Summary
Dette manuskript beskriver en metode af inducerende status epilepticus ved systemisk pilocarpin injektion og overvågning spontan tilbagevendende anfald hos levende dyr brug af en trådløs telemetri video og elektroencefalografi system. Denne protokol kan udnyttes til at studere de patofysiologiske mekanismer for kronisk epilepsi, epileptogenesis og akut anfald.
Abstract
FLE (TLE) er en fælles neurologisk lidelse i voksenalderen. For Translationel undersøgelser af kronisk epilepsi, er pilocarpin-induceret status epilepticus (SE) ofte valgt at sammenfatte spontan tilbagevendende anfald (SRS). Her præsenterer vi en protokol af SE induktion af intraperitoneal (i.p.) injektion af pilocarpin og overvågning af kronisk tilbagevendende anfald hos levende dyr brug af en trådløs telemetri video og elektroencefalografi (EEG) system. Vi viste bemærkelsesværdige adfærdsmæssige ændringer, der kræver opmærksomhed efter pilocarpin injektion og deres sammenhæng med hippocampus neuronal tab på 7 dage og 6 uger efter pilocarpin. Vi beskriver også de eksperimentelle procedurer af elektrode implantation til video og EEG registrering og analyse af hyppigheden og varigheden af kronisk tilbagevendende anfald. Endelig vil diskutere vi de mulige årsager hvorfor de forventede resultater ikke opnås i hvert enkelt tilfælde. Dette giver en grundlæggende oversigt over modellering kronisk epilepsi i mus og retningslinjer for fejlfinding. Vi mener, at denne protokol kan tjene som en baseline for passende modeller af kronisk epilepsi og epileptogenesis.
Introduction
TLE er en af de mest almindelige erhvervede epilepsies1. Mennesker med epilepsi oplever tilbagevendende anfald forårsaget af unormal neuronal aktiviteter i hjernen2,3. TLE er ofte vanskelige, er det vigtigt at forstå de grundlæggende mekanismer bag udvikling af epilepsi.
Dyremodeller, der kan sammenfatte de vigtigste karakteristika af menneskelige TLE kan tilbyde bedre forståelse af TLE Patofysiologi, så vi kan let overvåge og manipulere kritiske faktorer i epileptogenesis. Blandt dem, har chemoconvulsants-induceret SE været udbredte4,5. I modsætning til andre epilepsi modeller, såsom elektrisk stimulation, som viser ingen hippocampus sklerose og robust SRS6,7,8, kan systemisk injektion af chemoconvulsants efterligne kliniske patogenesen af menneskelige TLE, dvs., indledende hjerneskade, en latent periode og en kronisk epileptisk stage manifestere SRS5,9,10. Derfor, denne teknik kan udnyttes i forskellige undersøgelser forklare mekanismerne for akutte skader på hjernen, epileptogenesis eller beslaglæggelse undertrykkelse. Derudover er histopatologiske forandringer forårsaget af chemoconvulsants magen til dem, der ses i menneskelige TLE, at give en yderligere begrundelse for brug af TLE gnavere modeller10,11,12. Navnlig, har strukturelle skader der involverer hippocampus været konsekvent gengivet i begge kainic syre - og pilocarpin-induceret SE modeller. Men sammenlignet med kainic syre injektion, pilocarpin model kan producere mere robuste SRS i mus, der kan give betydelige fordele for at studere kronisk epilepsi, når man overvejer den bred tilgængelighed af Transgene mus linjer5, 13 , 14 , 15. Endvidere beslaglæggelse progression efter pilocarpin injektion er generelt hurtigere end i modellens kainic syre giver yderligere beviser for effektiv brug af en pilocarpin model af epilepsi.
Her, viser vi en metode af inducerende SE ved i.p. injektion af pilocarpin og ved at udføre video og EEG overvågning i kronisk epilepsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af den etiske komité i den katolske universitet Korea og blev gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH publikationer No. 80-23).
1. SE induktion
- Køb 8-uge-forhenværende mandlige C57BL/6NHsd mus og vejer hver mus. Brug derefter en tusch for at markere haler af alle mus til deres nem identifikation under SE induktion.
- Beregning af Scopolamin methylbromid (Scopolamin; 2 mg/kg), terbutaline hemisulfate (terbutaline; 2 mg/kg) og pilocarpin hydrochlorid (pilocarpin; 280 mg/kg) baseret på musen vægt og tilføje saltvand (0,9% NaCl, 10 mL/kg) at gøre løsninger.
Bemærk: For eksempel, hvis vægten af musen er 25 g, følgende beløb er anvendt: Scopolamin og terbutaline: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0,05 mg, saltvand: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL, pilocarpin: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Saltvand: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) = 0,25 mL. - Indlæse Scopolamin og terbutaline blandingen i en 1 mL sprøjte med en 30 G kanyle. Tilføre hver mus løsningen intraperitoneal, og derefter returnere mus til deres bure. På 30 min efter Scopolamin og terbutaline administration, skal du injicere pilocarpin løsning i hvert mus (i.p.; 30 G kanyle, 1 mL sprøjte). Umiddelbart efter pilocarpin injektion, skal du placere mus i en inkubator (28-30° C) til observation.
- Nøje overvåge opførslen af musene indtil SE er induceret. Hvis limbiske motoriske anfald, der svarer til trin 3 eller højere efter Racines skala opdages, registrere tid og overvåge mus for at afgøre, om anfaldene forekomme hyppigere. Når konstant motoriske anfald varer mere end 2 min, placere musen i et nyt bur ved stuetemperatur og holde overvåge for 3 h for at afgøre, om deres krampagtig kramper fortsætte og SE er induceret. Aflive de mus, der mislykkedes at indtaste SE på omkring 2 timer efter pilocarpin injektion.
Bemærk: Racines skala; fase 1, munden og ansigtet bevægelse; fase 2, hovedet Nikkende; fase 3, forelimb clonus; fase 4, opdræt med forelimb clonus; etape 5, opdræt og falder med forelimb clonus16. Hvis musen ikke er overført til buret ved stuetemperatur umiddelbart efter SE induktion, kan musen dø som følge af hypertermi. - Opsige adfærdsmæssige akut anfald på 3 h efter SE debut ved at indsprøjte diazepam løsning (i.p. 10 mg/kg 1 mL sprøjte; 30 G nål). Gøre diazepam løsning ved at fortynde 5 mg/mL af diazepam i 10% polyoxyl 35 hydrogeneret ricinusolie ved at tilføje saltvand (i.p. 10 mL/kg 1 mL sprøjte; 30 G nål).
Bemærk: 10% polyoxyl 35 hydrogeneret ricinusolie løsning: 1 mL polyoxyl 35 hydrogeneret ricinusolie løsning + 9 mL saltvand. Gemme løsning ved stuetemperatur. For eksempel, hvis musen kropsvægt er 25 g, injicere 250 µL af diazepam løsning: 50 µL 5 mg/mL diazepam + 200 µL 10% polyoxyl 35 hydrogenerede castor olie løsning = 250 µL 1 mg/mL diazepam. - For sham mus, udføre en i.p. indsprøjtning af Scopolamin methylbromid og terbutaline hemisulfate blandingen (i.p.; begge 2 mg/kg, 10 mL/kg, 1 mL sprøjte, 30 G nål). 30 min. senere, indsprøjte saltvand intraperitoneal (i.p. 10 mL/kg 1 mL sprøjte; 30 G nål).
Bemærk: Hvis musen kropsvægt er 25 g, injicere 250 µL af saltvand i stedet for pilocarpin. - Efter diazepam injektion (i.p.; 30 G kanyle, 1 mL sprøjte), administrere 1 mL 5% dextrose pr. individuelle mus (i.p.; 26 G kanyle, 1 mL sprøjte).
Bemærk: 1 mL 5% dextrose injektion giver energikilde og hydrering, der kan øge overlevelsesraten. - Under post pleje i inkubator (28-30 ° C), skal du aftørre overdreven sekreter såsom spyt, tårer og afføring.
- På dag 1 efter SE induktion, vejer mus og holde dem i inkubator (28-30 ° C) for en ekstra dag. På dag 2, efter SE induktion, vejer mus og bringe dem tilbage til deres hjem bur. Give fugtig chow for at lette deres recovery.
Bemærk: I dette eksperiment var dødeligheden for C57BL/6NHsd efter SE opsigelse 8,57% i gennemsnit (3 ud af 35 mus testet). - Måle dagligt kropsvægt af dyrene indtil 7 dage efter pilocarpin og injicere musene med 5% dextrose (i.p.; 26 G kanyle, 1 mL sprøjte) når kropsvægten ikke steget. Stop krop vægt overvågning når musene begynder at genvinde kropsvægt og forbruge fugtig chow uden besvær 2 dage efter pilocarpin injektion.
Bemærk: Hvis kropsvægt musen ikke steg indtil 7 dage indlæg SE, udelukke musen fra eksperimentet og aflive af kuldioxid. Afhængigt af baggrund af musen, kan død lejlighedsvis forekomme; men ved C57BL/6NHsd, mindre end 1% af mus døde i disse eksperimenter. Med overlevelse af mere end 7 dage efter SE induktion dø musene sjældent den latente periode.
2. implantering for Video-EEG overvågning
- Forberede 12 uger gamle mus (4 uger efter SE induktion) til at udføre telemetri implantation for EEG overvågning.
Bemærk: Timingen af implantation kan blive ændret afhængigt af de eksperimentelle formål og mus stammer. - Før operationen, bedøver mus med en blanding (4:0.5) af ketamin (50 mg/mL) og xylazin (23,3 mg/mL) løsning opløst i saltvand i en dosis på 2,5 µL/g kropsvægt (i.p.; 26 G kanyle, 1 mL sprøjte). Overvåge respirationsfrekvens og respiratoriske indsats af musen med jævne mellemrum (15 min. interval maksimale) og vurdere dybde af anæstesi ved pedal tilbagetrækning refleks.
- Placere musen i et stereotaxisk ramme med øre barer og en bid plade og anvende vet salve på begge øjne til at undgå blindhed.
- For at opretholde sterile forhold under operationen, barbere kirurgisk websteder ved hjælp af et barberblad. Vær omhyggelig med at forhindre pels forurening af det kirurgiske felt. Efter barbering, Desinficer huden med 70% ethanol og jod løsning.
Bemærk: Kirurgi bør udføres i en aseptisk måde bære sterile handsker og masker, ved hjælp af steriliseret udstyr og aseptisk teknik. - Efter at have bekræftet dybden af anæstesi, gøre en midterlinjen indsnit i huden til at udsætte kraniet. Lave to burr huller med en boremaskine knyttet til den stereotaxisk apparatur på koordinaterne fra Bregma i anteroposterior akse (AP): +0.1 mm, mediolateral akse (ML): +0.1 mm (Reference), og AP: −0.2 mm, ML: +0.22 mm (venstre parietal cortex)13.
- Tør hud med PBS-gennemblødt bomuld swaps, efterfulgt af 70% ethanol og jod løsning. Lave en langsgående indsnit i midten af hovedet med saks til at udsætte Lambda (det punkt hvor den sagittal og den lambdoid sutur mødes), Bregma (punkt skæringspunkterne for den koronale sutur af sagittal sutur) og destinationsplaceringen.
- Identificere anatomiske landemærker som Lambda og Bregma. Placer borehoved på Bregma og note X, Y koordinater for dette punkt.
- Bruge en hjerne atlas bøger eller offentliggjort henvisninger for at bestemme de passende koordinater af hjerneregioner for EEG registrering. Derefter beregne koordinaterne for skruerne (reference og optagelse) ved hjælp af Bregma koordinater måles på trin 2.5.2.
- Langsomt sænke borehoved at lave en burr hul være omhyggelig med at undgå at indsætte i boret for langt på det punkt, hvor kraniet bliver tyndere.
- Indsæt kroppen af den indre kanal trådløs EEG senderen bag nakken af halsen subkutant og placere fleksibel fører i nærheden af kraniet.
- Placer en rustfrit stål skrue (2 mm længde) i hver burr hul med en pincet og spænd den ved hjælp af en skruetrækker af uret. Sørg for skruen ikke er indsat for langt dybt ved at justere graden af skrue rotation for at forhindre skader på dura eller hjernen væv.
- Strip isolering frakke 2 mm fra spidsen af kundeemnerne og strække wiren længe nok for at runde skrue aksel for en god forbindelse mellem wiren og skrue. Slut reference til front skruen og optagelse føre til skrue i parietal cortex. Derefter, anvende dental cement for at sikre den hele forsamling på plads uden at udsætte de metaldele.
- Efter kontrol af at de dental cement har helt tørret ved visuel inspektion, sutur i huden og anvende topiske mupirocin salve. Placere musen i et 30 ° C inkubator alene, indtil den genindvinder fra kirurgi (ca. 30 min). Derefter returnere musen til hjem buret indtil kontinuerlig video-EEG overvågning begynder.
Bemærk: Efter kirurgi sprøjtes hvert mus (i.p.; 30 G kanyle, 1 mL sprøjte) med 5 mg/kg af gentamicin (antibiotika) og 5 mg/kg af ketoprofen (analgetika). Dyr bør overvåges, indtil de bliver fuldt specialistbehand. Senderen-implanterede mus har en restitutionsperiode på ca 1 uge.
3. video og EEG overvågning og analyse
- Placere en mus i en individuel buret og placere buret oven på de trådløse modtager plader hvor Faraday bur er installeret til at undgå afbrydelser af elektriske signaler fra alle kilder, herunder en computer, AC linjer og tilstødende modtagere.
Bemærk: Se i brugervejledningen til den leveret af producenten. Skal sørges for at undgå døde vinkler. - Optage den elektriske aktivitet ved hjælp af trådløs video-EEG telemetry system.
- Åbn softwaren til video-EEG registrering. Klik på "Hardware" og vælg "Rediger configuration". Passer til modtageren og senderen implanteret i hver mus. Klik på "Kanal konfiguration" og bekræfte alle kanaler er aktive. Klik på "Konfiguration af Video" synkronisere video med EEG data (beslutning af 40 x 480 og frame rate af 30.00).
Bemærk: Installer et IP-kamera med høj følsomhed, hvis det er afgørende at indsamle gode billedkvaliteter, der kan identificere subtile adfærdsændringer hos musene om natten. - Klik på "Setup" og "P3 setup" til input enkelte dyrs information, matchede kamera og grafen indstilling.
- Klik på "Køb" og "A/D samplingfrekvens" til opsætning prøveudtagning satser. Klik "datasæt navn" udpeger hvert eksperiment.
Bemærk: Udtagningsfrekvensen for EEG skal være højere end 500 Hz. på grund af den store video og EEG-datastørrelse, det anbefales at kun 24 h af data håndteres pr. session snarere end benytter en kontinuerlig 2-ugen-registrering som én fil. Data kan gemmes separat på 8 timer eller 12 h intervaller i RAM hukommelsesmangel. - Aktivere senderen med en magnetisk bar og klik på "Start erhvervelse" til at indsamle video-EEG registrering. Løbende overvåge musen af video-EEG systemet i mindst 2 uger.
Bemærk: For C57BL/6 mus, SRS tendens til at indtræffe i klynger der sidst omkring 5,2 dage og varigheden af den beslaglæggelse-fri periode er ca 6.7 dage17.
- Åbn softwaren til video-EEG registrering. Klik på "Hardware" og vælg "Rediger configuration". Passer til modtageren og senderen implanteret i hver mus. Klik på "Kanal konfiguration" og bekræfte alle kanaler er aktive. Klik på "Konfiguration af Video" synkronisere video med EEG data (beslutning af 40 x 480 og frame rate af 30.00).
- Bestemme beslaglæggelse hyppighed og varighed af manuel kontrol ved hjælp af analyse software.
- Markere området viser SRS og eksportere data til statistiske analyser. Være forsigtige for at udelukke EEG artefakter, der kan genereres ved at skrabe hovedet eller tygge; disse kan fjernes ved at kontrollere den video data.
Bemærk: SRS er defineret som en pludseligt indsættende af gentagne epileptiform spiking aktivitet (≥ 3 Hz), fortsætter til mere end 10 s. krampagtig adfærd kan ofte ledsaget med en byge af spiking aktivitet. Non-krampe anfald kan også påvise electrographic spiking aktiviteter uden krampagtig adfærd. Beslaglæggelse opsigelse er defineret som forekommer, når fyring pigge vende tilbage til baseline aktivitet. - For analyse af anfaldsfrekvensen, ved at dividere det samlede antal SRS tilfælde opdaget i løbet af 2 uger af det samlede antal optagelse dage for hvert enkelt dyr.
- Analyse af beslaglæggelse varighed, måle tid fra starten til slutningen af epileptiform spiking aktiviteter.
- Markere området viser SRS og eksportere data til statistiske analyser. Være forsigtige for at udelukke EEG artefakter, der kan genereres ved at skrabe hovedet eller tygge; disse kan fjernes ved at kontrollere den video data.
- Efter afslutningen af video-EEG-optagelse, fix hjernen med 4% PARAFORMALDEHYD ved transcardial perfusion. Bedøver musen, indsprøjtes en opløsning (4:0.5) af ketamin (50 mg/mL) og xylazin (23,3 mg/mL) opløses i saltvand i en dosis på 10 μL/g kropsvægt (i.p.; 26 G kanyle, 1 mL sprøjte). Når musen er bekræftet at være dybt bedøvede, udføre transcardial perfusion.
- Før isolere mus hjernen, hente senderen fra mus til genbrug efter udrensning.
- Fjerne den dental cement omkring kundeemner ved hjælp af pincet.
- Blød spids af kundeemner med dental cement i 100% acetone, indtil den dental cement er opløst.
- Fjerne væv forurenende stoffer i nærheden af senderen ved at skylle det med destilleret vand.
- Skyl senderen med 70% ethanol for 3 h og luft tørre det til opbevaring. Umiddelbart inden den næste brug, skyl skrue og transmitter med 70% ethanol, efterfulgt af destilleret vand, og Placer dem i saltvand.
Bemærk: Skal sørges for at undgå at skære de fleksible ledninger når hugger musen siden, hvis de fleksible kundeemner er alt for korte, støj i den næste implantation og video-EEG registrering kan øge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket SE kan fremkalde hippocampus celledød og SRS (figur 1 og figur 2). Vi afsluttede adfærdsmæssige akut anfald af diazepam injektion på 3 h efter SE debut og ofret mus 7 dage eller 6 uger senere.
Video-EEG overvågning, musene modtaget Brystimplantatregistrering surgery 4 uger efter SE og SRS tilfælde blev vurderet til 2 uger fra 5-7 uger efter SE udbrud.
Figur 1 viser cellen dødsfald i hippocampus vurderet af cresyl violette pletter. 7 dage efter SE, blev pyknotic celler opdaget i regionerne hilar (figur 1annonce) i den dentate gyrus og den pyramideformede cellelag af CA3 subfield af hippocampus (figur 1Af), hvorimod intakt hippocampus blev observeret i sham dyr injiceres med saltvand i stedet for pilocarpin (figur 1Aa-c). Interessant, dyr, der gennemgik flere beslaglæggelser, men undlod at indtaste SE, viste ingen celledød i regionen hilar eller den pyramideformede cellelag (figur 1Ag-i). 6 uger efter SE konstateredes en markant reduktion i antallet af hilar celler (figur 1Bm). Derudover neuronal tab blev observeret i CA1 (figur 1mia) og CA3 (figur 1Bo) regioner.
Figur 2 viser de repræsentative EEG spor i sham og SE grupper (fig. 2A). I forhold til gruppen sham viser fysiologisk elektriske aktivitet, SE gruppen lejlighedsvis viste epileptiform udledninger ledsaget med krampagtig adfærd. Placeringen af epidural elektroderne er illustreret i figur 2C. Figur 2 B viser et eksempel på de elektriske lyde fra en hosliggende Dataskærm og manglende signal samling. Vi viste også EEG spor af fingeret manipuleret dyr, der viste spontane anfald i løbet af 2 uger af video-EEG optagelse (figur 2E) og fundet kortikale skader på perfusion, muligvis stammer fra den alt for dyb placering de epidural skruer (figur 2D).
Figur 1 : Neuronal død i hippocampus efter pilocarpin-induceret SE. Repræsentative billeder fra grupper af (A) 7 dage og (B) 6 uger efter pilocarpin eller saltvand injektion. Forstørrede billeder vise hilus (en, j), CA1 subfelt (b, k), og CA3 subfelt (c, l) af saltvand-behandlede sham gruppe, hilus (d, m), CA1 subfelt (e, n) , og CA3 subfelt (f, o) i gruppen SE og hilus (g), CA1 subfelt (h) og CA3 subfelt (jeg) af de mus, der ikke udvikler sig SE. Black pile i en gog j angive nogle af de repræsentative hilar celler, og pilespidser i d og m angiver pyknotic celler. Skalalinjen i nederste venstre side = 200 µm, gælder for hele venstre de fleste kolonne, skalalinjen i a og c = 20 µm, gælder for hele midterste kolonne og højre kolonne. Forkortelser i denne figur: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampus subfelter; GD: Dentate gyrus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Video og EEG optagelse viser spontan tilbagevendende anfald i epileptiske musen. (A) repræsentative EEG spor fra sham-(øverst) og SE-manipuleret dyr (nederst). Bemærk, at SE-udsat dyr viser epileptiform spiking aktivitet (≥ 3 Hz), ikke udstillet af sham dyr. (B) en repræsentativt billede af elektrisk støj og manglende signal samling. Bemærk høj amplitude unipolære pigge og seponering af elektriske signaler. (C) skematisk tegning af musen hjernen med placeringer af elektroder. (D) to billeder viser intakt og skadede hjernen i cortex, muligvis på grund af alt for dyb indsættelse af epidural skruer. Den sorte pil i billedet til højre angiver stedet for kortikal skade. Skalalinjen = 250 µm. (E) repræsentative EEG spor af fingeret manipuleret dyr med eller uden hjerneskade. Bemærk at fingeret manipuleret dyr med kortikal skade genereret spiking aktivitet og krampagtig SRS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver de eksperimentelle procedurer for SE induktion og evalueringen af kronisk anfald.
Flere faktorer kan påvirke vellykket SE induktion. Nøjagtig adfærdsmæssige kontrol i henhold til Racine scale er afgørende for udviklingen af SRS. Hovedet nikkende, forelimb clonus, opdræt, og falder er adfærdsmæssige kendetegnende for akut anfald udvikle ind SE fase4,16. Når den første motor beslaglæggelse er registreret, længden af intervallet mellem de senere krampagtig kramper falder før du indtaster SE. Derudover bør SE opretholdes i mindst 6 timer, medmindre adfærdsmæssige anfald er ophør af diazepam5. Det er værd at bemærke, at forskere skal være opmærksom på muligheden for, at vedvarende beslaglæggelse aktiviteter kan opdages via electrocorticograms, selvom adfærdsmæssige anfald synes at stilne med injektion af diazepam. Stigende omgivende temperatur efter pilocarpin injektion indtil SE induktion kan forbedre antallet af dyr med SE. Det er også vigtigt at give intensiv efter beslaglæggelse pleje, herunder tilstrækkelig hydrering, ernæringsmæssig støtte og vægt overvågning for højere overlevelsesrate end ca 70-80% i gennemsnit5,18. Afhængigt af dyrets genetiske baggrund, kan modtagelighed for pilocarpin variere. Hvis dyr viser alvorlige akutte anfald med høj dødelighed, kan reduktion af pilocarpin dosering, SE varighed, eller øget Scopolamin og terbutaline være nyttigt. Mens svær SE er kendt for at være relateret til højere forekomst af SRS, med højere dødelighed, er det afgørende at overveje disse faktorer. Hippocampus neuronal dødsfald overholdes konsekvent efter SE. På 6 h post-SE, har omfattende tab af hilar interneurons været rapporteret19. 7 dage efter SE, pyramideformet neuroner i CA3 subfelt typisk dø, og overholdes kontinuerligt på 6 uger efter SE induktion, selv om omfanget af neuronal skade i den pyramideformede cellelag er variabel i mus. Neuronal tab i CA1 subfield af hippocampus kan også observeres ofte. Interessant, dyr med flere anfald, der ikke angiver SE viste næsten intakt hippocampus magen til humbug-gruppen, der angiver histologiske celledød kan være en god markør for tilstrækkelig svær akut anfald.
På ca. 4 uger efter SE, alle pilocarpin-behandlede C57BL/6NHsd mus blev epileptiske og viste SRS, viser en af største fortjener ved hjælp af denne model. Da kronisk anfald er grupperet, skal video-EEG registreres kontinuerligt i mindst 2 uger i stedet for intermitterende, selvom perioden optagelse kan blive ændret afhængigt af den mus stammer eller forsøgsformål17. Derudover har spontane anfald i TLE temperaturprofil variationer viser høj SRS frekvens i den sene eftermiddag20. Praktisk, for præcis video-EEG optagelse skal alle kilder, herunder AC linjer, computere, kameraer eller sendere implanteret i musen i den tilstødende modtager være blokeret. Installation af Faraday bur og kameraer med høj følsomhed i løbet af dagen og natten kan mindske elektrisk støj og hjælp til at identificere generaliseret kronisk anfald, henholdsvis. Endelig er det yderst vigtigt at undgå skader på hjernen, når skruerne er placeret på overfladen af dura mater, da det kan generere vildledende EEG data. Selv om SRS frekvens ikke var høj, kunne nogen mekaniske kortikale skader ved tvungen skrue indsættelse generere krampagtig kramper i kun én uge.
Til sidst, trods den tid begrænsninger for modellering og krav om grundig uddannelse til at udføre implantat operationer og EEG analyse, er pilocarpin-induceret SE en af de bedste modeller for at studere kronisk epilepsi blandt foreliggende dyr modeller af FLE. Her, beskriver vi en metode til overtalelse SE efter pilocarpin injektion og vurdering af kronisk anfald ved hjælp af en trådløs telemetri video-EEG system. Vi mener, at denne protokol kan give detaljerede oplysninger om passende dyremodeller for kronisk epilepsi og epileptogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den nationale forskning fundament af Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (NRF-2014R1A1A3049456) og et tilskud fra Korea sundhed Technology R & D projekt gennem Korea sundhed industri udvikling Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed & velfærd, Republikken Korea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
