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Developmental Biology

सिकुड़ा गतिविधि-प्रेरित चूहे कंकाल मांसपेशी Phenotypic रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए पुरानी उत्तेजना के आवेदन

Published: January 25, 2018 doi: 10.3791/56827

Summary

इस प्रोटोकॉल व्यायाम के जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि मॉडल का उपयोग करने के लिए उत्तेजना प्रेरित-चूहे hindlimb में कंकाल की मांसपेशी रूपांतरों का पालन वर्णन करता है ।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी एक उच्च अनुकूलनीय ऊतक है, के रूप में अपने जैव रासायनिक और शारीरिक गुण बहुत पुरानी व्यायाम के जवाब में बदल रहे हैं । अंतर्निहित तंत्र है कि विभिन्न मांसपेशी रूपांतरों के बारे में लाने की जांच करने के लिए, ट्रेडमिल के रूप में व्यायाम प्रोटोकॉल की एक संख्या, पहिया चल रहा है, और तैराकी व्यायाम पशु अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इन व्यायाम मॉडल मांसपेशियों के रूपांतरों को प्राप्त करने के लिए समय की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है, जो भी विनोदी या स्नायविक कारकों द्वारा विनियमित किया जा सकता है, इस प्रकार मांसपेशियों विशेष संकुचन प्रेरित रूपांतरों का अध्ययन करने में अपने आवेदन सीमित. अप्रत्यक्ष कम आवृत्ति उत्तेजना (10 हर्ट्ज) क्रोनिक सिकुड़ा गतिविधि प्रेरित करने के लिए (सीसीए) व्यायाम प्रशिक्षण के लिए एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह सफलतापूर्वक 7 दिनों के भीतर मांसपेशी mitochondrial रूपांतरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, प्रणालीगत कारकों से स्वतंत्र. यह कागज शल्य चिकित्सा के लिए चूहों के कंकाल की मांसपेशी, भविष्य के अध्ययन में बड़े पैमाने पर आवेदन के लिए सीसीए के उपचार लागू करने के लिए आवश्यक तकनीक का ब्यौरा ।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी अपनी ऊर्जा और शारीरिक संरचना में परिवर्तन के माध्यम से प्रशिक्षण व्यायाम करने के लिए अनुकूलन कर सकते हैं1। प्रमुख परिवर्तन के बारे में धीरज प्रशिक्षण के द्वारा लाया में से एक है mitochondrial उत्पत्ति, जो mitochondrial घटकों की अभिव्यक्ति में वृद्धि द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (जैसे, cytochrome सी oxidase [कॉक्स] उपइकाइयों), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की अभिव्यक्ति transcriptional coactivator, PGC-1α2. अध्ययनों की बढ़ती संख्या का संकेत दिया है कि कई अंय कारकों, mitochondrial कारोबार और mitophagy सहित, मांसपेशियों के रूपांतरों के लिए भी महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, तंत्र जिसके द्वारा तीव्र या जीर्ण व्यायाम कंकाल की मांसपेशी में इन प्रक्रियाओं को विनियमित अभी भी अस्पष्ट हैं ।

व्यायाम प्रेरित मांसपेशी रूपांतरों को विनियमित करने वाले रास्ते चित्रित करने के लिए, विभिन्न व्यायाम मॉडल सामांयतः ट्रेडमिल सहित, पहिया चल रहा है, और तैराकी व्यायाम कुतर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इन प्रोटोकॉल में कुछ सीमाएं है ~ 4-12 सप्ताह इन phenotypicपरिवर्तन3, 4, 5 का पालन करने के लिए आवश्यक हैं । एक वैकल्पिक प्रयोगात्मक विधि के रूप में, कम आवृत्ति उत्तेजना प्रेरित क्रोनिक सिकुड़ा गतिविधि (सीसीए) प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है, के रूप में यह एक काफी कम अवधि में मांसपेशियों रूपांतरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (यानी, 7 दिनों तक) और इसके प्रभाव के लिए प्रकट के लिए तुलनीय हो, या अंय व्यायाम प्रोटोकॉल से भी अधिक है । इसके अलावा, हार्मोन6, तापमान7की उपस्थिति, और स्नायविक प्रभाव8 यह मुश्किल पुरानी व्यायाम करने के लिए मांसपेशियों को विशेष प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, थायराइड हार्मोन9,10 और इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF)-111 के लिए मध्यस्थता प्रशिक्षण प्रेरित मांसपेशी रूपांतरों, जो भी कंकाल में अन्य संकेतन रास्ते को विनियमित कर सकते हैं की पहचान की गई है मांसपेशियों. विशेष रूप से, सीसीए प्रेरित प्रभाव न्यूनतम प्रणालीगत कारकों द्वारा विनियमित रहे हैं, सिकुड़ा गतिविधि के लिए कंकाल की मांसपेशी की प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया पर रखा जा करने के लिए ध्यान केंद्रित करने की अनुमति.

सीसीए के लिए बाह्य इकाई पहले टायलर और राइट12द्वारा शुरू की गई थी, और12संशोधनों के साथ विकसित किया गया है । संक्षेप में, इकाई के तीन मुख्य भागों से बना है: एक अवरक्त डिटेक्टर कि चालू किया जा सकता है और बंद अवरक्त प्रकाश, एक पल्स जनरेटर के लिए जोखिम से, और एक पल्स संकेतक (चित्रा 1) । उत्तेजक यूनिट के विस्तृत सर्किट डिजाइन पहले13बताया गया है । सीसीए की विस्तृत और विशिष्ट सुविधाओं की समीक्षा के लेख14,15,16,17की संख्या में अधिक गहराई में पाया जा सकता है । संक्षेप में, उत्तेजना प्रोटोकॉल को कम आवृत्ति (यानी, 10 हर्ट्ज) पर आम peroneal तंत्रिका को सक्रिय करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और innervated मांसपेशियों (tibialis पूर्वकाल [टा] और प्रसारक digitorum लंग्स [EDL] मांसपेशी) एक के लिए अनुबंध करने के लिए मजबूर कर रहे हैं समय की पूर्व निर्धारित लंबाई (जैसे, 3-6 ज) । समय के साथ, यह aforementioned की मांसपेशियों को एक अधिक एरोबिक phenotype में परिवर्तन, दोनों केशिका घनत्व18 और mitochondrial सामग्री19,20,21में वृद्धि द्वारा प्रदर्शन किया । इस प्रकार, इस विधि एक सिद्ध करने के लिए चूहों के कंकाल की मांसपेशी में प्रमुख धीरज प्रशिक्षण रूपांतरों के कुछ नकल मॉडल है ।

इस कागज इलेक्ट्रोड आरोपण सर्जरी की एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है ताकि शोधकर्ताओं को उनके व्यायाम अध्ययन में इस मॉडल को लागू कर सकते हैं सीसीए प्रेरित । सीसीए मांसपेशी रूपांतरों के समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है, इस प्रकार व्यायाम प्रशिक्षण की शुरुआत के बाद दोनों जल्दी और बाद में समय अंक में विभिंन आणविक और संकेतन घटनाओं की जांच के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करते हैं ।

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Protocol

सभी जानवरों से संबंधित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और ंयूयार्क विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । यॉर्क विश्वविद्यालय में पशु सुविधा पर आगमन पर, सभी चूहों को acclimatize करने के लिए पांच दिनों की एक ंयूनतम दिया गया था अपने पर्यावरण शल्य प्रक्रिया से पहले, भोजन के साथ विज्ञापन libitumप्रदान की । हालांकि इस प्रोटोकॉल पहले अंय प्रजातियों के लिए लागू किया गया है15,17,22, वर्तमान कागज पेटते और सहकर्मियों23 के अग्रणी काम पर बनाता है और विशेष रूप से चूहे मॉडल पर केंद्रित है ।

1. जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि इकाई की तैयारी

  1. एक वाल्टमीटर का प्रयोग, सिक्का लिथियम बैटरी की क्षमता की जांच करें ।
    नोट: प्रत्येक बैटरी की क्षमता ३.० ± ०.१० V होना चाहिए ।
  2. इकाई के स्लॉट में दो या तीन बैटरियां डालें जिससे कुल संभावित 6-9 वी.
    नोट: यह शोधकर्ताओं के विवेक पर विचार करने के लिए कितना क्षमता (6 या 9 वी) को पूरा प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान बनाए रखने के लिए है । अध्ययन डिजाइन पर निर्भर करता है, और उत्तेजना की वांछित तीव्रता, या तो 2 या 3 बैटरी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. इकाई एक पोर्टेबल अवरक्त स्ट्रोब प्रकाश द्वारा उत्सर्जित 1 पल्स करने के लिए इकाई को उजागर करके, पल्स संकेतक के माध्यम से ठीक से काम कर रहा है कि सत्यापित करें.

2. जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि की शल्य प्रक्रिया

नोट: सर्जिकल प्रक्रिया से पहले सभी शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल । दोनों के दौरान और तुरंत सर्जरी के बाद, चूहों के शरीर का तापमान एक हीटिंग पैड द्वारा बनाए रखा है । यह एक शल्य कपड़ा पर शल्य प्रक्रिया प्रदर्शन वांछनीय है । सर्जन बाँझ सर्जिकल दस्ताने के रूप में अच्छी तरह से एक साफ प्रयोगशाला कोट पहनना चाहिए । यदि आवश्यक हो, यह एक डिस्पोजेबल श्वसन मुखौटा पहनने के लिए सिफारिश की है ।

  1. ऑक्सीजन के साथ 1-3% isoflurane साँस लेना के तहत चूहों Anesthetize, जो एक गैस vaporizer प्रणाली द्वारा संचालित है. की पुष्टि करें पशु पूरी तरह से hindlimb पैर की अंगुली चुटकी जांच द्वारा और श्वसन गहराई और दर देख द्वारा बेहोश है । सूखापन से बचने के लिए आंखों पर नेत्र स्नेहक लागू करें । Meloxicam (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन 2 मिलीग्राम/kg पर लागू करें ।
    नोट: यह भी के दौरान और सर्जरी के बाद किसी भी दर्द को कम करने के लिए analgesia (जैसे, Meloxicam प्लस lidocaine) के एक बहु मॉडल आवेदन करने के लिए सिफारिश की है.
  2. धीरे बाएं hindlimb दाढ़ी, के रूप में अच्छी तरह से गर्दन के पीछे से धड़ के आसपास एक पट्टी के रूप में, चारों ओर forelimbs और पूर्वकाल छाती के पार । धीरे आयोडीन और एथिल शराब से संक्रमित करने के लिए मुंडा क्षेत्रों पोंछ ।
  3. पशु अपने पेट पर बिछाने के साथ, एक छोटा सा चीरा (०.५ सेमी) मुंडा क्षेत्र के केंद्र में गर्दन की पीठ पर (कंधे ब्लेड के बीच स्पष्ट क्षेत्र) एक स्केलपेल (No. 10 ब्लेड) का उपयोग कर ।
  4. आम peroneal तंत्रिका का पता लगाएँ ।
    1. अपनी दाईं ओर रोल पशु और एक ~ 2-3 सेमी-बाएं hindlimb की त्वचा में लंबे समय तक काट कर । ऊपरी जांघ मांसपेशी समूहों है कि घुटने संयुक्त की डिंपल और वापस पूंछ की उत्पत्ति के करीब के बीच मील का पत्थर है के आसपास चीरा क्षेत्र लक्ष्य ।
      नोट: जब शरीर की स्थिति को बदलने के पहले चीरा क्षेत्र दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    2. कुंद-ढोने वाली घुमावदार शल्य कैंची का प्रयोग, टुकड़े चमड़े के नीचे क्षेत्र व्यापक रूप से ~ ३.५-4 सेमी, अंतर्निहित मांसपेशी से त्वचा को अलग करने के क्रम में खोला त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशी के बीच एक जेब बनाने के लिए । चीरा की पूरी परिधि के चारों ओर अंतर्निहित ऊतक से त्वचा खोलें (~ १.५ cm2) ।
    3. एक छोटा सा चीरा (०.५ सेमी से कम) सर्जिकल कैंची के साथ मछलियां femoris मांसपेशी पर, सुनिश्चित करना है कि कैंची के सुझावों सीधे मांसपेशी के माध्यम से नीचे काट रहे हैं ।
    4. धीरे आंतरिक मांसपेशी समूहों और आम peroneal तंत्रिका दिखाई (बाहरी मांसपेशी ऊतकों की गहराई (यानी, मछलियां femoris) ~ ०.५ सेमी के आसपास है जब तक कटौती क्षेत्र खोलें) । संदंश का प्रयोग, धीरे से स्पर्श करें/दिखाई तंत्रिका चुटकी और लक्ष्य मांसपेशी समूहों (जैसे, टा मांसपेशी) और पैर की उंगलियों (दृश्य dorsiflexion) के प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए कि आम peroneal तंत्रिका अलग है पुष्टि करने के लिए ।
      नोट: यह कदम अत्यधिक सावधानी के साथ काटने या तंत्रिका को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए किया जाना चाहिए ।
    5. खिड़की के आकार की खिड़की के केंद्र में झूठ बोल रही है peroneal तंत्रिका के साथ ~ १.५ cm2 है कि इस तरह के धातु reट्रॅक्टर के साथ खुला खींच कर विंडो को ठीक करें । छोटे धातु पट्टियों और/या रबर बैंड है कि मेज की सतह (या सर्जरी बोर्ड) (चित्रा 2a) के लिए नीचे बांध रहे है के लिए संलग्न हुक का प्रयोग करें ।
  5. तंत्रिका के दोनों किनारों को तार देते हैं ।
    1. तैयार ~ ५०-६० सेमी polytetrafluoroethylene (PTFE) के-लेपित ठीक स्टेनलेस स्टील वायर और यह आधे में गुना ।
      नोट: यह सर्जरी से पहले यूवी प्रकाश के तहत PTFA लेपित तार बेनकाब करने के लिए सहायक हो सकता है ।
    2. तार के तह भाग एक 30 सेमी लंबे स्टेनलेस स्टील रॉड के भट्ठा में हुक । रॉड पास, तार के साथ, गर्दन के पीछे छोटे चीरा क्षेत्र की ओर hindlimb की खुली जेब से चमड़े के नीचे, एक एल में पैर ऊपर पैटर्न और पीठ के बीच केंद्र के साथ... ।
    3. hindlimb पर तार के दो सिरों का पता लगाएं । तारों पट्टी के बाद से सभी तारों PTFE-अछूता है । एक स्केलपेल का प्रयोग, ध्यान से तार के सिरों पट्टी ~ १.५ cm । यदि तारों से मैदान बन जाए तो उन्हें काट कर फिर से पट्टी कर दें । लपेटा तार एक कुंद 21-जी सुई (5 बार), एक कुंडल बनाने के आसपास समाप्त होता है । एक बार कुंडल ठीक से बना रहे हैं, उन से सुई जारी.
    4. एक आकार 6-0 सर्जिकल सिल्क का उपयोग करना, आम peroneal तंत्रिका के दोनों ओर कुंडलियों में से प्रत्येक को सुरक्षित (चित्र 2a) ।
      1. कुंडल के बहुत अंत में एक गांठ बनाओ, और यह तंत्रिका के बाएं हाथ की ओर सीवन । यह सुनिश्चित करें कि कुंडल तंत्रिका से १.५-२.५ मिमी पर है ।
      2. कुंडल सुरक्षित करने के लिए, दो या तीन कुंडल के साथ अतिरिक्त टांके लागू होते हैं ।
      3. तंत्रिका के दाहिने हाथ की ओर इन चरणों को दोहराएँ ।
    5. एंटीबायोटिक समाधान की 2-3 बूंदें लागू करें (खारा में एम्पीसिलीन; १३२ मिलीग्राम/एमएल), और फिर ध्यान से खिड़की( यानी, मछलियां femoris मांसपेशी ऊतक) आकार 5-0 रेशम का उपयोग कर सीवन ।
  6. ढीले तार की शेष सुस्त हवा (सूचकांक उंगली के व्यास के बारे में) और मछलियां femoris मांसपेशी की सिलाई चीरा ऊपर चमड़े के नीचे की जेब में धक्का (लगभग कूल्हे ऊपर) ।
  7. एंटीबायोटिक समाधान की 2-3 बूंदें फिर से लागू करें (खारा में एम्पीसिलीन; १३२ मिलीग्राम/एमएल) । स्टैपल द्वारा खोली गई त्वचा को बंद करें ।
  8. तार कनेक्ट (गर्दन के चीरा क्षेत्र से बाहर आ रहा है) सीसीए उत्तेजित करने के लिए ।
    1. तारों के साथ पिन कुर्सियां कनेक्ट ।
      1. तार पाश गर्दन के शीर्ष पर चीरा से बाहर आने के लिए 2 तार बनाने के लिए समाप्त होता है (इन नेतृत्व peroneal तंत्रिका के दोनों ओर टांके coils के लिए) ।
      2. एक स्केलपेल का उपयोग करना, तारों के सिरों को बंद पट्टी द्वारा ~ ०.५ cm. किसी भी, अगर काट तार कट ।
      3. धीरे पिन कुर्सियां के छेद में तारों के छीन भागों धक्का, और एक टांका लोहे का उपयोग कर, पिन कुर्सियां पर तारों मिलाप.
    2. वैकल्पिक, तारों के कनेक्शन की जांच करें ।
      1. मगरमच्छ क्लिप्स के माध्यम से एक बड़ी benchtop उत्तेजक इकाई को पिन कनेक्ट ।
      2. टीए मांसपेशी ठेके और बाएं पैर dorsiflexes की पुष्टि करने के लिए 9 वी (०.१ ms, 10 हर्ट्ज) की एक एकल पल्स उद्धार ।
    3. पास पिन जुड़े-तार बाँझ धुंध पैड कि ~ 4 सेमी x 4 सेमी के माध्यम से समाप्त होता है ।
    4. सीसीए उत्तेजितकर्ता इकाई के लिए पिन कनेक्ट ।
      1. उत्तेजितकर्ता बॉक्स के आधार में छेद के माध्यम से तारों को पारित.
        नोट: इस बॉक्स में सीसीए उत्तेजितकर्ता इकाई के लिए एक घर बनाया चैंबर है और ३.५ cm × ३.५ cm × २.५ cm13है ।
      2. पिन कनेक्शन सॉकेट में सीसीए इकाई पर सम्मिलित करें । धीरे चैंबर में सीसीए यूनिट डाल दिया । एक चिपचिपा हमले का उपयोग करने के लिए चैंबर के नीचे स्थित सीसीए यूनिट सुरक्षित ।
    5. एक पुष्ट टेप या छिद्रित शल्य टेप का उपयोग कर, मुंडा धड़ के आसपास टेप के साथ चैंबर को ठीक. टेप की तीन परतों के साथ चैंबर के ऊपर बंद करें और उत्तेजित बॉक्स के पक्ष के आसपास एक टेप लपेटकर बॉक्स (चित्रा बी) सुरक्षित करने के लिए समाप्त करें ।
  9. जांच करें यदि सीसीए अवरक्त प्रकाश की एक पल्स (तरंग दैर्ध्य स्पेक्ट्रम > 770 एनएम) है कि एक पोर्टेबल अवरक्त स्ट्रोब प्रकाश द्वारा उत्सर्जित है इकाई को उजागर करके काम कर रहा है ।
    नोट: अगर सीसीएल ठीक से काम कर रहा है, तो शोधकर्ताओं को hindlimb की मांसपेशियां (यानी, टीए) इंफ्रारेड लाइट के जवाब में करार देते हुए देख सकेंगे.
  10. चूहे का निरीक्षण और उसके तापमान की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से चेतना आ गया है । एक एकल निवासी पिंजरे में यह घर अंय जानवरों से किसी भी नुकसान को रोकने और अध्ययन के शेष के लिए पिंजरे में किसी भी सुरंगों या प्लास्टिक की वस्तुओं को छोड़ नहीं करने के लिए उत्तेजक इकाई या पशु को चोट के नुकसान के जोखिम को कम । एक Amoxicillin-शामिल पानी की बोतल (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के साथ आपूर्ति ।
  11. लागू करें 1 मिलीग्राम/Meloxicam की खुराक हर 24 एच सर्जरी के बाद, जो कम से ७२ ज के लिए जारी है ।

3. क्रोनिक सिकुड़ा गतिविधि

  1. सर्जरी के बाद, चीरा और टांका क्षेत्रों में कंकाल की मांसपेशियों के आसपास की एक पूर्ण वसूली के लिए कम से 5-7 दिन की अनुमति दें ।
    नोट: के दौरान और सीसीए प्रक्रिया के बाद, अच्छी तरह से उनके व्यवहार देख द्वारा प्रत्येक जानवर की हालत की जांच (जैसे, खाने, पीने, और/ इसके अलावा, पहले और बाद में सीसीए प्रक्रिया के शरीर के वजन का एक परिवर्तन की जांच करके किसी भी गंभीर तनाव या प्रतिकूल प्रभाव का निर्धारण ।
  2. सीसीए उत्तेजना के दिन पर, अवरक्त प्रकाश की एक पल्स करने के लिए उत्तेजित करने वाली इकाई को उजागर करके सीसीए पर बारी (तरंग दैर्ध्य रेंज > 770 एनएम) एक पोर्टेबल अवरक्त स्ट्रोब प्रकाश द्वारा ।
  3. 10 हर्ट्ज सीसीए उत्तेजना के 3 या 6 एच लागू करें.
    ध्यान दें: उत्तेजना के लिए समय सीमा शोधकर्ता पर निर्भर है । उत्तेजना की आवृत्ति इन प्रयोगों में कभी नहीं बदला गया है और mitochondrial अनुकूलन में केवल बहुत मामूली वृद्धि को 3 से 6 ज/दिन, हमारे अनुभव में उत्तेजना विस्तार से मनाया गया है । यदि संभव हो तो, उत्तेजना और पशु हर 30-60 मिनट की जांच करें ।
  4. वांछित सीसीए अवधि के बाद, अवरक्त प्रकाश जोखिम के माध्यम से सीसीए इकाई बंद (इकाई पर निर्णायक के रूप में एक ही प्रक्रिया) ।
  5. एक से अधिक दिन लागू करते हैं, तो चरण ३.२ दोहराएँ । ३.४ के लिए ।
  6. ऊतक संग्रह के समय का निर्धारण । उदाहरण के लिए, सीसीए के अंतिम मुक्केबाज़ी की शुरुआत (यानी, 6 घंटे के अंतिम सीसीए उत्तेजना के बाद 18 ज), जो संज्ञाहरण के तहत आयोजित किया जाता है के रूप में सीसीए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान किए गए ऊतकों 24 एच इकट्ठा । सभी ऊतकों को इकट्ठा करने के तुरंत बाद, पशु euthanize जबकि जानवर अभी भी संवेदनाहारी के तहत है ।

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Representative Results

हमें पता चला है कि जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि (सीसीए) एक प्रभावी करने के लिए कंकाल की मांसपेशी के भीतर अनुकूल mitochondrial रूपांतरों प्रेरित उपकरण है । चूहों के अधीन सीसीए के 7 दिन (प्रति दिन 6 घंटे) उत्तेजित मांसपेशी में संवर्धित mitochondrial के रूप में प्रदर्शित करने के लिए उत्साहित contralateral (नियंत्रण) hindlimb की तुलना में । mitochondrial उत्पत्ति में यह वृद्धि PGC-1α (चित्रा 3) की वृद्धि की प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा संकेत दिया है, mitochondrial के मूल नियामक माना जाता है, अंय प्रमुख mitochondrial प्रोटीन कॉक्स-मैं और कॉक्स चतुर्थ के उंनयन के साथ, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के महत्वपूर्ण घटक हैं । इसके अलावा, Cytochrome सी Oxidase (कॉक्स) एंजाइम गतिविधि, mitochondrial सामग्री का एक उपयोगी संकेतक, सीसीए के 7 दिनों के बाद लगभग 30% वृद्धि हुई (चित्र 3 बी) । इसके अलावा, हम mitochondrial श्वसन क्षमता को मापने के लिए permeabilized मांसपेशी फाइबर का उपयोग mitochondrial समारोह में परिवर्तन का आकलन किया और पाया कि सीसीए अधिक श्वसन (यानी, राज्य 3) मांसपेशी की क्षमता में वृद्धि के परिणामस्वरूप मांसपेशियों को नियंत्रित करने के सापेक्ष उत्तेजना के 7 दिनों के लिए अधीन (चित्रा 3सी). इसके अलावा, दोनों mitochondrial आबादी, subsarcolemmal (एसएस) और intermyofibrillar (आईएमएफ), सीसीए के 7 दिनों के बाद वृद्धि हुई (चित्रा 4a और बी), और हम सिकुड़ा गतिविधि के 7 दिनों के अधीन मांसपेशी से आईएमएफ अंश पाया जा करने के लिए नियंत्रण (चुनाव) मांसपेशी अंतर केंद्रापसारक का उपयोग, संभवतः मायोग्लोबिन, षयवस्तु के उच्च स्तर का संकेत है, और अंय ऑक्सीजन से संबंधित तत्वों (चित्र 4c) से व्युत्पंन से प्राप्त उन से रंग में अधिक लाल ।

autophagy और लाइसोसोमल प्रणालियों के लिए रूपांतरों के बारे में भी सीसीए द्वारा लाया जा सकता है । विशेष रूप से, हम प्रतिलेखन कारक EB (TFEB के प्रोटीन बहुतायत में वृद्धि देखी है; चित्र 5), लाइसोसोमल उत्पत्ति के प्रमुख नियामक, सभी समय बिंदुओं पर सीसीए द्वारा (यानी, 1, 3, और 7 दिन), साथ ही अन्य लाइसोसोमल मार्करों जैसे लाइसोसोमल-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1; चित्रा 5B). दिलचस्प है, हमारे अध्ययन से पता चला है कि autophagy, mitophagy और लाइसोसोमल प्रणालियों के परिवर्तन mitochondrial से पहले हो उत्पत्ति ।

Figure 1
चित्र 1. एक योजनाबद्ध आरेख एक पोर्टेबल सीसीए उत्तेजक इकाई के प्रमुख घटकों से पता चलता है. यह आंकड़ा ताकाहाशी एट अल से संशोधित किया गया है । 13. ir, अवरक्त । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. इलेक्ट्रोड और उत्तेजित आरोपण । (क) आम peroneal तंत्रिका के दोनों किनारों पर तारों को जोड़ने के लिए एक खिड़की. (ख) सीसीए इकाई के एक विधानसभा के प्रदर्शन के लिए एक अनुकरणीय छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. PGC-1alpha, mitochondrial श्वसन और सीसीए के साथ एंजाइम गतिविधि. (क) सीसीए PGC-1α के प्रोटीन के स्तर में वृद्धि द्वारा दिखाया के रूप में कंकाल की मांसपेशी में mitochondrial रूपांतरों लाती है । एक प्रतिनिधि ब्लाट छवि को अ ß य-Actin के साथ लोड नियंत्रण के रूप में दिखाया जाता है । कांग्रेस को नियंत्रित करने के लिए संदर्भित करता है, अर्थात, contralateral hindlimb सीसीए के अधीन नहीं है, और गुना परिवर्तन डेटा 1 दिन में कांग्रेस के सापेक्ष परिणामों को सामान्य करने के द्वारा प्राप्त किया गया था. (ख) कॉक्स गतिविधि और (ग) permeabilized मांसपेशी संवेदनाएं भी सीसीए के 7 दिनों के बाद बढ़ीं । सभी डेटा के रूप में अर्थ ± SEM दिखाया गया है (N = 6-8) । †P < 0.05, सीसीए और समय के बीच सहभागिता प्रभाव; §P < 0.05, सीसीए का मुख्य प्रभाव; *P < 0.05, 1 दिन में महत्वपूर्ण अंतर बनाम नियंत्रण । चित्र 3और बी किम और हूड19से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. सीसीए के साथ पेशी में mitochondrial उत्पत्ति के साक्ष्य । (A और B) इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियां दोनों subsarcolemmal (एस एम) और intermyofibrillar (आईएमएफ) के बढ़े हुए खंड संकेत 7 दिनों के लिए सीसीए के लिए उजागर चूहों के कंकाल की मांसपेशी में mitochondria । इस इमेज को Ljubicic एट अलसे संशोधित किया गया है । 21, और स्केल पट् टियां 1 µm इंगित करती हैं । (ग) नियंत्रण (कांग्रेस) के बीच मांसपेशी mitochondrial अंशों की तुलना और सीसीए उत्तेजना के 7 दिनों के बाद (सीसीए) मांसपेशी उत्तेजित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. सीसीएल के 7 दिनों के लाइसोसोमल सिस्टम को विनियमित किया गया है । यह दोनों में प्रोटीन बहुतायत में वृद्धि द्वारा संकेत दिया है (एक) TFEB और (ख) LAMP1 । परिणाम 1 दिन में कांग्रेस के सापेक्ष डेटा सामान्य द्वारा गुना परिवर्तन के रूप में दिखाए जाते हैं. (ग) प्रतिनिधि दाग छवियों को दिखाया गया है और GAPDH एक लोड हो रहा है नियंत्रण है । §P < ०.०५, सीसीए का मुख्य प्रभाव । सभी डेटा के रूप में अर्थ ± SEM दिखाया गया है (N = 8); ¶ P < ०.०५, समय का मुख्य प्रभाव; *P < ०.०५, 1 दिन में महत्वपूर्ण अंतर बनाम नियंत्रण (कांग्रेस) । किम और हुड19से यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि (सीसीए) व्यायाम के मॉडल, vivo मेंकम आवृत्ति मांसपेशी उत्तेजना के माध्यम से, व्यायाम करने के लिए मांसपेशी phenotypic रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है13,24,25 , 26. जैसा कि पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है20,27, सीसीए एक प्रभावी उपकरण है जिसके द्वारा शोधकर्ताओं ने प्रशिक्षण की मात्रा और आवृत्तियों को नियंत्रित कर सकते हैं (यानी, समय और दिन) और जांच विभिन्न जैव रासायनिक और/या आणविक सिकुड़ा गतिविधि के दोहराया मुक्केबाज़ी के पाठ्यक्रम पर घटनाक्रम । इस मॉडल की सबसे अच्छी सुविधाओं में से एक है कि contralateral hindlimb की मांसपेशियों को एक आंतरिक नियंत्रण है, जो जानवरों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करता है के रूप में उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, एक दशक से अधिक हमारे कई प्रयोगों से पता चला है कि बाहरी सीसीए इकाई एक जानवर के साधारण व्यवहार पैटर्न की सीमा नहीं है (जैसे, रोमिंग, खाने, और सो), और अतिरिक्त प्रयोगात्मक उपचार के उपयोग के लिए अनुमति देता है ऐसे नशीली दवाओं के इंजेक्शन के रूप में । इस प्रकार, शोधकर्ताओं अपने प्रायोगिक संशोधनों के साथ अपने प्रशिक्षण अध्ययन में सीसीए प्रोटोकॉल लागू कर सकते हैं ।

इस सीसीए प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण कदम है, हालांकि सभी कदम एक उच्च स्तर की एकाग्रता की वजह से अस्तित्व सर्जरी की प्रकृति की मांग कर सकते हैं । यह विशेष रूप से संगत स्थानों पर तारों से कनेक्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह अत्यधिक एक ही निपुण शोधकर्ता को पत्थर तंत्रिका के एक ही स्थान में निरंतरता बनाए रखने के लिए शल्य चिकित्सा प्रदर्शन करने की सिफारिश की है, suturing तारों से एक ही दूरी तंत्रिका, आदि। इसके अलावा, यह पहले और सीसीए आवेदन के दौरान टेप की सुरक्षा की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि ढीला या बाहर पहना टेप प्रक्रिया की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

यह सीसीए मॉडल कुछ मामूली सीमाएं हैं । चूंकि सीसीए उत्तेजना इकाई टेप द्वारा तय की जाती है, कुछ जानवरों टेप क्षेत्र के आसपास माइनर त्वचा जलन का प्रदर्शन । यह एक पहनने योग्य जैकेट है कि टेप बिना सीसीए चैंबर की जगह होगी के उपयोग के माध्यम से भविष्य के अध्ययन में सुधार किया जा सकता है, तथापि, हम इस तरह के जैकेट के साथ सफलता नहीं मिली है । वैकल्पिक रूप से, उत्तेजित intraperitoneal अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित किया जा सकता है टेप प्रक्रिया से बचने के लिए28, हालांकि इस प्रक्रिया को और अधिक आक्रामक है । इसके अलावा, वर्णित बाहरी उत्तेजितकर्ता इकाई अवरक्त प्रकाश को उजागर द्वारा नियंत्रित किया जा करने के लिए बनाया गया है । हालांकि, अगर एक इकाई के लिए अवरक्त प्रकाश का जवाब विफल रहता है, यह स्थायित्व या इकाई के लंबे समय के उपयोग के बाद संवेदनशीलता में परिवर्तन का संकेत हो सकता है । एक माइक्रोचिप के कार्यांवयन अंततः अवरक्त प्रकाश के उपयोग से बचने और सभी सीसीए मापदंडों क्रमादेशित और संग्रहीत किया जा करने की अनुमति होगी, सीसीए सक्षम करने के लिए एक अधिक नियंत्रित और सही फैशन में लागू किया जाएगा । सभी अध्ययन डिजाइन भी contralateral अंग अन्तर्वासना सर्जरी के उपयोग पर विचार करना चाहिए किसी भी संभव शल्य प्रक्रिया से ही जिसके परिणामस्वरूप परिणाम बाहर ।

यह जांच जारी रखने के लिए सार्थक है कैसे सीसीए मांसपेशियों को विनियमित कर सकते है और जीर्ण मांसपेशी अप्रचार के निंनलिखित समय phenotype, या अंय मांसपेशियों की बीमारियों के संदर्भ में । के रूप में हाल ही में नैदानिक अध्ययन29,30में दिखाया गया है, सीसीए भी उंर बढ़ने की आबादी में anabolic संकेतन तंत्र पर अपनी प्रभावकारिता की जांच लागू किया जा सकता है । अंत में, हम शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने के लिए अपने अध्ययन में इस सीसीए प्रोटोकॉल का उपयोग कर का लाभ लेने के लिए, जिससे वे विभिंन सेलुलर और आणविक जीर्ण व्यायाम करने के लिए कंकाल की मांसपेशी phenotypic रूपांतरों अंतर्निहित तंत्र की जांच कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के अपने विशेषज्ञ पढ़ने के लिए लियाम Tyron के लिए आभारी हैं । यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) के लिए डी. ए. हूड से धन द्वारा समर्थित किया गया था । डी. ए. हूड भी सेल फिजियोलॉजी में कनाडा के एक शोध कुर्सी के धारक है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley Rat Charles River Strain 400
Chronic contractile activity unit Home-made n/a
CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm) Home-made n/a Box should be made of opaque material or covered in an opague tape
Coin lithium ion batteries (3V) Panasonic CR2016
Medwire Leico Industries 316SS7/44T
Solder pin (socket) Digi-Key ED6218-ND
Zonas porous tape Johnson & Johnson 5104
Suture silk (Size 5) Ethicon 640G
Suture silk (Size 6) Ethicon 706G
Curved blunt scissor (11.5 cm Length) F.S.T. 14075-11
Curved blunt scissor (15 cm Length) F.S.T. 14111-15
Delicate haemostatic forceps (16 cm Length) Lawton 06-0230
Scalpel Feather 3
Curved forceps F.S.T. 11052-10
Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter) Home-made n/a Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin
Clip applying forceps KLS Martin 20-916-12
Staples (clips) Bbraun BN507R
Metal hooks/retractor Home-made n/a
Povidone-iodine (500 mL) Rougier #NPN00172944
Ampicillin sodium Novopharm #DIN00872644
Metacam Boehringer #DIN02240463
Digital multimeter (voltmeter) Soar Corporation ME-501
LED digital stroboscope Lutron Electronic Enterprise DT-2269

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३१ जीर्ण सिकुड़ा गतिविधि कंकाल की मांसपेशी धीरज व्यायाम मांसपेशी रूपांतरों प्रशिक्षण रूपांतरों mitochondrial जैव उत्पत्ति
सिकुड़ा गतिविधि-प्रेरित चूहे कंकाल मांसपेशी Phenotypic रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए पुरानी उत्तेजना के आवेदन
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Kim, Y., Memme, J. M., Hood, D. A.More

Kim, Y., Memme, J. M., Hood, D. A. Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations. J. Vis. Exp. (131), e56827, doi:10.3791/56827 (2018).

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