Summary
כתב יד זה מתאר שיטה של גרימת סטטוס אפילפטיקוס בזריקה פילוקרפין מערכתית ואת הפיקוח התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית בבעלי חיים באמצעות וידאו אלחוטית טלמטריה העוויתיים המערכת. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד את המנגנונים pathophysiologic של אפילפסיה כרונית, epileptogenesis התקפים חריפה.
Abstract
אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) היא הפרעה נוירולוגית נפוצה בבגרות. ללימודים translational של אפילפסיה כרונית, פילוקרפין-induced סטטוס אפילפטיקוס (SE) נבחרה לעתים קרובות כדי לסכם התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית (SRS). כאן אנו מציגים פרוטוקול האינדוקציה SE על-ידי הזרקת בקרום הבטן (i.p.) פילוקרפין ובפיקוח של התקפים חוזרים כרונית בבעלי חיים באמצעות וידאו אלחוטית טלמטריה מערכת העוויתיים (EEG). להדגים שינויים התנהגותיים בולטים שדורשים תשומת לב אחרי הזרקת פילוקרפין ו שלהם קורלציה עם אובדן עצביים בהיפוקמפוס 7 ימים, פילוקרפין שלאחר 6 שבועות. אנו מתארים גם את ההליכים ניסיוני של השרשה אלקטרודה עבור וידאו ו- EEG הקלטה ולאחר ניתוח תדירות ומשך של התקפים חוזרים ונשנים כרונית. לבסוף, נדון על סיבות אפשריות מדוע לא מושגות התוצאות הצפויות בכל מקרה ומקרה. זה מספק סקירה בסיסית של מידול אפילפסיה כרונית עכברים והנחיות לפתרון. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יכול לשמש בסיס עבור דגמים מסוימים של אפילפסיה כרונית, epileptogenesis.
Introduction
TLE הוא אחד הנפוצים epilepsies רכשה1. אנשים עם אפילפסיה לחוות התקפים חוזרים ונשנים בשל חריגה פעילויות עצביים במוח2,3. בהתחשב בכך TLE לעתים קרובות בלתי פתיר, חשוב להבין את המנגנונים הבסיסיים שבבסיס הפיתוח של אפילפסיה.
מודלים בעלי חיים יכולים לסכם את איפיוני המפתח של TLE האנושי יכול להציע הערכה טובה יותר של TLE פתופיזיולוגיה, אשר מאפשר לנו לעקוב ולטפל גורמים קריטיים epileptogenesis בקלות. ביניהם, SE chemoconvulsants-induced כבר בשימוש נרחב4,5. שלא כמו דגמים אחרים של אפילפסיה, כגון גירוי חשמלי אשר מציג אין בהיפוקמפוס טרשת נפוצה וחזקים SRS6,7,8, הזרקה מערכתית של chemoconvulsants דימה קליניים בפתוגנזה של TLE אנושי, דהיינופגיעה מוחית ראשונית, תקופה כמוס, אפילפסיה כרונית של שלב וקיימות SRS5,9,10. לכן, טכניקה זו יכול להיות מנוצל במחקרים שונים להסביר את המנגנונים של נזק מוחי חריפה, epileptogenesis או דיכוי התקף. יתר על כן, histopathological שינויים המושרה על ידי chemoconvulsants דומים לאלה לראות TLE אנושי, מתן של רציונל נוסף לשימוש של TLE מודלים מכרסמים10,11,12. ראוי לציין, נזקים מבניים מעורבים ההיפוקמפוס היה עקבי שפירטתי בשני המודלים חומצה - ו פילוקרפין-induced SE kainic. עם זאת, בהשוואה להזרקת חומצה kainic, המודל פילוקרפין יכול לייצר SRS עמידים יותר בעכברים, אשר יכולים להציע יתרונות ובודאי ללמוד אפילפסיה כרונית כאשר בוחנים את הזמינות רחב של העכבר הטרנסגניים קווים5, 13 , 14 , 15. Moreover, התקדמות פרכוס לאחר הזרקת פילוקרפין היא בדרך כלל מהיר יותר במודל חומצה kainic, מתן ראיות נוספות לשימוש יעיל של מודל פילוקרפין של אפילפסיה.
כאן, נדגים שיטה של SE גרימת על ידי הזרקה i.p. של פילוקרפין ועל ידי ביצוע וידאו ומעקב EEG באפילפסיה כרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה, בוצעו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (NIH פרסומים מס ' 80-23).
1. SE אינדוקציה
- לרכוש עכברים C57BL/6NHsd זכר בן שבוע 8, שוקלים כל עכבר. לאחר מכן, השתמש עט מרקר כדי לסמן את הזנב של עכברים כל לזיהוי קל שלהם במהלך אינדוקציה SE.
- לחשב את הסכום של סקופלומין מתיל ברומיד (סקופלומין; 2 מ"ג/ק"ג), hemisulfate "טארביטליין" ("טארביטליין"; 2 מ"ג/ק"ג), פילוקרפין הידרוכלוריד (פילוקרפין; 280 מ"ג/ק"ג) מבוסס על משקל העכבר ולהוסיף תמיסת מלח (0.9% NaCl, 10 מ"ל/ק"ג) כדי להפוך פתרונות.
הערה: לדוגמה, אם המשקל של העכבר הוא 25 גרם, הסכומים הבאים מוחלים: סקופלומין, "טארביטליין": 2 מ"ג/ק"ג * (25 גרם של 1,000 גרם) = 0.05 mg, תמיסת מלח: 10 מ"ל/ק"ג * (25 גרם של 1,000 גרם) = 0.25 mL, פילוקרפין: 280 מ"ג/ק"ג * (25 גרם של 1,000 גרם) = 7 מ ג , מלוחים: 10 מ"ל/ק"ג * (25 גרם של 1,000 גרם) = 0.25 mL. - לטעון את התערובת סקופלומין ו "טארביטליין" במזרק 1 מ"ל עם מחט 30 גרם. להזריק את הפתרון intraperitoneally לתוך כל עכבר ולאחר מכן חזור העכברים לכלובים. ב 30 דקות לאחר ניהול סקופלומין "טארביטליין", להזריק פילוקרפין פתרון לתוך כל עכבר (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 30 G מחט). מיד לאחר ההזרקה פילוקרפין, מקום העכברים אינקובטור (28-30 מעלות צלזיוס) להשגחה.
- בזהירות לפקח על אופן הפעולה של העכברים עד SE הוא המושרה. אם התקפים מוטוריים הלימבי המתאימים לשלב 3 ומעלה בהתאם המידה של ראסין מזוהים, רשום את הזמן ונטר העכברים כדי לקבוע אם ההתקפים מתרחשים בתדירות גבוהה יותר. ברגע רצופה התקפים מוטוריים האחרון יותר מ 2 דקות, מקם את העכבר בתוך כלוב חדש בטמפרטורת החדר ולשמור על פיקוח עבור h 3 כדי לקבוע אם התקפים עוויתית שלהם להמשיך SE מושרה. המתת חסד העכברים שנכשלו להיכנס במהירות בערך שעתיים לאחר ההזרקה פילוקרפין.
הערה: קנה המידה של ראסין; שלב 1, הפה ותנועה פנים; שלב 2, הראש מהנהן; שלב 3, קלונוס forelimb; שלב 4, לגידול עם קלונוס forelimb; שלב 5, לגידול ונופל עם forelimb קלונוס16. אם העכבר לא מועברים אל הכלוב בטמפרטורת החדר מיד לאחר אינדוקציה SE, העכבר יכול למות עקב מכת חום. - לסיים התנהגותית חריפה התקפים ב-3 שעות לאחר תחילת SE באמצעות הזרקת פתרון דיאזפם (i.p.; 10 מ"ג/ק"ג; 1 מ"ל מזרק 30 G מחט). הפוך את הפתרון דיאזפאם על ידי דילול 5 מ"ג/מ"ל של דיאזפאם בשמן קיק מוקשה 35 10% polyoxyl על-ידי הוספת תמיסת מלח (i.p.; 10 מ"ל/ק"ג; 1 מ"ל מזרק 30 G מחט).
הערה: 10% polyoxyl 35 מוקשה שמן קיקיון פתרון: 1 מ"ל polyoxyl 35 שמן קיק מוקשה פתרון + 9 מ ל תמיסת מלח. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. לדוגמה, אם משקל הגוף העכבר 25 גרם, להזריק µL 250 של דיאזפאם פתרון: דיאזפאם 5 מ"ג/מ"ל µL 50 + 200 µL 10% polyoxyl 35 קסטור מוקשה שמן פתרון = 250 דיאזפאם 1 מ"ג/מ"ל µL. - עבור עכברים המזויפים, לבצע זריקה i.p. תערובת סקופלומין מתיל ברומיד, "טארביטליין" hemisulfate (i.p.; שני 2 מ"ג/ק"ג, 10 מ"ל/ק"ג. מזרק 1 מ"ל; 30 G מחט). 30 דקות מאוחר יותר, להזריק תמיסת המלח intraperitoneally (i.p.; 10 מ"ל/ק"ג; 1 מ"ל מזרק 30 G מחט).
הערה: אם משקל הגוף העכבר 25 גרם, להזריק µL 250 של תמיסת. סאלין במקום פילוקרפין. - לאחר ההזרקה דיאזפם (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 30 G מחט), לנהל 1 מ"ל של דקסטרוז 5% לכל לעכבר הבודד (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 26 גרם מחט).
הערה: 1 מ"ל של הזרקת דקסטרוז 5% מספק מקור אנרגיה, לחות שיכולים להגביר שיעור ההישרדות. - במהלך הטיפול שלאחר בחממה (28-30 מעלות צלזיוס), תנגב את הפרשות יתר כגון רוק, דמעות, וצואה.
- יום 1 לאחר אינדוקציה SE, שוקל העכברים ולשמור אותם בחממה (28-30 מעלות צלזיוס) ליום אחד נוסף. יום 2, לאחר אינדוקציה SE, שוקל העכברים ולהחזיר אותם לכלוב שלהם הביתה. לספק לחות צ'או כדי להקל על ההחלמה שלהם.
הערה: בניסוי זה, היה שיעור התמותה של C57BL/6NHsd לאחר סיום SE 8.57% בממוצע (3 החוצה של עכברים 35 שנבדקו). - למדוד את משקל הגוף של בעלי החיים מדי יום עד 7 ימים שלאחר פילוקרפין ולהזריק העכברים עם דקסטרוז 5% (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 26 גרם מחט) כאשר משקל הגוף לא גדל. לעצור את הגוף משקל ניטור כאשר העכברים להתחיל להחזיר את משקל הגוף ומכלה צ'או לחים ללא קושי-2 ימים לאחר ההזרקה פילוקרפין.
הערה: אם משקל הגוף של עכבר לא גדלה עד 7 ימים פוסט SE, אל תכלול את העכבר הניסוי, המתת חסד על ידי פחמן דו-חמצני. בהתאם הרקע של העכבר, מוות יכול להתרחש מעת לעת; עם זאת, במקרה של C57BL/6NHsd, פחות מ 1% של עכברים מתו בניסויים אלה. עם ההישרדות של יותר מ- 7 ימים לאחר אינדוקציה SE, העכברים רק לעתים נדירות מתים במהלך תקופת כמוס.
2. ההשתלה ניתוח עבור ניטור וידאו EEG
- להכין עכברים בן שבוע 12 (4 שבועות לאחר אינדוקציה SE) כדי לבצע בדיקות וטלמטריה ההשתלה עבור ניטור EEG.
הערה: התזמון של השרשה יכול להיות שונה בהתאם למטרות ניסיוני זנים העכבר. - לפני הניתוח, עזים ומתנגד את העכבר עם תערובת (4:0.5) של קטאמין (50 מ"ג/מ"ל) והפתרון חריגות השירותים הווטרינריים (23.3 mg/mL) מומס בתוך תמיסת מלח במינון של 2.5 µL/גרם משקל (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 26 גרם מחט). לנטר את קצב הנשימה ואת המאמץ הנשימתי של העכבר במרווחי זמן קבועים (15 דקות מרווח זמן מירבי), להעריך את עומק הרדמה על ידי רפלקס הנסיגה פדלים.
- מקם את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic עם האוזן ברים, צלחת הנשיכה, למרוח את המשחה הוטרינר בשתי העיניים כדי למנוע עיוורון.
- כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח, גילוח כירורגי אתרים בעזרת סכין גילוח. להיות זהירים כדי למנוע זיהום פרווה של השדה הכירורגי. לאחר הגילוח, לחטא את העור עם אתנול 70% פתרון יוד.
הערה: בניתוח יש לבצעו בצורה aseptic לובש כפפות סטריליות ומסכות, באמצעות טכניקות aseptic וציוד מעוקר. - לאחר שנוכח העומק של הרדמה, עושים חתך קו האמצע של העור כדי לחשוף את הגולגולת. להכין שני נקבים עם מקדח המצורפת את המנגנון stereotaxic בקואורדינטות של Bregma ציר anteroposterior (AP): +0.1 מ מ, ציר mediolateral (מ"ל): +0.1 מ מ (הפניה) ו- AP: −0.2 מ"מ, ML: +0.22 מ מ (קליפת הקודקודית הימנית)13.
- יש לנגב את העור עם צמר גפן ספוג PBS חילופי, ואחריו אתנול 70% פתרון יוד. עושים חתך האורך באמצע הראש במספריים כדי לחשוף את למבדה (הנקודה שבו לפגוש את הווריד, את התפר lambdoid) את Bregma (נקודת החיתוך של התפר הפרונטליים מאת התפר המשונן), למיקום היעד.
- לזהות אתרים אנטומיים כגון למדא ו- Bregma. מקם את המקדחה Bregma, הערה ה-X, Y נקודת ציון עבור נקודה זו.
- השתמש ספרים אטלס של המוח או לאור הפניות כדי לקבוע את נקודות הציון המתאים של האזורים במוח להקלטה EEG. לאחר מכן, לחשב את נקודות הציון הברגים (הפניה ורישום) בעזרת הקואורדינטות Bregma נמדד בשלב 2.5.2.
- הורידו לאט את המקדחה לעשות חור burr להיות נזהר שלא הוספת את המקדחה רחוק מדי בנקודת שבו הגולגולת הופך לדליל.
- הוסף הגופה של ערוץ יחיד אלחוטי המשדר EEG מאחורי העורף של הצוואר subcutaneously ומניחים גמיש מוביל ליד הגולגולת.
- להכניס בורג פלדה אל חלד (2 מ מ אורך) בתוך כל חור burr עם פינצטה והדק אותו באמצעות הנהג בורג על ידי סיבוב בכיוון השעון. ודא שהבורג לא הוכנס גם עמוק על-ידי התאמת זווית הסיבוב בורג ולמנוע נזק השכבה הקשה של המוח או של רקמות המוח.
- מפשיטים את המעיל בידוד 2 מ מ מהקצה של ההפניות ולמתוח את החוט מספיק זמן כדי לעגל הפיר בורג עבור חיבור טוב בין החוט את הבורג. להתחבר ההפניה הפניה הבורג הקדמי ואת ההקלטה להוביל הבורג בקליפת הקודקוד. לאחר מכן, להחיל מלט שיניים כדי לאבטח את מכלול שלם במקום מבלי לחשוף חלקי המתכת.
- לאחר אימות כי הבטון שיניים התייבש לחלוטין על ידי בדיקה חזותית, תפר את העור, להחיל משחה mupirocin אקטואלי. הצב את העכבר בתוך חממה של 30 מעלות צלזיוס לבד עד זה יחלים מהניתוח (בערך 30 דקות). לאחר מכן, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה עד ניטור וידאו EEG רציף מתחילה.
הערה: לאחר הניתוח, כל עכבר מוזרק (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 30 G מחט) עם 5 מ"ג/ק"ג של גנטמיצין (אנטיביוטיקה), 5 מ"ג/ק"ג של ketoprofen (משככי כאבים). בעלי החיים צריך לפקח עד שהם הופכים מהיותו באופן מלא. עכברים מושתל משדר לקבל תקופת החלמה של 1 בשבוע.
3. וידאו ו- EEG ניטור וניתוח
- במקום עכבר לכלוב נפרד ולמקם את הכלוב על גבי הלוחות למשדר האלחוטי בו כלוב פאראדיי מותקן כדי למנוע הפרעה של אותות חשמליים כל מקורות כולל מחשב, AC קווים של מקלטי סמוכים.
הערה: עיין במדריך המסופקים על ידי היצרן. יש לנקוט כדי למנוע כתמים עיוורים. - רישום הפעילות החשמלית באמצעות מערכת אלחוטית וידאו EEG טלמטריה.
- פתח את התוכנה עבור הקלטת וידאו EEG. לחץ על "חומרה" ובחר "עריכת תצורה". להתאים את השפופרת, המשדר מושתל לתוך כל עכבר. לחץ על "ערוץ תצורה" ואשר שכל הערוצים פעילים. לחץ על "תצורת וידאו" כדי לסנכרן את הוידאו עם הנתונים EEG (רזולוציה של 40 x 480 וקצב המסגרות של 30.00).
הערה: להתקין מצלמת ה-IP עם רגישות גבוהה אם זה קריטי כדי לאסוף את איכויות תמונה טובה כי אפשר לזהות שינויים התנהגותיים עדינים של העכברים בלילה. - לחץ על "הגדרת" ו- "P3 הגדרת" מידע בעלי חיים בודדים הקלט, המצלמה תואם של הגדרת הגרף.
- לחץ על "רכישת" ו- "A/D קצב הדגימה" תעריפי דגימה ההתקנה. לחץ על "שם ערכת הנתונים" כדי לייעד ניסוי.
הערה: קצב הדגימה של EEG צריך להיות גבוהה מ- 500 הרץ. עקב גודל וידאו גדול וגודל נתוני EEG, מומלץ כי רק 24 שעות של נתונים מטופלות בכל הפעלה במקום להשתמש 2-שבוע-הקלטה רציפה כקובץ אחד. נתונים ניתן לשמור בנפרד במרווחים של 8 שעות או 12 שעות במקרה של מחסור בזיכרון RAM. - להפעיל את המשדר עם פס מגנטי ולחץ על "התחל רכישה" כדי לאסוף את הקלטת וידאו EEG. לפקח באופן רציף את העכבר על-ידי מערכת וידאו EEG לפחות 2 שבועות.
הערה: עבור עכברים C57BL/6, SRS נוטה להתרחש בקבוצות בימים האחרונים כ 5.2 ומשך התקופה ללא פרכוס זה ימים בערך 6.717.
- פתח את התוכנה עבור הקלטת וידאו EEG. לחץ על "חומרה" ובחר "עריכת תצורה". להתאים את השפופרת, המשדר מושתל לתוך כל עכבר. לחץ על "ערוץ תצורה" ואשר שכל הערוצים פעילים. לחץ על "תצורת וידאו" כדי לסנכרן את הוידאו עם הנתונים EEG (רזולוציה של 40 x 480 וקצב המסגרות של 30.00).
- לקבוע את ההתקף התדירות והמשך על ידי בדיקה ידנית באמצעות התוכנה לניתוח.
- לסמן את האזור מציג SRS ולייצא את הנתונים לניתוח סטטיסטי. להיות זהירים כדי לא לכלול חפצים EEG זה יכול להיווצר על ידי גירוד בראש או לעיסה; אלה ניתן להסיר על ידי בדיקת הנתונים וידאו.
הערה: SRS מוגדר של התפרצות פתאומית של עולה פעילות אפילפטית החוזרות על עצמן (≥ 3 הרץ) זה נמשכת עבור יותר מ-10 ס' התנהגויות עוויתית יכול להיות מלווים לעתים קרובות בפרץ של עולה פעילות. Non-עוויתי התקפים יכולים להדגים גם פעילות electrographic עולה בלי התנהגויות עוויתי. תפיסה הפסקת מוגדר המתרחשים כאשר הקוצים ירי חוזר לפעילות בסיסית. - לניתוח של תדירות ההתקפים, לחלק את המספר הכולל של מקרים SRS שזוהו במהלך 2 שבועות על ידי המספר הכולל של הקלטה ימים עבור כל בעל חיים בודדים.
- לצורך ניתוח של משך ההתקף, למדוד את הזמן שמראש בסוף אפילפטית spiking פעילויות.
- לסמן את האזור מציג SRS ולייצא את הנתונים לניתוח סטטיסטי. להיות זהירים כדי לא לכלול חפצים EEG זה יכול להיווצר על ידי גירוד בראש או לעיסה; אלה ניתן להסיר על ידי בדיקת הנתונים וידאו.
- לאחר סיום הקלטת וידאו EEG, לתקן את המוח עם 4% paraformaldehyde על-ידי transcardial זלוף. עזים ומתנגד העכבר, להזריק פתרון (4:0.5) של קטאמין (50 מ"ג/מ"ל), חריגות השירותים הווטרינריים (23.3 mg/mL) מומס בתוך תמיסת מלח במינון של 10 משקל הגוף μL/g (i.p.; מזרק 1 מ"ל; 26 גרם מחט). ברגע העכבר הוא אישר עמוקות עכשיו, לבצע transcardial זלוף.
- לפני לבודד את מוח העכבר, לאחזר את המשדר מן העכבר לשימוש חוזר לאחר ניקוי.
- הסר את הבטון שיניים מסביב ההפניות באמצעות מלקחיים.
- לטבול את קצה ללידים עם מלט שיניים אצטון 100% עד הבטון שיניים היא התפרקה.
- להסיר רקמות מזהמים בסביבה המשדר על ידי שטיפה זה עם מים מזוקקים.
- יש לשטוף המשדר עם אתנול 70% עבור 3 שעות ואוויר יבש זה לאחסון. מייד לפני השימוש הבא, יש לשטוף את הבורג ואת המשדר עם 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, ומניחים אותם בתוך תמיסת מלח.
הערה: יש לנקוט כדי להימנע חותך את החוטים גמיש כאשר עריפת ראשו העכבר מאז, אם ההפניות גמיש קצרות מדי, הרעש השרשה הבא, הקלטת וידאו EEG יכול להגדיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SE מוצלח יכול לגרום מוות תאים בהיפוקמפוס ו- SRS (איור 1 ואיור 2). אנו הסתיים התקפים חריפה התנהגותית בזריקה דיאזפם ב-3 שעות לאחר תחילת SE, הקריב העכברים 7 ימים או 6 שבועות מאוחר יותר.
ניטור וידאו EEG, העכברים קיבלו שתל כירורגיה-4 שבועות לאחר SE, SRS במקרים הוערכו 2 שבועות מ- 5-7 שבועות לאחר תחילת SE.
איור 1 מציג מקרי מוות תאים בהיפוקמפוס מוערך על ידי צביעת cresyl סגול. ב 7 ימים לאחר SE, תאים pyknotic התגלו באזורים מוגדלות (איור 1לספירה) של הכישור משוננת, השכבה תא כפירמידה של שדה CA3 המשנה של ההיפוקמפוס (איור 1Af), בעוד ההיפוקמפוס שלם נצפתה בבעלי החיים המזויפים מוזרק עם תמיסת. סאלין במקום פילוקרפין (איור 1Aa-c). מעניין, בעלי חיים שעברו מספר התקפים, אבל נכשלה הזן SE, הראה אין מוות של תאים באזור מוגדלות או השכבה תא כפירמידה (איור 1Ag-i). ב- 6 שבועות לאחר SE, נצפתה הפחתה מסומנים במספר תאי הכליה (איור 1מוניטור). בנוסף, אובדן עצביים נצפתה ב CA1 (איור 1בסון) ו CA3 (איור 1בו) אזורים.
איור 2 מציג את עקבות EEG נציג המזויפים ובקבוצות SE (איור 2א). לעומת הקבוצה המזויפים מציג פעילות חשמלית הפיזיולוגיות, הקבוצה SE הראה מדי פעם הפרשות אפילפטית מלווה עם התנהגויות עוויתי. המיקומים של האלקטרודות אפידורל מומחשים איור 2C. איור 2 B מדגים דוגמה של הרעשים חשמל מצג סמוכים וכישלון של האות אוסף. אנחנו גם הדגימו EEG עקבות של חיות מניפולציות המזויפים הראה התקפים ספונטנית במהלך השבועות 2 של הקלטה וידאו EEG (איור 2E) ומצא פציעות קורטיקליים-זלוף, כנראה נגזר מהמיקום עמוק יתר על המידה על הברגים אפידורל (איור 2D).
איור 1 : מוות עצביים בהיפוקמפוס לאחר פילוקרפין-induced SE- תמונות נציג קבוצות של (A) 7 ימים ו- (B) 6 שבועות לאחר ההזרקה פילוקרפין או תמיסת מלח. תמונות בהגדלה להראות את hilus (a, j), שדה CA1 (b, k), שדה CA3 (c, l) של תמיסת מלח שטופלו שאם קבוצה, את hilus (יח, ז), שדה CA1 (e, n) , שדה CA3 (f, o) של הקבוצה SE, את hilus (g), כתת-תחום CA1 (h) לבין CA3 שדה (אני) של העכברים לא לפתח חצים SE. שחור , gו- j לציין כמה של תאי הכליה נציג, ראשי חץ ב d ו- m לציין תאים pyknotic. סרגל קנה מידה בתחתית צד שמאל = 200 מיקרומטר, תקף כל עזבו רוב עמודות, סרגל קנה מידה ו- c = 20 מיקרומטר, תקף העמודה האמצעית כולה ואת בעמודה הימנית. קיצורים באיור זה: CA1, CA3: Cornu Ammonis בהיפוקמפוס תחומים; די. ג'י: משוננת הפיתול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הקלטת וידאו ו- EEG מראה ספונטני התקפים חוזרים ונשנים העכבר אפילפטי. (א) נציג אא ג עקבות דמה-(למעלה) ובעלי חיים מניפולציות SE (בחלק התחתון). שימו לב כי חיות SE-נתון להראות spiking פעילות אפילפטית (≥ 3 הרץ), לא הייצוגיים. על ידי העמדת פנים חיות. (B) א תמונה ייצוגית של רעשים חשמליים וכישלון של האוסף אות. הערה על קוצים unipolar משרעת גבוהה והפסקה של אותות חשמליים. (ג) שרטוט סכמטי של המוח עכבר עם מיקומים של אלקטרודות. (ד) שתי תמונות מציג את המוח הפגוע ומתפקד בקליפת, כנראה עקב החדרת ברגים אפידורל עמוק יתר על המידה. החץ השחור בתמונה נכון מציין האתר של נזק בקליפת המוח. סרגל קנה מידה = 250 EEG נציג עקבות מיקרומטר. (E) של מניפולציות המזויפים חיות עם או בלי פגיעה מוחית. הערה מניפולציות שאם בעלי פגיעה בקליפת המוח שנוצר spiking פעילות ו- SRS עוויתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת את נהלי ניסיוני של אינדוקציה SE והערכה של התקפים כרונית.
מספר גורמים יכולים להשפיע על אינדוקציה SE מוצלחת. ניטור התנהגותית מדויק על-פי קנה המידה של ראסין הינה קריטית לפיתוח של SRS. הראש מהנהן, קלונוס forelimb, גידול, ונפילה הן גולת התנהגותית של התקפים חריפה מתפתחת SE שלב4,16. לאחר ההתקף הראשון מנוע מזוהה, אורך המרווח בין ההתקפים עוויתית מאוחר יותר מקטין לפני הכניסה SE. יתר על כן, SE צריך להתקיים במשך לפחות 6 שעות אלא אם התקפים התנהגותית מנוטרלים על ידי דיאזפאם5. ראוי לציין כי החוקרים להיות מודעים לאפשרות שסייעה פרכוס פעילויות יכול להתגלות דרך electrocorticograms, למרות התקפים התנהגותית נראה תתארך עם הזרקת דיאזפאם. הגדלת טמפרטורת הסביבה לאחר ההזרקה פילוקרפין עד אינדוקציה SE ניתן לשפר במידה רבה את מספר בעלי חיים SE. זה חשוב גם לספק טיפול אינטנסיבי שאחרי שבץ, כולל שתיה מספקת, תמיכה תזונתית ומשקל ניטור עבור שיעורי הישרדות גבוהים יותר מאשר כ 70-80% בממוצע5,18. בהתאם הרקע הגנטי של החיה, הרגישות פילוקרפין עשויים להיות שונים. אם בעלי החיים מציג התקפים חריפה חמורה עם תמותה גבוהה, צמצום פילוקרפין מינון, משך SE, או סקופלומין מוגברת, "טארביטליין" יכול להיות מועיל. בעוד SE חמור ידוע כי שכיחות הקשורות גבוה יותר של SRS, עם תמותה גבוהה יותר, חשוב לקחת בחשבון גורמים אלה. מקרי מוות עצביים בהיפוקמפוס בעקביות שנצפו לאחר SE. ב- 6-אייץ ' פוסט-SE, אובדן נרחב של interneurons מוגדלות כבר דווח על19. ב 7 ימים לאחר SE, נוירונים כפירמידה ב שדה CA3 המשנה בדרך כלל למות, הם נצפו באופן רציף על 6 שבועות לאחר אינדוקציה SE, למרות היקף הנזק עצביים בשכבת תאים כפירמידה הוא משתנה בעכברים. הפסד עצביים שדה CA1 המשנה של ההיפוקמפוס יכול גם להיות לעתים קרובות שנצפו. מעניין, חיות עם התקפים מרובות שלא נכנסים SE הראה ההיפוקמפוס כמעט ללא פגע דומה לקבוצה המזויפים, כמסמן מוות של תאים היסטולוגית יכולה להיות סמן טוב של התקפים חריפה חמורה מספיק.
כ- 4 שבועות לאחר SE, כל פילוקרפין מטופלים עכברים C57BL/6NHsd הפך אפילפטי, SRS הראה, הממחיש את אחד האתגרים לגופו באמצעות מודל זה. מאז התקפים כרונית מקובצים, וידאו EEG צריך להקליט באופן רציף לפחות 2 שבועות ולא לסירוגין, למרות תקופת ההקלטה ניתן לשנות בהתאם העכבר זנים או למטרות ניסיוני17. יתר על כן, ויהיו ספונטנית TLE יש וריאציות ההשתנות היומית הוכחת בתדירות גבוהה SRS בשעות אחר הצהריים המאוחרות20. . למעשה, עבור הקלטת וידאו EEG מדויק, מקורות כולל קווי AC, מחשבים, מצלמות או משדרי מוטמן בתוך העכבר המקלט הסמוך צריך להיות חסומה. ההתקנה של כלוב פאראדיי, מצלמות עם רגישות גבוהה במהלך היום והלילה יכולים להפחית רעש חשמלי, עזרה לזיהוי מוכללת ויהיו כרונית, בהתאמה. לבסוף, חשוב מאוד למנוע נזק מוחי כאשר הברגים ממוקמים על פני קרום הדורה כמו זה ניתן להפיק נתוני EEG מטעה. למרות התדירות SRS לא היה גבוה, פציעות קורטיקלית מכני על-ידי הבורג בכפייה ההכנסה יכול לייצר עוויתית התקפים בשבוע אחד בלבד.
לסיכום, למרות הזמן אילוצים עבור מידול, הדרישה של הכשרה מעמיקה כדי לבצע שתל ניתוחים וניתוח EEG, SE פילוקרפין-induced הוא אחד הדגמים הטובים ביותר ללמוד אפילפסיה כרוני בקרב בעלי חיים זמין כרגע מודלים של TLE. כאן, אנו מתארים שיטה של SE גרימת לאחר הזרקת פילוקרפין והערכה כרונית התקפים באמצעות מערכת וידאו EEG בדיקות וטלמטריה אלחוטית. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יכול לספק מידע מפורט עבור מודלים מתאימים עבור כרונית אפילפסיה ו- epileptogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק הלאומי מחקר קרן של קוריאה (NRF) במימון הממשלה קוריאנית (ה-NRF-2014R1A1A3049456), מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), במימון משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
