Summary
Вирусная transcriptional фабрики являются дискретные структуры, которые обогащаются с клеточной РНК-полимераза II для увеличения вирусных генов транскрипции во время повторной активации. Здесь описан способ найти сайты активно переписывание вирусный хроматина в трехмерном пространстве ядерного сочетанием иммунофлюоресценции окрашивание и в situ гибридизация РНК.
Abstract
Хорошо известно, что пространственным и временным регулирования генов является неотъемлемой частью управляющих экспрессии генов надлежащего. Следовательно это бесценный понять, где и когда транскрипции проходит в рамках ядерных пространства и визуализировать отношения между episomes, инфицированных в пределах той же клетке ядра. Здесь, были иммунофлюоресценции (IFA) и РНК-рыба combinedto определить, активно переписывание episomes саркома Капоши связанные герпеса (KSHV). По окрашиванию KSHV задержка связанные ядерного антигена (LANA), можно найти, где существуют вирусных episomes в ядре. Кроме того путем разработки РНК-FISH зондов для региона Интрон вирусный гена, который выражается только во время продуктивной инфекции, транскриптов РНК могут быть расположены. С помощью этой комбинации молекулярной зондов, можно визуализировать Ассамблея крупных вирусный транскрипции заводов и анализа пространственной регуляции экспрессии вирусных генов во время возобновления KSHV. В том числе Пятнать антитела анти РНК-полимераза II, одно также можно визуализировать связь между агрегации РНК-полимераза II (RNAPII) и транскрипции KSHV во время повторной активации.
Introduction
Она становится все более очевидным, что пространственно-временных Организация ядра играет важную роль в модуляции экспрессии генов, тонко настроены у эукариот. Большинство тканей конкретные гены распределены по многим хромосом и должны регулироваться синхронно для того, чтобы реагировать на конкретные стимулы в скоординированной основе1. Клетки построить активных хроматина концентраторы (ACH) как способ объединения генов и их СНГ нормативные компоненты для конкретных космических ядерных1.
Также было продемонстрировано в различных исследованиях, что хотя ядро кажется очень густой и вязкой, биологически активные молекулы могут обходить ядро довольно быстро через распространение2. Вследствие этого эфемерного свойства большинство протеины дна binding «прыжок» от привязки сайта для привязки сайта, чувствуя их путь вокруг ядерной пространства, которая позволяет для высоко адаптивный и универсальный ядро2.
Несмотря на это динамическое поведение биомолекул в ядре, ядерная органов, без мембраны такие как (но не ограничиваясь) по-прежнему существуют ядрышко, тела Cajal и promyelocytic лейкоз ядерной органов (PML-NB). Именно с помощью различных механизмов, таких как тандем повторов ДНК (ядрышко), рРНК (ядрышко) и структурных белков, например проекта (тела Cajal) или ПМЛ белков (PML-NB), которые держат эти конструкции вместе3,4,5 . Эти структуры и другие общины как транскрипции фабрики служить строительные леса, которые не только увеличить местные концентрация необходимых компонентов, но также регулируют состав белков и нуклеиновых кислот в них в конечном итоге создать Центральный сайт для эффективного клеточных функций6.
Визуализация, когда и где ядерных структур форма обеспечивает большой объем информации для исследователей, изучая эпигенетики. С точки зрения вирусологии, возобновление латентно зараженных вирусами, например KSHV, значительно изменяет ландшафт ядра и распределение ядерных ферментов перенести транскрипции главным образом от клеточных генов вирусных генов, в конечном счете к производить полностью функциональный вирусного потомства7,8. Каким образом KSHV манипулировать клеточных генов выражение механизмы для содействия экспрессии вирусных генов? Такая информация могла бы также пролить свет на височной клеточных генов регулирующих механизмов.
Как и все другие Герпесвирусы KSHV имеет два жизненных циклов, называется литические репликации и задержки. KSHV главным образом находится в стадии задержки, в которой большинство вирусных генов замолчать выражения, за исключением задержки связанных генов9,10. Во время задержки, которое производит KSHV задержки связанные ядерного антигена (LANA), который конститутивно связывает вирусных геномов и тросов вирусный хроматина в человеческой хромосомы11. Из-за ЛАНЫ интимные отношения с вирусного генома можно использовать ИФА и DAPI пятно и найти, где вирусных episomes были связаны с принимающей хроматина.
Для изучения KSHV возобновление на уровне одного episome и ассоциации с другими вирусных episomes в инфицированной клетки, была разработана стратегия для обнаружения активно переписывание вирусный хроматина в situ . Соответственно Лана и IFA RNAPII с Интрон РНК-рыбы были объединены, генерируя РНК-FISH зондов, которые связывают регион Интрон (точное зонд последовательности можно найти в Идзумия лаборатории, самые последние публикации8) KSHV K-Rta ключевые вирусного белка, что необходимых и достаточных для KSHV реактивации можно было определить где транскрипция фактически принимает место8,11,12,13,14,15 . Этот Интрон РНК-рыба техника позволяет исследователям визуализировать, где мРНК транскрибируется непосредственно перед сращивания и экспортируются в цитоплазму16,17.
KSHV можно реактивировать с помощью различных химических раздражителей, включая phorbol эфиры, такие как 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (ДТС) и Ингибиторы гистоновых деацетилаз например натрия бутират, дополнительно KSHV может быть наведено возобновить, гиперэкспрессия Вирусная транскрипционный фактор, K-Rta19. Исследователи успешно увеличили эффективность KSHV оживления путем синхронизации циклов ячейки до вызывая реактивации18. Таким образом для этих конкретных исследований, клетки были синхронизированы с помощью блока двойной тимидина (протокол описано ниже) и инкубировали с ДТС и доксициклин (Dox) на короткое время. Doxycyline был использован потому что линия клетки, используемые в этих экспериментах доксициклин индуцибельной K-Rta кассету, который был клонирован от cDNA и не включают в себя регионе Интрон K-Rta. Хотя это можно возобновить только с помощью KSHV индуцированной K-Rta выражение, было доказано другими исследователями, что из-за целого ряда различных биохимических факторов K-Rta выражение только доказывает быть слабое оживление раздражители20. Комбинируя все эти и ограничивая инкубаций наркотиков для короткого периода времени прочной, но не слишком искусственным KSHV реактивирование был достигнут для воображения.
После маркировки Лана, RNAPII, K-Rta интронов и ДНК, как описано в этом документе, визуализация 3D флуоресценции была выполнена с помощью микроскопа деконволюция widefield. После обработки изображений программное обеспечение, пространственное распределение активных вирусных episomes может быть должным образом оценены. Используя эту технику, центральных вопросов относительно основополагающего характера формирования активных хроматина концентраторы и другие ядерные структуры могут быть изучены. Имея идентичные вирусных episomes в одну ячейку, которая обрабатывает те же регулирующие элементы могут представлять уникальный исследовательский инструмент для углубления понимания пространственно-временных гена регулирующих механизмов.
Ограничение визуализации несколько образцов клеток фиксированной в разное время точках характеризовать изначально динамической молекулярный процесс, что тонкие или небольших изменений в распределении флуоресценции незамеченными или считается незначительным. Это верно, если только в редких случаях, каждая клетка наблюдается отображает те же тонкие изменения. Таким образом полная пространственно-временных отношений активных вирусных транскрипции и другие ядерные структуры нельзя оценивать критически с использованием фиксированных визуализации. Для решения этих технических проблем, лучшим подходом является изображение живых клеток, которые обозначили вирусных episomes и следовать за расположение основных клеточных ферментов с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Предупреждение: Клеточных линий, использованные в этой процедуре содержат инфекционные вирусы, будьте внимательны и проходить только в объекте BSL уровня 2 или выше.
1. сотовый подготовку и техническое обслуживание
- Культура клетки TREx-K-BCBL РТС-1 (или другой KSHV инфицированных PEL клеточных линий) в RPMI1640 среде с 15% плода бычьим сывороточным (ФБС) и стрептомицин глютамина пенициллина 1% раствор.
- Рост клеток при 37 ° C с 5% двуокиси углерода (CO2), убедившись, что постоянно расти и разбиение ячеек в соотношении 1:4 каждые 2-4 дней.
- Монитор для культур клеток с световой микроскоп каждый день подтвердить хорошие клеточный рост и морфологии, в противном случае рекомендуется перезапустить клеточной культуры или соответствующим образом скорректировать в условиях культуры клеток.
2. тимидина синхронизации и литические индукции
- В 10 см Петри плита TREx-K-Rta BCBL-1 клетки в свежеприготовленные СМИ (1 х 106 клеток/2 мл СМИ)
- Добавить 200 мм тимидина (конечная концентрация: 2 мм) на блюдо, смешать и проинкубируйте 18 h.
- Центрифуги, клетки для 5 мин на 500 x g. вымыть клетки с стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуга снова и Ресуспензируйте клетки в свежеприготовленные СМИ. Повторите эти действия для в общей сложности 3 стирок. Ресуспензируйте в свежеприготовленные СМИ.
- Позволяют клеткам выхода S-фазы для 8 h.
- Добавить тимидина (конечная концентрация: 2 мм), смешать и инкубировать на 16 h.
- Центрифуги, клетки для 5 мин на 500 x g. вымыть клетки с стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуга снова и Ресуспензируйте клетки в свежеприготовленные СМИ. Повторите эти действия для в общей сложности 3 стирок. Ресуспензируйте в свежеприготовленные СМИ.
- Чтобы побудить вирусный оживление, добавить 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (ДТС, конечная концентрация 20 нг/мл) и доксициклин (DOX, конечной концентрации 100 нг/мл) в культуре клеток, смешать и проинкубируйте 4 ч. Для клеточных линий без K-Rta индуцибельной кассету стимулировать возобновление с помощью ДТС (конечная концентрация 20 нг/мл и натрия бутират (1 мм)).
- Центрифуги, клетки для 5 мин на 500 x g. вымыть клетки с стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуга снова и Ресуспензируйте клетки в полной культуры средств массовой информации. Повторите эти действия для в общей сложности 3 стирок. Ресуспензируйте в полной культуры средств массовой информации.
- Позволяют клеткам расти за 24 ч.
3. Фиксация и Permeabilization
Примечание: Прежде чем продолжить, проверьте крепления решение (3,7% формальдегида в PBS DEPC-лечение), диэтиловый pyrocarbonate лечение фосфат амортизированное saline (DEPC-PBS), глицин DEPC PBS (конечная концентрация глицин: 100 мм) и permeabilizating раствор (50% ацетон, 50% метанола) готовятся. Как правило каждый слайд потребует по меньшей мере 0,5 миллионов клеток, умножить при необходимости и включают дополнительные ячейки для спины вверх, особенно если клетки не являются здоровыми.
- Соберите клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Центрифуга клетки для 2 минут при 200 x g. мыть ячейки 3 раза с 1 мл стерильного DEPC PBS. Ресуспензируйте в 1,2 мл DEPC PBS.
- Поместите соответствующее количество coverslips (определяется по экспериментальной установки) в днища плиты 6-хорошо.
- Пипетка 200 мкл ячейки DEPC PBS смесь на каждом coverslip, убедитесь, что по крайней мере 0,5 миллиона клетки находятся на каждый слайд. Позволяют клеткам поселиться на 2 мин и удалить избыток DEPC PBS, оставляя лишь тонкий слой клеток. Это нормально для клетки будут удалены в этот процесс.
Предупреждение: PFA токсичных, носить соответствующую защиту. - Аккуратно добавьте 1 мл фиксации решение (3,7% формальдегида в DEPC PBS) для каждого крышка выскальзования. Позволяют клеткам исправить за 10 мин.
- Мыть coverslips 3 раза с DEPC PBS.
- Аккуратно добавить 1 мл раствора глицина DEPC PBS (конечная концентрация глицин: 100 мм) для каждого крышка выскальзования. Позволяют клеткам утолить за 5 мин.
- Добавить 1,5 мл DEPC PBS и в любом месте на шейкер для 5 минут или поколебать твердо, но осторожно в руке за 1 мин аспирата избыток DEPC PBS. Будьте осторожны, чтобы не нарушить клетки. Повторите этот шаг для в общей сложности 3 стирок.
- Аккуратно добавьте 1 мл permeabilizing раствор (50% ацетона, 50% метанола) для каждого крышка выскальзования. Позволяют клеткам для разрушения за 15 мин.
Примечание: В этот момент, coverslips можно хранить в морозильной камере-20 ° C не более чем за неделю. Избегать замораживания или свести к минимуму время, проведенное в морозильную камеру, как быстро может ухудшить качество изображения. Убедитесь, что когда в морозильной камере, что клетки остаются мокрой и покрыты в метанол/ацетон и обеспечить, чтобы они должным образом увлажняет с DEPC PBS после удаления из морозильной камеры. - Добавить 1,5 мл DEPC PBS и в любом месте на шейкер для 5 минут или поколебать твердо, но осторожно в руки за 1 мин аспирационная избыток DEPC PBS, будьте осторожны, чтобы не нарушить клетки. Повторите этот шаг для в общей сложности 3 стирок.
4. IFA и РНК-рыба
Примечание: В отношении маркировки рыбы РНК зонда и подготовка: для K-Rta Интрон 959 пар оснований, 31 различных датчиков были созданы которые были 20 пар оснований, содержащий GC содержание около 50%. Рабочие и фондовому решения зондов были aliquoted в 100 мкм и 2,5 мкм концентрации, соответственно.
- Ярлык Микроскоп слайды с необходимой экспериментальной информации или какой-то отличить метки.
- Строка в нижней части пластиковый контейнер под запайку с влажным бумажным полотенцем.
-
Приготовляют раствор основного антитела (1,5 мкл антител Лана, 0,75 мкл антител РНК Пол II, 3 мкл Бейкер дрожжей tRNA, DEPC PBS до 30 мкл) и умножить рецепт для каждого настоящего coverslip. Место 30 мкл раствора первичного антитела на каждую метку микроскопа.
- Титруйте основное антитело интерес сначала и использовать оптимальный объем. Убедитесь в том использовать очищенный IgG, как сыворотки (асцитной жидкости) может содержать большое количество РНКазы.
- Место coverslip (клетки, сталкивается с решением) помечены Микроскоп слайды и переместить слайды в контейнер с влажным бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не ввести пузыри. Покрывают экстерьер контейнера с полиэтиленовой пленкой. Переместите контейнер в инкубаторе, набор до 37 ° C за 1 ч.
- Подготовьте рыбу мыть буфера (2 x соли натрия цитрата буфера (СГБ) (финальная версия), 10% формамида, 90% DEPC dH2O).
- Готовить 2 x гибридизации буфера (4 x SSC, 20% декстран сульфат).
- Готовить вторичные антитела и рыбы Интрон зонд буфера (20 мкл 2 x гибридизации буфера (окончательный 1 x Гибнер буфера), 4 мкл хлебопекарных дрожжей tRNA (окончательное 10%), 4 мкл формамид (окончательное 10%), Интрон K-Rta зонд (окончательный 125 Нм), 0,8 мкг вторичные антитела, DEPC dH2 O до 40 мкл). Рецепт на каждый слайд, который необходимо умножьте.
- После инкубации Вымойте клетки 3 раза с DEPC PBS в 6 хорошо пластина для 5 мин.
- Промыть рыбу мыть буфер 3 раза за 5 мин. Держите coverslip рыбы мыть буфера до окончания подготовки смеси во-вторых антител и Интрон зонд (шаг 4.7).
- Чистое стекло слайды для основное антитело инкубации для гибридизации.
- Место 40 мкл вторичные антитела и рыбы Интрон зонд, содержащие решения на каждый слайд стекла.
- Место coverslips с клетки на слайды с ячейки лицевой стороной вниз на верхней части буфера, будьте внимательны и не ввести пузыри.
- Место слайды в пластиковый контейнер с влажным бумажным полотенцем на дне. Оберните пластиковый контейнер в первом полиэтиленовой пленкой, а затем алюминиевой фольги.
- Инкубируйте в контейнер с слайды при 37 ° C для 16-24 ч.
- После инкубации тщательно слайд coverslip от края стекла слайд и положил обратно в 6 хорошо пластин, вверх и вымыть клетки с рыбы мыть буфер 3 раза в 6 хорошо пластина для 5 мин.
- Вымыть клетки 2 раза с 2 x SSC.
- Добавить DAPI (1:1, 000) в 2 x SSC и позволить сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Вымыть клетки 2 раза с 2 x SSC.
- Очистите стекло слайды для гибридизации и 10 мкл монтажа раствор на стеклянных вставках.
- Поместите coverslips лицевой стороной вниз на монтажные решения. Будьте осторожны, чтобы не ввести пузыри.
- Лаборатория тканью аккуратно удалите избыток монтажные решения, соблюдая осторожность, чтобы не раздавить клетки.
- Используя лак, применяются достаточно слоя вокруг края coverslips и дать высохнуть.
- Перейдите к выполнить микроскопии флуоресцирования.
5. 3D флуоресцентной микроскопии
Примечание: Хотя протоколы будут меняться с типом используемой системы микроскопа флуоресценции, следующие шаги помогут обеспечить получение оптимального изображения данных для количественного анализа.
- Предварительной обработки образцов фиксированной и смонтировать в средствах массовой информации против затухания для задержки флуоресценции Фотообесцвечивание во время визуализации.
- В поле зрения используйте объектив высокого качества (например, 60 X 1,42 N.A нефти погружение объектив), который может захватить всю ячейку (или клеточного ядра).
- Задать параметры экспозиции (например, мощность возбуждения, выдержка) для каждого канала цвета флуоресценции, используя примеры положительной и отрицательной контроля. Получение изображений флуоресценции.
Примечание: Положительных контрольных образцов, которые содержат только один флуоресцентные метки также должны использоваться для определения уровня «перекрестных» между цветовыми каналами. Для визуализации фиксированные ячейки образцов мощность возбуждения флуоресценции можно уменьшить (с немного больше экспозиции раза) для сведения к минимуму Фотообесцвечивание. - После того, как был создан изображений протокол, сохранить те же параметры экспозиции последовательно для всех примеров в исследовании — так, что данные изображения могут быть точно проанализированы и сравнить.
- Выполните обработку после приобретения изображений и 3D-реконструкции. Идентифицировать K-Rta стенограммы РНК-рыба сигнал (красный), Лана молекул, иммунофлюоресценции (зеленый) и ядерных хроматина (где применимо) окрашивали DAPI (синий).
Примечание: Регионы клеточного ядра, в котором K-РТС и Лана совместно кластеризованный, таким образом считаются связанные с фабрики вирусный транскрипции и репликации комплекса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Слегка сокращенный протокола была исполнена где клетки BCBL-1 использовались и только Лана и K-Rta РНК окрашивали (рис. 1). Этот эксперимент позволяет нам изучить где активно транскрипции вирусных episomes и неоднородность реакции на стимулы оживления KSHV в популяции клеток. В ячейке указано стрелкой на рис. 1собственный K-Rta флуоресценции в регионах, которые тесно соответствуют распространение вирусных episomes (отмеченные Лана) является доказательством для активных транскрипции проходит недалеко от KSHV геномов. В том же образце может наблюдаться клетки как обозначается стрелкой на рисунке 1 , которые exhibit много слабее и рассеянный K-Rta флуоресценции, значительно не перекрываются с ЛАНОЙ. Это иллюстрирует общий вывод, что в рамках популяция клеток есть значительные различия в степени реакции на стимулы оживления.
Рисунок 1: Визуализация активных транскрипции вирусных episomes. IFA и РНК-рыба была выполнена на BCBL-1 клетки. BCBL-1 клетки не были синхронизированы, но лечить с ДТС и натрия бутират за 4 ч. с использованием Лана иммуноокрашивания, вирусных геномов были подробно освещены в зеленый, а РНК-рыба была выполнена ориентации интронов K-Rta для расположен активных транскрипции в красном. Сотовый хроматина был окрашенных сообщение фиксации и permeabilization с DAPI. K-Rta Интрон и Лана пятна были объединены вместе. Полный стрелка указывает на ячейку, которая полностью возобновлен и формирования VTFs. В то время как стрелки указывает на ячейку, которая только начинает возобновить, как это было предложено слабый сигнал K-Rta. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Далее был рассмотрен эффективности тимидина синхронизации визуализации выражение вирусного белка K-Rta (рис. 2). После двойной тимидина блок была выполнена для синхронизации клеток TREX BCBL-1 на G1/S фазового перехода, протокол, в описанный ранее была выполнена (без Лана и RNAPII окрашивание). Изучая K-Rta окрашивание, очевидно, что синхронизированных клеток более ответил на возобновление раздражители чем несинхронизированные населения. От предыдущих исследований, проведенных в лаборатории Идзумия (данные не показаны) был утвержден, что RNAPII также colocalizes более часто с K-Rta после клеточного цикла синхронизации.
Рисунок 2: Эффективность тимидина. РНК-рыба была исполнена на клетки TREX K-Rta BCBL-1. Клетки (обозначается «2 x твоих» название) были синхронизированы с двойной тимидина блок. Обе несинхронизированными и синхронизированные клеточных популяций лечили ДТС и DOX за 4 ч. K-Rta интронов были гибридизированных к РНК рыбы зонды. Клетки, которые равномерно ярко-красные не экспрессирующих K-Rta, вместо этого они мертвы, протестированы с DAPI окрашивание (не показано). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Общее замечание очень важно запятнать клетки с DAPI при выполнении настоящего Протокола. Apototic клетки могут быть легко признаны ядерными фрагментации и блеббинг. Учитывая тяжелые индукции стимулы и практики культуры общей ячейки, он является общим для некоторых мертвых клеток увидеть. Важно, чтобы всегда пятно с DAPI как основной способ различать между живые и мертвые клетки. Иногда антитела или РНК зондов будет попасть в apoptotic клеток и производить сигналы, поэтому важно исключить эти клетки из анализа. DAPI пятнать может служить несколько дополнительных функций, например на рисунке 3, ясно, что обозначено стрелкой объект является на самом деле три отдельных клеток вместо одного.
Важно отметить, что образы, показано на рисунке 3 и 4 были deconvolved, создавая тем самым более пунктата шаблон. Изучая RNAPII пятно, разница между клетками обозначено стрелкой и другие окружающие клетки можно увидеть. Примечательно отметить, что сигнал RNAPII гораздо более выраженным, чем нормальной связи деконволюции.
Использование 3D микроскопии наряду с Эта техника позволяет нам допросить пространственные отношения между RNAPII, Лана и K-Rta. Например на рисунке 4, кольцо-RNAPII структуры можно увидеть с KSHV геномов, разбросанных на периферии. В общем Лана обычно colocalizes с RNAPII в клетках развивающихся транскрипции фабрики. Однако, не все из точек, Лана colocalize с RNAPII, исследования, в том числе 4й измерение (время) будет необходимо уточнить этот фенотип. Важно добавить, что несколько точек Лана, которые не colocalize с K-Rta сигналы представляют собой episomal гетерогенность в ответ на возобновление стимулы даже в пределах отдельных клеток (рис. 4).
Рисунок 3: Комбинированный ИФА и Интрон РНК-рыба. IFA и РНК-рыба была исполнена на клетки TREX K-Rta BCBL-1. Вирусных геномов были расположены с иммуноокрашивания Лана (зеленый), активные транскрипции был визуализирован с РНК-рыба Интрон региона K-Rta мРНК (желтый), RNAPII (красный) конгрегаций были помечены IFA, и клетки окрашивали наконец, используя DAPI изображение ДНК (синий). TREx K-BCBL РТС-1 клетки были синхронизированы с помощью двойной тимидина блока, то клетки были возобновлены через инкубации с ДТС и DOX для 4 h, и 24 h позже клетки были исправлены, permeabilized и далее подготовленный для воображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: 3D визуализация вирусных транскрипции фабрик. Интрон РНК-рыбы с помощью K-Rta Интрон зондов (светло-голубой), иммуноокрашивания RNAPII (красный) и Лана (зеленый) и DAPI ДНК, окрашивание (синий). Deconvolved 3D-рендеринга стека Z на Микроскоп, обрабатываются и построенные на коммерческих изображений программное обеспечение (см. таблицу материалов). TREx K-Rta BCBL-1 клетки двойной тимидина синхронизированы и затем обрабатывают ДТС и DOX за 4 ч. клетки были обработаны 28 h после стимулировало оживление. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть некоторые аспекты протокола, которые могут быть изменены с учетом необычных обстоятельств. Выбор буферов фиксации и permeabilization также могут быть изменены. Для фиксации буферов параформальдегид является также эффективным и этанола могут быть использованы для permeabilization.
Закалки формальдегида с глицином, PBS рекомендуется как формальдегид предотвращает отключение антитела в отсутствие бычьим сывороточным альбумином (БСА), но если coverslips моют тщательно достаточно, глицин PBS шаг может быть пропущен. В протоколе Избегайте использования альбумина bovine сыворотки как блокирующие решение. Экспериментальные исследования, проведенные в лаборатории Идзумия, показал слабых сигналов РНК-рыба, предположительно из-за деградации РНК. Если необходима блокировка для основного антитела, рекомендуется использовать РНКазы бесплатно BSA. Из прошлого опыта, было замечено, что если антитела специфичен, включение BSA не является необходимым в реакции. Однако, рекомендуется всегда включать избыточное количество дрожжей tRNA в всех инкубаторов шаги для предотвращения деградации РНК. Было замечено, что использование tRNA как блокирование агент увеличилась конкретных сигналов РНК-рыба.
Клеточный цикл синхронизации была выполнена для создания более эффективной и синхронные KSHV реактивации. Для клеточного цикла синхронизации гидроксимочевина или сыворотки голода может быть альтернативные подходы. Было подтверждено, что гидроксимочевина является столь же эффективным, как с помощью блока тимидина, хотя инкубации с гидроксимочевина только реактивирует KSHV слабо.
Как эта техника может применяться для других исследований? В лаборатории Идзумия самые последние публикации было показано, что colocalization активно переписывание KSHV episomes и РНК Пол II, фермент необходимым для транскрипции РНК. Однако известно, что существует ряд совместно активаторы, Сопредседатель подавляющего и клеточных транскрипционный анализ факторов, участвующих в регуляции генов KSHV. Количественная ПЦР-исторически был использован на население (смесь реактивации и скрытое) культивируемых клеток, количественного определения вирусных стенограммы и оценки воздействия на экспрессии вирусных генов. Используя описанный выше подход, анализ может быть сужен до уровня одного episomal для изучения вирусной транскрипции. Таким образом чтобы разобраться в их связи с KSHV реактивации могут рассматриваться пространственно-временных правил других клеточных и вирусные ферменты. Это также отметить, что поскольку РНК Интрон региона преходящий характер зависит от их деградации, что зонды RNA рыбы гибридизируйте и обычно локализовать где активные транскрипции проходит, однако если интронов не деградировали сразу же рыба зонды могут представлять сигналы, которые не всегда находятся рядом с активной транскрипции.
На данный момент это трудно изучить взаимосвязь между формирование клеточной транскрипции заводов и последующих ген выражение благодаря их геномной размеров и сложности конфигурации сотовой промоутеров. В этой связи KSHV episomes может быть идеальным инструментом благодаря их относительно небольшой генома, определенное оживление механизмов с четкой РНК Pol II совокупных образований. С помощью KSHV в манипуляции вирусный мини-хромосома, herpesvirology может способствовать области исследований сотовой эпигенетики с уникальной точки зрения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этого документа не имеют финансовых связей или конкурирующих конфликты интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национальными институтами здравоохранения Грант (R01-DE025985) и премией американской рак общества исследования ученый (RSG-13-383-ПДК). Эта работа также была поддержана грантов из Департамента сельского хозяйства США (2015-67015-23268 и 2014-67015-21787) и новые инициативы исследовательский грант от университета Калифорнии, Дэвис.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
