Summary
Bu el yazması sistemik Pilokarpin enjeksiyonu ile durum Epileptikus inducing ve canlı hayvan bir radyo telemetri video ve electroencephalogram sistemi kullanarak tekrarlayan spontan ele geçirme vakaları izleme yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı kronik epilepsi, epileptogenesis ve akut nöbetleri Etyopatogenezi mekanizmaları eğitim için yararlı olabilir.
Abstract
Temporal lob epilepsi (TLE) yetişkinlikte ortak bir nörolojik bozukluk var. Kronik epilepsi translasyonel çalışmaları Pilokarpin kaynaklı durumu Epileptikus (SE) sık sık tekrarlayan spontan nöbetler (SRS) özetlemek için seçilir. Burada bir protokol SE indüksiyon Pilokarpin mayi (IP) enjeksiyon ve ele geçirme vakalarının kronik yinelenen bir radyo telemetri video ve electroencephalogram (EEG) sistemi kullanarak canlı hayvanlarda izleme mevcut. Biz Pilokarpin enjeksiyon ve Hipokampal nöronal kayıp onların korelasyon 7 gün ve 6 hafta sonrası Pilokarpin sonra dikkat edilmesi gereken önemli davranış değişiklikleri gösterdi. Ayrıca video ve EEG kaydı elektrot implantasyonu deneysel prosedürler ve frekans analizi ve Kronik Nükseden nöbet süresi açıklar. Son olarak, biz neden beklenen sonuçları her durumda elde değil olası nedenler tartışıyorlar. Bu fareler ve sorun giderme yönergeleri kronik epilepsi modelleme temel bir genel bakış sağlar. Bu iletişim kuralı kronik epilepsi ve epileptogenesis uygun modelleri için bir temel olarak hizmet verebilir inanıyoruz.
Introduction
TLE en yaygın Edinsel epilepsies1biridir. İnsanların epilepsi ile beyin2,3' te anormal nöron faaliyetleri sonucunda tekrarlayan nöbetleri deneyim. TLE kez zorlu verilen bu, epilepsi gelişimi temel temel mekanizmaları anlamak çok önemlidir.
İnsan TLE temel özelliklerini özetlemek hayvan modelleri TLE patofizyolojisi, bize kolayca izlemek ve epileptogenesis kritik faktörler işlemek için izin daha iyi beğenisine sunmaktadır. Bunlar arasında yaygın olarak kullanılan4,5SE chemoconvulsants kaynaklı olmuştur. Hiçbir Hipokampal skleroz ve sağlam SRS6,7,8, gösteren elektriksel stimülasyon gibi diğer epilepsi modellerin aksine chemoconvulsants sistemik enjeksiyon insan TLE klinik patogenezinde taklit edebilen, Yani, ilk beyin hasarı, bir gizli süresini ve kronik bir epileptik tezahür SRS5,9,10sahne. Bu nedenle, bu teknik akut beyin hasarı, epileptogenesis veya nöbet bastırma mekanizmaları açıklayan çeşitli çalışmalarda yararlı olabilir. Ayrıca, histopatolojik değişiklikler chemoconvulsants tarafından indüklenen TLE kemirgen modelleri10,11,12kullanımı için ek bir mantığı sağlayarak insan TLE görülen benzer. Özellikle, yapısal hasar oluşur içeren sürekli olarak her iki kainic asit ve Pilokarpin-kaynaklı SE modelleri yeniden. Ancak, kainic asit enjeksiyon için karşılaştırıldığında, Pilokarpin modeli farelerde kronik epilepsi transgenik fare hatları5, geniş durumu göz önünde bulundurarak eğitim için oldukça büyük avantajlar sunan daha sağlam SRS üretebilir 13 , 14 , 15. epilepsi Pilokarpin modelinin etkin kullanımı için ek kanıt sağlamaktadır bunların yanında nöbet ilerleme sonra Pilokarpin enjeksiyon kainic asit modeli, genellikle daha hızlıdır.
Burada, biz bir yöntemi inducing se Pilokarpin ı.p. enjeksiyonla ve video ve EEG kronik epilepsi izleme gerçekleştirerek göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel yordamlar Kore Katolik Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (NIH Yayınları No. 80-23) için Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. SE indüksiyon
- 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6NHsd fare satın almak ve her fare tartın. Sonra tüm fareler SE indüksiyon sırasında onların kolay tanımlanması için kuyruk işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
- Skopolamin metil bromür (Skopolamin; 2 mg/kg) miktarını hesaplamak, terbutalin hemisulfate (terbutalin; 2 mg/kg) ve fare göre Pilokarpin hidroklorür (Pilokarpin; 280 mg/kg) ağırlık ve serum fizyolojik (%0.9 NaCl, 10 mL/kg) çözümleri yapmak için ekleyin.
Not: Örneğin, fare ağırlık 25 g ise, aşağıdaki miktarlarda uygulanır: Skopolamin ve terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1000 g) = 0.05 mg, serum fizyolojik: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) 0.25 mL, Pilokarpin =: 280 mg/kg * (25 g/1000 g) = 7 mg , Serum fizyolojik: 10 mL/kg * (25 g/1000 g) 0.25 mL =. - 1 mL şırınga Skopolamin ve terbutalin karışımı 30 G iğne ile yükleyin. Çözüm intraperitoneally her fare enjekte ve fareler için onların kafes dönün. Skopolamin ve terbutalin yönetim sonra 30 dk Pilokarpin çözüm her fare (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) enjekte. Hemen Pilokarpin enjeksiyon sonra farelerin gözlem için bir kuluçka (28-30 ° C) yerleştirin.
- SE indüklenen kadar dikkatle fareler davranışını izleyin. Sahne 3 veya üstü Racine'in ölçeğine göre karşılık limbik motor nöbetler algıladıysa, zaman kayıt ve nöbetler daha sık olarak ortaya çıkan olup olmadığını belirlemek için fare izlemek. Sürekli motor nöbetler daha--dan 2 dk son kez, oda sıcaklığında yeni bir kafeste fareyi getirin ve 3 h için onların Kasılan nöbetler devam ve SE bağlı olup olmadığını belirlemek izleme tutun. Girmek için başarısız fareler ötenazi SE 2 h sonra Pilokarpin enjeksiyon.
Not: Racine'in ölçek; 1. aşama, ağız ve yüz hareketi; Aşama 2, baş başını sallayarak; Sahne 3, forelimb clonus; evre 4, forelimb clonus ile yetiştirme; Sahne 5, yetiştirme ve forelimb clonus16ile düşüyor. Eğer fare kafesi oda sıcaklığında sonra hemen SE indüksiyon aktarılmaz, fare Hipertermi nedeniyle ölebilir. - 3 h davranış akut nöbetleri sonra SE başlangıçlı diazepam çözüm (ı.p. 10 mg/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne) enjekte edilerek sonlandırın. Diazepam çözüm % 10 polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı diazepam 5 mg/mL serum fizyolojik (ı.p. 10 mL/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne) ekleyerek sulandrarak olun.
Not: % 10 polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı çözüm: 1 mL polyoxyl 35 hidrojene Hint yağı çözüm + 9 mL serum fizyolojik. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın. Fare vücut ağırlığı 25 g ise, örneğin, diazepam çözüm 250 µL enjekte: 50 µL diazepam 5 mg/mL + 200 µL % 10 polyoxyl 35 hidrojene castor oil çözüm 250 µL 1 mg/mL diazepam =. - Sham fareler için Skopolamin metil bromür ve terbutalin hemisulfate karışımı bir ı.p. enjeksiyon gerçekleştirmek (ı.p.; her iki 2 mg/kg, 10 mL/kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne). 30 dk sonra intraperitoneally serum enjekte (ı.p. 10 mL/kg 1 mL şırınga; 30 G iğne).
Not: Eğer fare vücut ağırlık 25 bin 250 µL serum Pilokarpin yerine enjekte et. - Diazepam enjeksiyon (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) sonra % 5 dekstroz bireysel fare (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne) başına 1 mL yönetmek.
Not: 1 mL %5 dekstroz enjeksiyonu enerji kaynağı ve sağkalım oranı artırabilir nemlendirme sağlar. - Kuluçka (28-30 ° C) sonrası bakım sırasında aşırı salgıları tükürük, gözyaşı ve dışkı gibi yok etmek.
- 1 gün sonra SE indüksiyon, fareler tartmak ve fazladan bir gün için kuluçka (28-30 ° C) saklayın. Gün 2, sonra SE indüksiyon, fareler tartmak ve ev onların kafes getirin. Onların kurtarma kolaylaştırmak için nemli chow sağlar.
Not: Bu deneyde, C57BL/6NHsd için ölüm oranı SE feshinden sonra %8,57 ortalama (3 test 35 farelerin) idi. - Günlük vücut ağırlığı hayvanların 7 gün sonrası Pilokarpin kadar ölçmek ve fare % 5 dekstroz (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne) enjekte ne zaman vücut ağırlığı değil artmıştır. Fareler vücut ağırlığı yeniden elde etmek ve 2 gün sonra Pilokarpin enjeksiyon, nemli chow zorluk olmadan tüketmek başladığımızda vücut ağırlığı izlemesini durdurun.
Not: Bir farenin vücut ağırlığını 7 gün sonrası SE kadar artmamıştır, fare deneyden dışlamak ve karbon dioksit tarafından ötenazi. Fare arka plan bağlı olarak, zaman zaman ölüm meydana gelebilir; Ancak, C57BL/6NHsd söz konusu olduğunda, bu deneylerde fare az % 1 öldü. 7 günden daha uzun bir süre sonra SE indüksiyon yaşama ile fareler nadiren gizli döneminde ölmek.
2. implantasyonu ameliyatı Video-EEG izlemek için
- 12-hafta-yaşlı fareler (4 hafta sonra SE indüksiyon) EEG izlemek için telemetri implantasyon gerçekleştirmek için hazır olun.
Not: İmplantasyon zamanlaması deneysel amaçlar ve fare suşları bağlı olarak değiştirilebilir. - Ameliyattan önce fare (4:0.5) ketamin (50 mg/mL) ve karışımı bir doz 2,5 µL/g vücut ağırlığı (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne), serum içinde çözünmüş xylazine (23,3 mg/mL) çözüm ile anestezi. Düzenli aralıklarla (15dk aralığı en fazla) monitör solunum hızı ve fare solunum çaba ve anestezi derinliği pedal çekilme refleks tarafından değerlendirmek.
- Kulak Bar ve bir ısırık plaka ile stereotaksik çerçevesindeki fareyi getirin ve veteriner merhem körlüğü önlemek için her iki gözde uygulayın.
- Ameliyat sırasında steril koşullar korumak için cerrahi siteleri jilet kullanarak tıraş. Cerrahi alan kürk kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun. Tıraştan sonra cilt %70 etanol ve iyot çözeltisi ile dezenfekte.
Not: Cerrahi steril eldiven ve steril ekipmanları ve aseptik teknikler kullanarak maskeleri, aseptik bir şekilde yapılmalıdır. - Anestezi derinliği onayladıktan sonra kafatası ortaya çıkarmak için deri bir ensizyon olun. İki burr deliği ile hastanın eksenindeki (AP) Bregma koordinatları stereotaksik aparatı için ekli bir tatbikat yapmak: +0.1 mm, medyolateral eksen (ML): +0.1 mm (başvuru) ve AP: −0.2 mm, ML: +0.22 mm (sol parietal korteks)13.
- PBS batırılmış pamuk swap, % 70 etanol ve iyot çözüm tarafından takip ile cildinizi silin. Boyuna kesik başından ortasında makasla Lambda (sagittal ve lambdoid dikiş buluştuğu nokta), Bregma (koronal sütür sagittal dikiş tarafından kesişim noktası) ve hedef konumu göstermek için yapmak.
- Lambda ve Bregma gibi anatomik simge yapılara tanımlayın. Konumlandırmak matkap Bregma ve Not X, Y koordinatları için bu nokta.
- Bir beyin atlas defterleri kullanıyorsanız veya beyin bölgeleri EEG kaydı için uygun koordinatlarını belirlemek için başvurular yayınlandı. Sonra vida (başvuru ve kayıt) koordinatlarını hesaplamak Bregma koordinatları kullanarak ölçülen 2.5.2 adımda.
- Matkap biraz fazla ileri nereye kafatası incelir noktada ekleme önlemek için dikkatli olmak bir burr delik açmak için matkap yavaşça indirin.
- Tek kanal gövdesi EEG verici ense boyun arkasında subkutan kablosuz ve esnek yer ekle kafatası yol açar.
- Paslanmaz çelik vida (2 mm Uzunluk) cımbızla her burr deliğe yerleştirin ve saat yönünde döndür tarafından bir tornavida kullanarak sıkın. Vida beyin zarı veya beyin doku hasarı önlemek için çok çok derine vida dönme derecesi ayarlayarak eklenmez emin olun.
- Yalıtım kat neden ucundan 2 mm şerit ve tel tel ve vida arasında iyi bir bağlantı için vida mili yuvarlamak yeterince germek. Başvuru Kurşun açık vida ve parietal korteks içinde vida kayıt adayına bağlayın. Daha sonra tüm montaj yerinde metal parçalar maruz kalmadan güvenliğini sağlamak için diş çimento uygulayın.
- Diş çimento görsel denetim tarafından tamamen kurudu doğruladıktan sonra deri dikiş ve topikal mupirocin merhem uygulamak. Cerrahi (yaklaşık 30 dk) normale dönene kadar fareyi 30 ° C kuluçka makinesine yalnız getirin. Video-EEG sürekli izlenmesi başlayana kadar sonra fare ev kafese dönelim.
Not: 5 mg/kg gentamisin (antibiyotik) ve 5 mg/kg ketoprofen (ağrı kesici) ile ameliyat sonrası (ı.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne) her fare enjekte edilir. Tam olarak ayakta olana hayvanlar izlenmelidir. Verici implante fareler bir iyileşme süresi yaklaşık 1 hafta var.
3. video ve EEG izleme ve analiz
- Bireysel bir kafes içinde bir fare yerleştirin ve Faraday kafesi kesinti, bir bilgisayar, AC çizgiler ve bitişik alıcıları herhangi bir kaynaktan alınan elektrik sinyalleri önlemek için yüklendiği kafes kablosuz alıcı plakalar üzerine yerleştirin.
Not: Üreticinin sağladığı el kitabına bakın. Kör noktalar uzak durmaya özen göstermelidir. - Kablosuz video-EEG telsiz sistemi kullanarak elektrik etkinliklerini kaydetmek.
- Video-EEG kayıt yazılımı açın. "Donanım"'ı tıklatın ve "yapılandırma Düzenle" yi seçin. Alıcı ve verici her fare implante maç. "Yapılandırma kanal" tıklatın ve tüm kanallar etkin olduğunu doğrulayın. Tıklayın "Video yapılandırma" video EEG veri (kararlılık-in 40 x 480 ve kare hızına olan 30,00) ile eşitlemek için.
Not: Eğer ince davranış değişiklikleri farelerin geceleri tanımlayabilirsiniz iyi görüntü kaliteleri toplamak için kritik bir IP kamera ile yüksek hassasiyet yükleyin. - Tıkırtı "Tertibat" ve "P3 kurulumunu" giriş bireysel hayvan bilgi, eşleşen kamera ve grafik ayarı.
- "Satın alma" ve "A/D örnekleme oranı" Kur örneklendirme oranı için'ı tıklatın. Tıklayın "veri kümesi adı" her deney belirlemek için.
Not: EEG için örnekleme hızını büyük video ve EEG veri boyutu nedeniyle 500 Hz. daha yüksek olması gerekir, sadece tavsiye edilir 24 saat veri oturum başına işlenmesini sürekli bir 2-hafta kayıt tek bir dosya kullanarak yerine. RAM bellek yetersizliği durumunda 8 h veya 12 h aralıklarla veri ayrı ayrı saklanabilir. - Manyetik bir çizgiyle verici etkinleştirmek ve "satın alma Başlat" video-EEG kaydı toplamak için. Sürekli fare video-EEG sistemi tarafından en az 2 hafta için monitör.
Not: C57BL/6 fareler için SRS kümelerde son yaklaşık 5.2 gün ve nöbet ücretsiz dönemi süresi yaklaşık 6.7 gün17yaşında meydana gelme eğilimi.
- Video-EEG kayıt yazılımı açın. "Donanım"'ı tıklatın ve "yapılandırma Düzenle" yi seçin. Alıcı ve verici her fare implante maç. "Yapılandırma kanal" tıklatın ve tüm kanallar etkin olduğunu doğrulayın. Tıklayın "Video yapılandırma" video EEG veri (kararlılık-in 40 x 480 ve kare hızına olan 30,00) ile eşitlemek için.
- Nöbet sıklığı ve süresi analiz yazılımı kullanarak el ile incelemesi tarafından belirler.
- SRS gösterilen alanını işaretlemek ve istatistiksel analizleri için veri verme. Kafa çizilmemesi veya çiğneme tarafından oluşturulan EEG eserler dışlamak için dikkatli olun; Bunlar-ebilmek var olmak çıkarmak video verileri kontrol ederek.
Not: SRS ani tekrarlayan epileptiform aktivite spiking tanımlanır (≥ 3 Hz) devam ederse 10'dan fazla s. Kasılan davranışlarını sık etkinlik spiking bir patlama ile eşlik edilebilir için. Sigara Kasılan nöbetler de sarsıcı davranışlar olmadan electrographic spiking faaliyetleri kanıtlamanın. Nöbet fesih ateş sivri temel etkinlik için döndüğünüzde meydana gelen olarak tanımlanır. - Nöbet frekans analizi için kayıt gün bireysel her hayvan için toplam sayısı 2 hafta boyunca tespit SRS durumlarda toplam sayısına bölün.
- Nöbet süresi analiz için başlangıç zaman faaliyetleri spiking epileptiform sonuna ölçmek.
- SRS gösterilen alanını işaretlemek ve istatistiksel analizleri için veri verme. Kafa çizilmemesi veya çiğneme tarafından oluşturulan EEG eserler dışlamak için dikkatli olun; Bunlar-ebilmek var olmak çıkarmak video verileri kontrol ederek.
- Video-EEG kaydı tamamlandıktan sonra beyin transcardial perfüzyon tarafından %4 paraformaldehyde ile düzeltmek. Fare anestezi için bir çözüm (4:0.5) ketamin (50 mg/mL) ve serum bir doz 10 μL/g vücut ağırlığı (ı.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne), çözünmüş xylazine (23,3 mg/mL) enjekte. Fare derin anestezi onaylandıktan sonra transcardial perfüzyon gerçekleştirin.
- Fare beyin izole önce verici temizlik sonra yeniden kullanmak üzere fare al.
- Forseps kullanarak müşteri adaylarını etrafında diş çimento kaldırın.
- Diş çimento eriyene kadar diş çimento ile potansiyel müşteriler ucu % 100 aseton içinde bekletin.
- Verici etrafında doku kirletici distile su ile durulama tarafından kaldırın.
- Durulama verici 3 h ve hava için % 70 etanol ile depolama için kuru. Hemen önce sonraki kullanım, vida ve verici % 70 etanol, distile su tarafından takip ile durulayın ve salin koyun.
Not: Ne zaman beri fare esnek yol çok kısa iseniz decapitating, sonraki implantasyon ve video-EEG kaydı gürültü artış esnek kablo kesme önlemek için özen göstermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı SE Hipokampal hücre ölümü ve SRS (Resim 1 ve Şekil 2) neden olabilir. Biz SE başlangıçlı sonra 3 h diazepam enjeksiyonla davranış akut nöbetleri sonlandırıldı ve fareler 7 gün veya 6 hafta sonra kurban.
Video-EEG izlenmesi, alınan fareler 4 hafta sonra SE, cerrahi implant ve SRS durumlarda 5-7 hafta sonra SE başlangıçlı 2 hafta boyunca değerlendirildi.
Şekil 1 Kresil Menekşe boyama tarafından değerlendirildi Hipokampus hücre ölümleri gösterir. Sağlam Hipokampus gözlendi, ancak SE sonra 7 gün pyknotic hücreleri dentat gyrus ve Hipokampus (şekil 1Af), CA3 alt piramit hücre tabakası, göbek bölgelerinde (şekil 1reklam) tespit edildi Pilokarpin (şekil 1Aa-c) yerine serum enjekte sham hayvanlarda. İlginçtir, birden fazla nöbetler, yapılan hayvan ama başarısız girmek SE, göbek bölgesi veya piramit hücre Katmanı (şekil 1Ag-i) hiçbir hücre ölümü gösterdi. SE sonra 6 hafta hilar hücreleri (şekil 1Bm) sayısında belirgin bir azalma gözlendi. Buna ek olarak, CA1 nöronal kaybı gözlendi (şekil 1milyar) ve CA3 (şekil 1Bo) bölgeler.
Şekil 2 temsilcisi EEG izlemeler sham ve SE grup (Şekil 2A) gösterir. Fizyolojik elektrik faaliyet gösteren sahte grubuna göre SE grup bazen sarsıcı davranışlar ile eşlik epileptiform deşarj gösterdi. Epidural elektrot yerlerini Şekil 2' deCgösterilmiştir. Resim 2 B bitişik bir monitör gelen elektrik sesler örneği ve sinyal koleksiyonu başarısızlık gösterir. Biz de spontan nöbetler sırasında 2 hafta video-EEG kayıt (Şekil 2E) gösterdi ve kortikal yaralanmaları perfüzyon, muhtemelen aşırı derin yerleşim türetilmiş bulunan sahte manipüle hayvanlar EEG izleri gösterdi epidural vida (Şekil 2D).
Resim 1 : Hippocampus nöronal ölümünde sonra Pilokarpin kaynaklı SE. 7 gün grupları(a)ve (B) 6 hafta sonra Pilokarpin veya serum enjeksiyon temsilcisi görüntülerden. Büyütülmüş resimleri göster hilus (bir, j), (b, k), CA1 alt alan ve CA3 alt alan (c, m) Serum tedavi sahte grubunun, hilus (d, m), CA1 alt alan (e, n) ve CA3 alt alan (f, o) SE grup ve hilus (g), CA1 alt alan (h) ve SE. siyah okları , g, ve j geliştirmek mi fareler CA3 alt (ı) temsilcisi hilar hücrelerinin bir kısmını gösterir ve ok uçları d ve m pyknotic hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu içinde belgili tanımlık dip sol yan 200 µm, sol sütun, ölçek çubuğunda en tüm geçerli = a ve c = 20 µm, tüm orta sütunda ve sağ sütun için geçerlidir. Bu rakam kısaltmalar: CA1, CA3: Cornu Ammonis Hipokampal alt alanlar; DG: Dentat gyrus. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Video ve EEG kaydı gösterir tekrarlayan spontan nöbetler epilepsi fare. (A)temsilcisi EEG izleri sahte-(üst) ve SE manipüle hayvanlar (altta). SE-tabi hayvanlar epileptiform aktivite spiking göstermek Not (≥ 3 Hz), sham hayvanlar tarafından sergilenen değil. (B) A temsilcisi görüntü sinyali koleksiyonunun elektrik sesler olup olmadıklarını. Not yüksek genlik tek kutuplu sivri ve elektrikle ilgili sinyal kesilmesi. (C) şeması fare beyni elektrotlar konumlarıyla çizim. (D) iki resim büyük olasılıkla aşırı derin ekleme epidural vidalar nedeniyle kortekste bozulmamış ve yaralı beyin gösterilen. Doğru resimdeki siyah oku kortikal hasar sitesi gösterir. Ölçek çubuğu 250 µm. (E) temsilcisi EEG izleri sham manipüle hayvanlar ya da beyin hasarı olmadan =. Sham manipüle hayvanlarla kortikal yaralanma spiking etkinlik ve sarsıcı SRS oluşturulan unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu eser SE indüksiyon ve kronik nöbetler değerlendirilmesi için deneysel yordamlar açıklanır.
Çeşitli faktörler başarılı SE indüksiyon etkiler. Doğru davranış Racine ölçeğin göre izleme SRS gelişimi için önemlidir. Baş başını sallayarak, forelimb clonus, yetiştirme ve düşen davranış akut nöbetleri SE faz4,16geliştirme özellikleridir. İlk motor nöbet algılandığında, girmeden önce daha sonra Kasılan nöbetler arasındaki aralığın uzunluğunu azaltır SE. Ayrıca, davranış nöbetler diazepam5tarafından sonlandırılır sürece SE en az 6 h için sürekli. Bu araştırmacılar davranış nöbetler diazepam enjeksiyon ile çökmek gibi görünüyor olsa bile bu faaliyetleri electrocorticograms yolu ile tespit edilebilir nöbet sürekli olasılık bilmeniz gereken dikkati çekiyor. SE indüksiyon büyük ölçüde SE hayvanlarla sayısını artırabilir kadar ortam sıcaklığı Pilokarpin enjeksiyon sonra artan. Yeterli hidrasyon, beslenme desteği ve ağırlığı yaklaşık % 70-80 daha yüksek sağkalım oranları için ortalama5,18izleme gibi yoğun sonrası nöbet bakım sağlamak önemlidir. Hayvanın genetik arka plan bağlı olarak, duyarlılık Pilokarpin farklı olabilir. Hayvanlar yüksek mortalite ile şiddetli akut nöbetleri görüntülerseniz, Pilokarpin dozaj, SE süresi, veya artan Skopolamin ve terbutalin azaltılması yararlı olabilir. Şiddetli SE SRS, ilgili daha yüksek insidansı yüksek mortalite ile olduğu bilinmektedir iken bu faktörlerin dikkate almak önemlidir. Hipokampal nöronal ölümler sürekli SE sonra gözlenir. 6 h mesaj-SE, hilar interneurons kapsamlı kaybı bildirilen19olmuştur. 7 gün sonra SE, CA3 alt alan piramidal nöronların genellikle ölmek ve piramidal hücre katmanı içinde nöronal hasar ölçüde değişken farelerde olmasına rağmen sürekli olarak 6 hafta sonra SE indüksiyon, gözlenir. Hipokampüs CA1 alt nöronal kaybına da sık sık görülebilir. İlginçtir, hayvanlar girmeyin birden fazla nöbet ile SE neredeyse bozulmamış Hipokampus sham grubuna benzer gösteren histolojik hücre ölümüne yeterince şiddetli akut nöbetlerin iyi bir işaret olabilir gösterdi.
Yaklaşık 4 hafta sonra SE, tüm Pilokarpin tedavi C57BL/6NHsd fareler epileptik oldu ve gösterdi SRS, Binbaşı birini gösteren bu modeli kullanarak yararları. Kronik nöbetler kümelenir beri rağmen kayıt dönemi fare suşları veya deneysel amaçlar17bağlı olarak değiştirilebilir video-EEG sürekli olarak en az 2 hafta yerine zaman zaman, kaydedilmiş olmalıdır. Ayrıca, spontan nöbetler TLE diurnal varyasyonları yüksek SRS frekansa geç öğleden sonra20gösteren var. Pratik olarak, doğru video-EEG kaydı, AC çizgiler, bilgisayarlar, kameralar veya bitişik alıcı fare implante vericileri herhangi bir kaynaktan engellenmesi gerekir. Faraday kafesi ve fotoğraf makinesi yüksek hassasiyet ile yüklenmesi sırasında gece ve gündüz elektriksel gürültü düşürebilir ve tanımlamak için yardım kronik nöbetler, sırasıyla Genelleştirilmiş. Son olarak, yanıltıcı EEG verisi oluşturabilirsiniz gibi vidaları dura mater yüzeyine yerleştirilmiştir beyin hasarı önlemek son derece önemlidir. SRS frekans yüksek olmasına rağmen herhangi bir mekanik kortikal yaralanma zorla vida ekleme tarafından sadece bir hafta içinde Kasılan nöbetler yaratacaktır.
Sonuç olarak, kısıtlamaları modelleme ve gerçekleştirmek için derinlemesine eğitim şartı ameliyatları ve EEG analiz implant rağmen Pilokarpin kaynaklı SE şu anda mevcut hayvan arasında kronik epilepsi çalışmak için en iyi modellerinden birini tam zamanı TLE modelleri. Burada, bir yöntemi inducing se Pilokarpin enjeksiyon ve kronik nöbetler kablosuz telsiz video-EEG sistemi kullanarak değerlendirmek sonra açıklanmaktadır. Bizce bu protokole uygun hayvan modellerinde kronik epilepsi ve epileptogenesis için ayrıntılı bilgiler sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Kore hükümeti (NMK-2014R1A1A3049456) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) hibe ve Kore sağlık teknoloji R & D proje Kore sağlık sanayi geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla bir hibe tarafından desteklenen, Sağlık Bakanlığı ve refah, Kore Cumhuriyeti (HI15C2854) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
