Summary
Este manuscrito describe un método de inducir epilepticus del estado por la inyección sistémica de pilocarpina y vigilancia convulsiones recurrentes espontáneas en animales vivos con un sistema de electroencefalograma y telemetría inalámbrica video. Este protocolo puede ser utilizado para el estudio de los mecanismos patofisiológicos de epilepsia crónica, epileptogénesis y convulsiones agudas.
Abstract
Epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es un trastorno neurológico común en la edad adulta. Estudios traslacionales de epilepsia crónica, inducida por la pilocarpina estado epiléptico (SE) se selecciona con frecuencia para recapitular convulsiones recurrentes espontáneas (SRS). Aquí presentamos un protocolo de inducción SE por inyección intraperitoneal (i.p.) de pilocarpina y el control de convulsiones recurrentes crónicas en animales vivos mediante un electroencefalograma (EEG) sistema de telemetría inalámbrica video y. Hemos demostrado notables cambios del comportamiento que requieren atención después de la inyección de pilocarpina y su correlación con la pérdida neuronal hippocampal en 7 días y pilocarpina después de 6 semanas. También describimos los procedimientos experimentales de la implantación de electrodos para el vídeo y la grabación de EEG y análisis de la frecuencia y duración de las convulsiones recurrentes crónicas. Finalmente, se discuten las posibles razones por qué los resultados esperados no se obtienen en cada caso. Esto proporciona una descripción básica de modelado epilepsia crónica en ratones y directrices para la solución de problemas. Creemos que este protocolo puede servir como base para modelos adecuados de la epilepsia crónica y epileptogenesis.
Introduction
ELT es una de las epilepsias adquiridas más comunes1. Las personas con epilepsia experimentan convulsiones recurrentes como resultado de actividades neuronales anormales en el cerebro2,3. Dado que TLE a menudo es insuperable, es crucial entender los mecanismos básicos subyacentes al desarrollo de la epilepsia.
Modelos animales que pueden recapitular las características claves de TLE humana pueden ofrecer mejor apreciación de la fisiopatología de la ELT, lo que nos permite fácilmente controlar y manipular los factores críticos en la epileptogénesis. Entre ellos, SE chemoconvulsants-inducida ha sido ampliamente utilizado4,5. A diferencia de otros modelos de epilepsia, como estimulación eléctrica que no muestra esclerosis hippocampal y robusto SRS6,7,8, la inyección sistémica de chemoconvulsants puede mímico patogenesia clínica de ELT humana, es decir, lesión cerebral inicial, un período de latencia y un epiléptico crónico etapa manifestación SRS5,9,10. Por lo tanto, esta técnica puede ser utilizada en varios estudios, explicando los mecanismos de daño de cerebro agudo, epileptogenesis o supresión de la confiscación. Por otra parte, alteraciones histopatológicas inducidas por chemoconvulsants son similares a ésos vistos en TLE humano, proporcionando una justificación adicional para uso de TLE modelos de roedores10,11,12. En particular, los daños estructurales que implican el hipocampo han sido reproducidos consistentemente en ambos modelos de ácido y pilocarpina-inducida SE kaínico. Sin embargo, comparados con la inyección de Ácido kaínico, el modelo de pilocarpina puede producir SRS más robusta en los ratones, que pueden ofrecer ventajas considerables para el estudio de epilepsia crónica cuando se considera la amplia disponibilidad de líneas de ratón transgénico5, 13 , 14 , 15. por otra parte, progresión de convulsiones después de la inyección de pilocarpina es generalmente más rápida que en el modelo de Ácido kaínico, proporcionando evidencia adicional para el uso efectivo de un modelo de pilocarpina de epilepsia.
Aquí, demostramos un método SE induce mediante la inyección i.p. de pilocarpina y realizando la supervisión de EEG en epilepsia crónica y vídeo.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Católica de Corea y se llevaron a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH publicaciones no. 80-23).
1. SE inducción
- Comprar ratones C57BL/6NHsd machos de 8 semanas de edad y peso de cada ratón. Luego, use un rotulador para marcar las colas de los ratones para su fácil identificación durante la inducción SE.
- Calcular la cantidad de escopolamina metilbromuro (escopolamina; 2 mg/kg), terbutalina hemisulfate (terbutalina; 2 mg/kg) y clorhidrato de pilocarpina (pilocarpina, 280 mg/kg) basada en el peso del ratón y añada solución salina (0,9% NaCl, 10 mL/kg) para hacer soluciones.
Nota: Por ejemplo, si el peso del ratón es 25 g, se aplican las siguientes cantidades: escopolamina y terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, solución salina: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, pilocarpina: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg , Salino: 10 mL/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 mL. - Coloque la mezcla de escopolamina y terbutalina en una jeringa de 1 mL con una aguja de 30 G. Inyectar la solución intraperitoneal cada ratón y luego regresar a los ratones a sus jaulas. A los 30 min después de la administración de escopolamina y terbutalina, inyectar solución de pilocarpina en cada ratón (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL). Inmediatamente después de la inyección de pilocarpina, coloque el ratón en una incubadora (28-30° C) para la observación.
- Vigilar cuidadosamente el comportamiento de los ratones hasta que SE es inducido. Si se detectan límbicos asimientos del motor que corresponden a la etapa 3 o superior según la escala de Racine, registrar el tiempo y controlar los ratones para determinar si las convulsiones ocurren con más frecuencia. Una vez continuados asimientos del motor duran más de 2 minutos, colocar el ratón en una jaula nueva a temperatura ambiente y mantener monitoreo durante 3 horas determinar si continúan sus ataques convulsivos y SE es inducido. Eutanasia a los ratones que no pudieron entrar SE en aproximadamente 2 horas después de la inyección de pilocarpina.
Nota: Escala de Racine; etapa 1, la boca y el movimiento facial; etapa 2, movimientos de cabeceo; etapa 3, clonus del miembro anterior; etapa 4, cría con clonus del miembro anterior; etapa 5, cría y caída con el miembro anterior clonus16. Si el ratón no se transfiere a la estructura a temperatura ambiente inmediatamente después de la inducción SE, el ratón puede morir debido a la hipertermia. - Terminar comportamiento convulsiones agudas a las 3 h después del inicio SE inyectando solución de diazepam (i.p.; 10 mg/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G). Hacen de la solución de diazepam de 5 mg/mL de diazepam en 35 aceite de ricino hidrogenado polioxil 10% de dilución mediante la adición de solución salina (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G).
Nota: 10% polioxil 35 hidrogenada el aceite de ricino solución: solución de 35 aceite de ricino hidrogenado polioxil 1 mL + solución salina 9 mL. Almacenar la solución a temperatura ambiente. Por ejemplo, si el peso del cuerpo del ratón es 25 g, inyectar 250 μl de solución de diazepam: 50 diazepam de 5 mg/mL μl + 200 μl 10% polioxil 35 hidrogenado castor aceite solución = diazepam de 1 mg/mL de 250 μl. - Para los ratones sham, realizar una inyección i.p. de la mezcla de hemisulfate escopolamina metilbromuro y terbutalina (i.p.; ambos 2 mg/kg, 10 mL/kg; jeringa de 1 mL y aguja de 30 G). 30 minutos más tarde, inyectar la solución salina por vía intraperitoneal (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL aguja de 30 G).
Nota: Si el peso del cuerpo del ratón es 25 g, inyectar 250 μl de solución salina en lugar de pilocarpina. - Después de la inyección de diazepam (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL), administrar 1 mL de dextrosa 5% por cada ratón (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G).
Nota: 1 mL de inyección de dextrosa 5% proporciona la fuente de energía e hidratación que puede aumentar la tasa de supervivencia. - Durante la atención en la incubadora (28-30 ° C), limpie el exceso secreciones como saliva, lágrimas y heces.
- Día 1 después de la inducción SE pesan los ratones y mantenerlos en la incubadora (28-30 ° C) para un día extra. Día 2, después de la inducción SE pesan los ratones y devolverlos a su jaula casera. Proporcionar chow húmedo para facilitar su recuperación.
Nota: En este experimento, la tasa de mortalidad de C57BL/6NHsd después de la terminación SE fue de 8.57% en promedio (3 a 35 ratones probado). - Medir diariamente el peso corporal de los animales hasta pilocarpina después de 7 días e inyectar a los ratones con dextrosa 5% (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G) cuando el peso no ha aumentado. Stop control de peso corporal cuando los ratones comienzan a recuperar el peso corporal y consumir chow húmedo sin dificultad en 2 días después de la inyección de pilocarpina.
Nota: Si el peso corporal de un ratón no aumentó hasta 7 días post SE, excluyen el ratón del experimento y eutanasia por dióxido de carbono. Según el fondo del ratón, la muerte puede ocurrir de vez en cuando; sin embargo, en el caso de C57BL/6NHsd, menos del 1% de los ratones murió en estos experimentos. Con supervivencia de más de 7 días después de la inducción SE, los ratones mueren raramente durante el periodo de latencia.
2. implantación cirugía para la supervisión del vídeo-EEG
- Ratones de 12 semanas de edad (4 semanas después de la inducción SE) se preparan para realizar la implantación de telemetría para monitoreo de EEG.
Nota: Tiempo de implantación puede ser modificado dependiendo de la experimentación y las cepas de ratón. - Antes de la cirugía, anestesiar el ratón con una mezcla (4:0.5) de ketamina (50 mg/mL) y solución de xilacina (23,3 mg/mL) disuelto en solución salina a dosis de 2,5 μl/g de peso corporal (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G). Vigilar frecuencia respiratoria y el esfuerzo respiratorio del ratón a intervalos regulares (intervalo de 15 minutos máximo) y evaluar la profundidad de la anestesia por el reflejo de retirada del pedal.
- Coloque el ratón en un marco estereotáxicas con barras de oído y una placa de mordida y Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la ceguera.
- Para mantener las condiciones estériles durante la cirugía, afeitado quirúrgicos sitios utilizando una hoja de afeitar. Tenga cuidado para evitar la contaminación de la piel del campo quirúrgico. Después del afeitado, desinfectar la piel con solución de etanol y yodo 70%.
Nota: La cirugía debe realizarse de manera aséptica, uso de guantes estériles y máscaras, usando equipos estériles y técnicas asépticas. - Después de confirmar la profundidad de la anestesia, haga una incisión de línea media de la piel para exponer el cráneo. Hacer dos agujeros de las rebabas con un taladro acoplado al aparato estereotáxicas en las coordenadas de vértice en el eje anteroposterior (AP): +0,1 mm, eje mediolateral (ML): +0,1 mm (referencia) y AP: mm −0.2, ML: +0,22 mm (corteza parietal izquierda)13.
- Limpie la piel con los enfoques sectoriales de algodón empapada en PBS, seguido por 70% etanol, solución de yodo. Haga una incisión longitudinal en el centro de la cabeza con unas tijeras para exponer la Lambda (el punto donde se unen la sagital y la sutura del lambdoid), el Bregma (punto de intersección de la sutura coronal por la sutura sagital) y la ubicación de destino.
- Identificar los puntos anatómicos como Bregma Lambda. Coloque la broca en el Bregma y nota la X, Y coordenadas para este punto.
- Un cerebro atlas libros o publicado referencias para determinar las coordenadas correspondientes de las regiones del cerebro para la grabación de EEG. A continuación, calcular las coordenadas de los tornillos (referencia y grabación) utilizando las coordenadas del vértice medido en el paso 2.5.2.
- Lentamente baje la broca para hacer un orificio de trépano siendo cuidadoso para evitar introducir la broca demasiado en el punto donde el cráneo se vuelve más delgado.
- Inserte el cuerpo del único canal inalámbrico transmisor EEG detrás de la nuca del cuello por vía subcutánea y lugar flexible conduce cerca del cráneo.
- Coloque un tornillo de acero inoxidable (2 mm de longitud) en cada orificio de trépano con pinzas y apretar con un destornillador por la rotación en sentido horario. Asegúrese de que el tornillo no se inserta demasiado muy profundo por el grado de rotación del tornillo de ajuste para evitar daños en la duramadre o de los tejidos del cerebro.
- Tira de la capa de aislamiento 2 mm desde la punta de las puntas y estirar el alambre lo suficiente para redondear el husillo para una buena conexión entre el cable y el tornillo. Conecte el conductor de referencia al tornillo delantero y la grabación para el tornillo en la corteza parietal. Luego, aplicar cemento dental para asegurar todo el conjunto en su lugar sin exponer las piezas de metal.
- Después de comprobar que el cemento dental haya secado por completo por la inspección visual, la sutura de la piel y aplicar ungüento de mupirocina tópica. Coloque el ratón en una incubadora de 30 ° C solo hasta que recupera de la cirugía (30 minutos). A continuación, volver el ratón a la estructura de la casa hasta que comience a monitoreo video-EEG continuo.
Nota: Después de la cirugía, cada ratón se inyecta (i.p.; aguja de 30 G y jeringa de 1 mL) con 5 mg/kg de gentamicina (antibióticos) y 5 mg/kg de ketoprofeno (analgésicos). Los animales deben ser vigilados hasta que se vuelvan totalmente ambulantes. Transmisor implantado ratones tienen un período de recuperación de aproximadamente 1 semana.
3. video y EEG monitoreo y análisis
- Colocar un ratón en una jaula individual y la jaula encima de las placas de receptor inalámbrico donde se instala la jaula de Faraday para evitar la interrupción de las señales eléctricas de cualquier fuente, incluyendo una computadora, las líneas de CA y receptores adyacentes.
Nota: Consulte el manual suministrado por el fabricante. Debe tenerse cuidado para evitar puntos ciegos. - Registran la actividad eléctrica usando el sistema de telemetría inalámbrica de vídeo-EEG.
- Abra el software de grabación de vídeo-EEG. Haga clic en "Hardware" y seleccionar "Editar configuración". Coincidir con el receptor y el transmisor implantado en cada ratón. Haga clic en "Configuración del canal" y confirmar que todos los canales están activos. Haga clic en "Configuración de vídeo" para sincronizar el vídeo con los datos de EEG (resolución de 480 x 40 y velocidad de fotogramas de 30.00).
Nota: Instalar una cámara IP con alta sensibilidad si es fundamental reunir cualidades de la buena imagen que pueden identificar cambios sutiles en el comportamiento de los ratones en la noche. - Haga clic en "Configuración" y "P3" entrada individual información animal, cámara emparejada y entorno gráfico.
- Haga clic en "Adquisición" y "A/D velocidad de muestreo" a velocidades de muestreo de la instalación. Haga clic en "nombre de conjunto de datos" para designar a cada experimento.
Nota: Muestreo para EEG debe ser mayor a 500 Hz. debido a la gran vídeo y tamaño de datos de EEG, se recomienda que sólo 24 horas de datos son manejadas por sesión en lugar de utilizar una continuo de 2 semana de grabación como un archivo. Datos se pueden guardar por separado a intervalos de 8 h o 12 h en caso de escasez de memoria RAM. - Activar el transmisor con una barra magnética y haga clic en "Iniciar adquisición" para recoger la grabación de vídeo-EEG. Monitorear continuamente el ratón por el sistema de video-EEG durante al menos 2 semanas.
Nota: Para los ratones C57BL/6, SRS tiende a ocurrir en racimos que pasado unos 5,2 días y la duración del período libre de convulsiones es de 6,7 días17.
- Abra el software de grabación de vídeo-EEG. Haga clic en "Hardware" y seleccionar "Editar configuración". Coincidir con el receptor y el transmisor implantado en cada ratón. Haga clic en "Configuración del canal" y confirmar que todos los canales están activos. Haga clic en "Configuración de vídeo" para sincronizar el vídeo con los datos de EEG (resolución de 480 x 40 y velocidad de fotogramas de 30.00).
- Determinar la frecuencia de las crisis y la duración por inspección manual utilizando el software de análisis.
- Marque el área mostrando SRS y exportar los datos para el análisis estadístico. Tener cuidado para excluir artefactos EEG que pueden ser generados por rascarse la cabeza o masticar; Estos pueden eliminarse por la comprobación de los datos de vídeo.
Nota: SRS se define como el inicio repentino de epileptiforme repetitiva actividad de clavar (≥ 3 Hz) que persiste por más de 10 s. comportamiento convulsivo puede ser acompañado con frecuencia con una ráfaga de actividad de clavar. No-convulsivas convulsiones también pueden demostrar actividades electrográficas clavaba sin comportamientos convulsivos. Terminación de convulsión se define como la que ocurre cuando las puntas de tiro volver a la actividad de base. - Para el análisis de frecuencia de las convulsiones, divida el número total de casos SRS detectados durante las 2 semanas por el número total de días de grabación para cada animal individual.
- Para el análisis de duración de la convulsión, medir el tiempo desde el inicio hasta el final de la epileptiforme clavar las actividades.
- Marque el área mostrando SRS y exportar los datos para el análisis estadístico. Tener cuidado para excluir artefactos EEG que pueden ser generados por rascarse la cabeza o masticar; Estos pueden eliminarse por la comprobación de los datos de vídeo.
- Después de la terminación de la grabación de vídeo-EEG, fije el cerebro con paraformaldehído al 4% por perfusión de transcardial. Para anestesiar el ratón, inyecta una solución (4:0.5) de ketamina (50 mg/mL) y xilacina (23,3 mg/mL) disuelto en solución salina a dosis de 10 μL/g de peso corporal (i.p.; jeringa de 1 mL aguja 26 G). Una vez que el ratón está confirmado para ser profundamente anestesiados, realizar la perfusión transcardial.
- Antes de aislar el cerebro de ratón, recuperar el transmisor en el ratón para su reutilización después de la limpieza.
- Retirar el cemento dental alrededor de los cables con unas pinzas.
- Moje la punta de los cables con cemento dental en acetona al 100% hasta que se disuelva el cemento dental.
- Eliminar contaminantes de tejido alrededor del transmisor, enjuague con agua destilada.
- Enjuague el transmisor con etanol al 70% para 3 h y el aire lo seque para almacenamiento. Inmediatamente antes del próximo uso, enjuague el tornillo y el transmisor con etanol al 70%, seguido de agua destilada y colocarlos en solución salina.
Nota: Debe tenerse cuidado para evitar cortar los cables flexibles al decapitar el ratón ya que, si los cables flexibles son muy cortos, el ruido en la próxima implantación y grabación de vídeo-EEG puede aumentar.
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Representative Results
Éxito SE pueden inducir la muerte celular hipocampal y SRS (figura 1 y figura 2). Había terminada conducta convulsiones agudas por diazepam inyectable a las 3 h después del inicio del SE y sacrificaron los ratones 7 días o 6 semanas más adelante.
Para la supervisión del vídeo-EEG, los ratones recibidos implantación cirugía en 4 semanas después de SE, y SRS casos fueron evaluados por 2 semanas de 5 a 7 semanas después del inicio SE.
La figura 1 muestra las muertes de células en el hipocampo evaluado por tinción violeta de cresilo. A los 7 días después de SE, células pyknotic fueron detectadas en las regiones hiliares (figura 1anuncio) del giro dentado y la capa de células piramidales del subcampo CA3 del hipocampo (figura 1Af), mientras que intacto hipocampo se observó en los animales de sham inyectados con solución salina en lugar de pilocarpina (Aa-cde lafigura 1). Curiosamente, animales que experimentaron convulsiones múltiples, pero no entrar en SE, no demostrada muerte celular en la región hiliar o la capa de células piramidales (Ag-ide lafigura 1). A 6 semanas después de SE, se observó una reducción marcada en el número de células hilar (Bmde lafigura 1). Además, se observó pérdida neuronal en el CA1 (figura 1Bn) y CA3 regiones (figura 1Bo).
La figura 2 muestra los rastros representativos del EEG en la farsa y SE grupos (figura 2A). En comparación con el grupo sham mostrando actividad eléctrica fisiológica, el grupo mostró en ocasiones descargas epileptiformes acompañadas de comportamientos convulsivos. La ubicación de los electrodos epidurales se ilustra en la figura 2C. Figura 2 B se muestra un ejemplo de los ruidos eléctricos de un monitor adyacente y el fracaso de la colección de la señal. Hemos demostrado también rastros de EEG de animales manipulados de farsa que presentaron crisis convulsivas espontáneas durante las 2 semanas de grabación de vídeo-EEG (figura 2E) y encontraron lesiones corticales en perfusión, posiblemente derivada de la colocación excesivamente profunda de los tornillos de la epidurales (figura 2D).
Figura 1 : Muerte neuronal en el hipocampo inducida por la pilocarpina SE. Imágenes representativas de los grupos de (A) 7 días y (B) 6 semanas después de la inyección de pilocarpina o solución salina. Magnifica las imágenes muestran el hilio (a, j), subcampo CA1 (b, k) y subcampo CA3 (c, l) del grupo impostor tratados con solución salina, el hilio (d, m), subcampo CA1 (e, n) y el subcampo CA3 (f, oh) del grupo SE y el hilio (g), subcampo CA1 (h) y subcampo CA3 () de los ratones que desarrollan las flechas SE. Black , g, y j indicar algunas de las células representativas de hilar, y puntas de flecha en d y m indican células picnóticos. Barra de escala en la parte inferior izquierda = 200 μm, válida para toda la izquierda mayoría columna, barra de escala en a y c = 20 μm, válido para la columna medio entera y columna de la derecha. Abreviaturas en esta figura: CA1, CA3: Cornu Ammonis hippocampal subcampos; DG: Convolución del cerebro dentada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Grabación de vídeo y EEG muestra convulsiones recurrentes espontáneas en el ratón epiléptico. (A) representante EEG rastros de sham-(arriba) y SE manipulan animales (abajo). Tenga en cuenta que animales sometidos mostrará clavar actividad epileptiforme (≥ 3 Hz), no exhibieron animales de farsa. (B) una imagen representativa de ruidos eléctricos y falta de la colección de la señal. Tenga en cuenta la unipolar picos de gran amplitud y la discontinuación de las señales eléctricas. (C) dibujo esquemático del cerebro de ratón con la ubicación de los electrodos. (D) dos imágenes que muestran el cerebro intacto y lesionado en la corteza, posiblemente debido a la excesivamente profunda inserción de los tornillos epidurales. La flecha negra en la imagen de la derecha indica el sitio de daño cortical. Barra de escala = 250 μm. (E) representante EEG los rastros de animales manipulados simulada con o sin lesión cerebral. Observe que farsa manipulada animales con lesión cortical generaron actividad spiking y SRS convulsivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo describe los procedimientos experimentales para la inducción SE y la evaluación de convulsiones crónicas.
Varios factores afectan la inducción SE éxito. Control conductual preciso según la escala de Racine es fundamental para el desarrollo de SRS. Cabeceo, clonus del forelimb, alzarse y caer busquen el comportamiento de las convulsiones agudas en fase SE4,16. Una vez que se detectaron la primera crisis del motor, disminuye la longitud del intervalo entre las crisis convulsivas más tarde antes de entrar en SE. Por otra parte, SE debe mantenerse durante al menos 6 h convulsiones conductuales se revocada por diazepam5. Cabe destacar que los investigadores deben ser conscientes de la posibilidad de que sufrió convulsiones actividades pueden detectarse a través de electrocorticograms, aunque comportamiento convulsiones parecen disminuir con la inyección de diazepam. Aumento de temperatura después de la inyección de pilocarpina hasta que la inducción puede mejorar considerablemente el número de animales con SE. También es importante a la atención intensiva posterior convulsión, incluyendo suficiente hidratación, soporte nutricional y el peso control de tasas de supervivencia más altas que alrededor del 70-80% en promedio5,18. Según antecedentes genéticos del animal, puede ser diferente susceptibilidad a la pilocarpina. Si los animales Mostrar convulsiones agudas graves con alta mortalidad, la reducción de la dosis de pilocarpina, SE duración, o aumento de escopolamina y terbutalina puede ser útil. Mientras que SE grave es conocido por ser relacionados con mayor incidencia de SRS, con mayor mortalidad, es crucial para tener en cuenta estos factores. Muerte neuronal hippocampal se observa consistentemente después de SE. En 6 h post-SE, pérdida extensa de interneuronas hilar ha sido reportados19. A los 7 días después de SE, neuronas piramidales en el subcampo CA3 normalmente mueren y continuamente se observan a las 6 semanas después de la inducción SE, aunque el grado de daño neuronal en la capa de células piramidales es variable en los ratones. La pérdida neuronal en el subcampo CA1 del hipocampo también se puede observar con frecuencia. Curiosamente, los animales con convulsiones múltiples que no entran SE demostró hipocampo casi intacta similar al grupo simulado, que indica la muerte celular histologic puede ser un buen marcador de las convulsiones agudas lo suficientemente graves.
En aproximadamente 4 semanas después de SE, todos los ratones C57BL/6NHsd tratados con pilocarpina se convirtió en epilépticos y mostró SRS, demostrando uno de los principales méritos usando este modelo. Puesto que las convulsiones crónicas están agrupadas, el vídeo-EEG debe registrarse continuamente durante al menos 2 semanas en lugar de forma intermitente, a pesar de que el período de grabación puede ser modificado dependiendo de las cepas de ratón o fines experimentales17. Por otra parte, asimientos espontáneos en ELT tienen variaciones diurnas que demuestran alta frecuencia SRS en el atrasado por la tarde20. Prácticamente, para la grabación de vídeo-EEG precisa, fuentes incluyendo líneas AC, computadoras, cámaras fotográficas o transmisores implantados en el ratón en el lado receptor necesitan bloquearse. La instalación de las cámaras con alta sensibilidad y jaula de Faraday durante el día y la noche puede disminuir el ruido eléctrico y ayudar a identificar generalizado asimientos crónicos, respectivamente. Finalmente, es muy importante evitar daño cerebral cuando los tornillos se colocan en la superficie de la duramadre ya que puede generar datos de EEG engañosos. Aunque la frecuencia SRS no era alta, las lesiones corticales mecánicas por inserción forzada tornillo podrían generar asimientos convulsivos en sólo una semana.
En conclusión, a pesar del tiempo las restricciones para el modelado y el requisito de formación exhaustiva para realizar implantación cirugías y análisis de EEG, el SE inducida por la pilocarpina es uno de los mejores modelos para el estudio de epilepsia crónica entre los animales disponibles en la actualidad modelos de ELT. Aquí, describimos un método SE induce después de la inyección de pilocarpina y la evaluación de convulsiones crónicas mediante un sistema de video-EEG telemetría inalámbrica. Creemos que este protocolo puede proporcionar información detallada de modelos animales adecuados para epilepsia crónica y la epileptogénesis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la subvención de la National Research Foundation de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (NRF-2014R1A1A3049456) y una beca de la Corea salud tecnología R & D Project a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y asistencia social, República de Corea (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
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