture silk (Size 6) Ethicon 706G
Curved blunt scissor (11.5 cm Length) F.S.T. 14075-11
Curved blunt scissor (15 cm Length) F.S.T. 14111-15
Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) Lawton 06-0230
Scalpel Feather 3
Curved forceps F.S.T. 11052-10
Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) Home-made n/a Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin
Clip applying forceps KLS Martin 20-916-12
Staples (clips) Bbraun BN507R
Metal hooks/retractor Home-made n/a
Povidone-iodine (500 mL) Rougier #NPN00172944
Ampicillin sodium Novopharm #DIN00872644
Metacam Boehringer #DIN02240463
Digital multimeter (voltmeter) Soar Corporation ME-501
LED digital stroboscope Lutron Electronic Enterprise DT-2269

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
  2. Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
  3. Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
  4. Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
  5. Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
  6. Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
  7. Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
  8. Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
  9. Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
  10. Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
  11. Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
  12. Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
  13. Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
  14. Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
  15. Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
  16. Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
  17. Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).
  18. Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
  19. Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
  20. Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
  21. Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
  22. Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
  23. Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
  24. Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
  25. Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
  26. Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
  27. Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).
  28. Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
  29. Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).
  30. Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 131 פעילות כויץ כרונית שרירי השלד תרגיל סיבולת עיבודים שריר הכשרה עיבודים להן מיטוכונדריאלי
יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y., Memme, J. M., Hood, D. A.… More

Kim, Y., Memme, J. M., Hood, D. A. Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations. J. Vis. Exp. (131), e56827, doi:10.3791/56827 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter