Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D

Published: January 18, 2018 doi: 10.3791/56832
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

Summary

مصانع النسخي الفيروسية هي هياكل منفصلة يتم إثراء الخلوية رنا بوليميراز الثاني لزيادة النسخ المورثات الفيروسية أثناء تنشيط. هنا، يتم وصف طريقة لتحديد المواقع لتدوين الكروماتين الفيروسية في الفضاء ثلاثي الأبعاد النووية بنشاط بمزيج من الفلورة التهجين الحمض النووي الريبي تلطيخ و في الموقع .

Abstract

فمن المعروف جيدا أن التنظيم المكاني والزماني للجينات جزء لا يتجزأ من الإدارة التعبير الجيني السليم. ونتيجة لذلك، فإنه لا تقدر بثمن لفهم أين ومتى يحدث النسخ داخل الفضاء النووية وتصور العلاقة بين ابيسوميس المصابة داخل نواة الخلية نفسها. هنا، كانت الفلورة (إيفا) والجيش الملكي النيبالي-الأسماك كومبينيدتو تحديد الكتابة بنشاط ابيسوميس ساركوما كابوزي المرتبطة هربس (كشف). تلطيخ كشف الكمون المرتبطة النووية مستضد (LANA)، فمن الممكن لتحديد أين توجد ابيسوميس الفيروسية داخل النواة. وبالإضافة إلى ذلك، بتصميم تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك لاستهداف منطقة إنترون إحدى المورثات الفيروسية، التي يعبر عنها فقط أثناء العدوى الإنتاجية، يمكن وضع الوليدة رنا النصوص. استخدام هذا المزيج من المسابر الجزيئية، من الممكن تصور الجمعية للمصانع الكبيرة النسخ الفيروسية وتحليل التنظيم المكاني للتعبير الجيني الفيروسي أثناء تنشيط كشف. بها بما في ذلك مكافحة-رنا بوليميراز الثاني تلطيخ جسم واحد أيضا تصور الرابطة بين التجميع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابي) وكشف النسخ أثناء تنشيط.

Introduction

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن المنظمة الزمانية المكانية للنواة يلعب دوراً هاما في تحوير الجينات ضبطها بدقة في حقيقيات النوى. معظم الأنسجة جينات محددة موزعة على العديد من الصبغيات، وتحتاج إلى تنظيم شكل متزامن بغية الاستجابة للمحفزات محددة ب طريقة منسقة1. خلايا بناء محاور الكروماتين النشطة (ACH) كطريقة للجمع بين الجينات ومكوناتها التنظيمية المستقلة إلى الفضاء نووية خاصة1.

كما ثبت بالعديد من الدراسات أنه على الرغم من أن يبدو النواة كثيفة ولزجة جداً، النشيطة بيولوجيا الجزيئات يمكنها اجتياز النواة ليس بسرعة عن طريق نشر2. ونتيجة لهذه الخاصية سريعة الزوال، معظم البروتينات ربط الحمض النووي 'القفز' من ربط الموقع إلى ربط الموقع، شعور طريقهم نحو الفضاء النووية، الذي يسمح ب درجة عالية من التكيف وتنوعاً نواة2.

وعلى الرغم من هذا السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية داخل النواة، النووية الهيئات دون أغشية مثل (ولكن لا تقتصر على) نوية والهيئات كيال promyelocytic سرطان الدم الهيئات النووية (حزب الرابطة الإسلامية-ملحوظة) لا تزال موجودة. ومن خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل تكرار الحمض النووي جنبا إلى جنب (نوية)، الرنا الريباسي (نوية) والبروتينات الهيكلية مثل كوالين (الهيئات كيال) أو حزب الرابطة الإسلامية البروتينات (حزب الرابطة الإسلامية-NB) التي تحمل هذه بنيات معا3،4،5 . وهذه الهياكل والتجمعات الأخرى مثل مصانع النسخ بمثابة السقالات التي ليس فقط زيادة تركيز المحلية من المكونات المطلوبة، ولكن أيضا تنظيم تكوين البروتينات والأحماض النووية داخل كل منها في نهاية المطاف إنشاء موقع مركزي لكفاءة الوظائف الخلوية6.

تصور متى وأين شكل الهياكل النووية يوفر ثروة معلومات للباحثين الذين يدرسون التخلق. من منظور علم الفيروسات، إعادة تنشيط الفيروسات المصابة خفية، مثل كشف، يغير إلى حد كبير المناظر الطبيعية نواة وتوزيع الإنزيمات النووية لتحويل النسخ أساسا من الجينات الخلوية للمورثات الفيروسية، في نهاية المطاف إلى إنتاج ذرية فيروسية تعمل بكامل طاقتها7،8. كيفية التعامل مع كشف إليه تعبير الجينات الخلوية لتيسير التعبير الجيني الفيروسي؟ هذه المعلومات يمكن أيضا تسليط الضوء على آليات تنظيمية الجينات الخلوية الزمانية.

مثل جميع herpesviruses الأخرى، قد كشف اثنين من دورات الحياة يسمى النسخ المتماثل الحال والكمون. كشف أساسا تكمن في مرحلة الكمون، فيها معظم المورثات الفيروسية لها هو إسكات التعبير، ما عدا الكمون المرتبطة الجينات9،10. خلال الكمون تنتج كشف المرتبطة الكمون مستضد النووية (LANA)، الذي يربط الجينوم الفيروسي مؤثرا والحبال الكروماتين الفيروسية إلى الكروموسوم البشري11. بسبب العلاقة ل LANA الحميمة مع الجينوم الفيروسي، فمن الممكن استخدام DAPI وايفا لوصمة عار وتحديد موقع حيث تم ابيسوميس الفيروسية بالنسبة الكروماتين المضيف.

قد أنشئ لدراسة تنشيط كشف على مستوى واحد ابيسومي والرابطة مع أخرى ابيسوميس الفيروسية في إحدى خلايا مصابة، استراتيجية لتحديد موقع تدوين بنشاط فيروسي الكروماتين في الموقع . تبعاً لذلك، LANA وايفا رنابي مع إنترون الجيش الملكي النيبالي-الأسماك كانت مجتمعة، عن طريق توليد تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك التي تربط منطقة إنترون (التحقيق الدقيق يمكن الاطلاع على تسلسل في مختبر إيزومييا في منشور آخر8) ك كشف هيئة الطرق والمواصلات البروتين الفيروسي الرئيسية التي يتم ضرورية وكافية لكشف تنشيط-كان من الممكن تحديد مكان وحيثما كان بالفعل أخذ النسخ8،11،،من1213،14،15 . هذا إنترون تقنية الحمض النووي الريبي-الأسماك تمكن الباحثين تصور فيها نسخها مرناً فورا قبل أن يتم تقسم وتصديرها إلى السيتوبلازم16،17.

يمكن إعادة تنشيط كشف من المحفزات الكيميائية المختلفة بما في ذلك إستر phorbol مثل 12-س-تيتراديكونويل-فوربول-13acetate (طن سنوياً)، ويمكن أن يتسبب هيستون deacetylase مثبطات مثل بوتيرات الصوديوم، بالإضافة إلى ذلك كشف إعادة تنشيط قبل overexpression من عامل النسخ الفيروسية، كهيئه الطرق والمواصلات19. الباحثون نجحت في زيادة كفاءة كشف التنشيط بتزامن دورات للخلية قبل حمل تنشيط18. وهكذا، لهذه الدراسات، وخاصة خلايا تم مزامنة استخدام كتلة thymidine مزدوجة (البروتوكول هو موضح أدناه) والمحتضنة مع طن سنوياً والدوكسي (دوكس) لفترة قصيرة. استخدم دوكسيسيليني لأن خط الخلية المستخدمة في هذه التجارب قد كاسيت كهيئه الطرق والمواصلات الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي، التي تم استنساخ من كدنا ولا تشمل منطقة إنترون كهيئه الطرق والمواصلات. على الرغم من إمكانية إعادة تنشيط استخدام كشف فقط المستحث التعبير كهيئه الطرق والمواصلات، وقد ثبت باحثون آخرون أن سبب مجموعة متنوعة من العوامل البيوكيميائية المختلفة يثبت التعبير كهيئه الطرق والمواصلات وحدها أن تكون ضعيفة إعادة تنشيط محفزات20. عن طريق الجمع بين كل هذه، وعن طريق الحد من إينكوباتيونس المخدرات لفترة قصيرة من الزمن، وقد تحقق إعادة تنشيط كشف قوية ولكن غير مفرط اصطناعية للتصوير.

بعد وضع العلامات LANA، رنابي، introns كهيئه الطرق والمواصلات، والحمض النووي كما هو موضح في هذه الورقة، وأجرى تصوير 3D fluorescence استخدام مجهر deconvolution ويديفيلد. بعد المعالجة مع برامج التصوير، يمكن تقييم التوزيع المكاني ابيسوميس الفيروسية النشطة بشكل صحيح. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسة الأسئلة المركزية فيما يتعلق بالطبيعة الأساسية لتشكيل محاور الكروماتين النشطة وغيرها من الهياكل النووية. وبعد ابيسوميس الفيروسية متطابقة في خلية واحدة تقوم بمعالجة نفس العناصر التنظيمية قد تمثل أداة بحث فريدة من نوعها لتعميق فهم آليات تنظيمية الجينات الزمانية المكانية.

حد تصوير متعددة العينات خلية ثابتة عند نقاط زمنية مختلفة لوصف عملية جزيئية طبيعتها دينامية هو أن التغييرات خفية أو الصغيرة في توزيع الأسفار التي لم يتم كشفها أو تعتبر ضئيلة. وهذا صحيح إلا في حالة نادرة، يعرض كل خلية ولاحظ نفس التغيير خفية. وهكذا، لا يمكن العلاقة الزمانية المكانية الكاملة النشطة النسخ الفيروسية وغيرها من الهياكل النووية خطيرة تقييمه باستخدام التصوير الثابت. لمواجهة هذه التحديات التقنية، أفضل نهج للصورة الخلايا الحية التي تميزت ابيسوميس الفيروسية ومتابعة موقع الإنزيمات الخلوية الرئيسية على مر الزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: خطوط الخلايا المستخدمة في هذا الإجراء تحتوي على الفيروسات المعدية وكن حذراً وإلا المضي قدما في مرفق BSL المستوى 2 أو أعلى.

1-الخلية إعداد وصيانة

  1. الثقافة الخلايا TREx-كهيئه الطرق والمواصلات BCBL-1 (أو كشف آخر إصابة خطوط الخلايا PEL) في المتوسط RPMI1640 وتستكمل مع 15% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين والستربتوميسين الجلوتامين الحل.
  2. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2)، مع التأكد من أن تنمو بشكل مستمر وانقسام الخلايا بنسبة 1:4 كل 2 – 4 أيام.
  3. رصد الثقافات الخلية مجهر خفيفة يوميا للتأكد من نمو الخلايا الجيدة ومورفولوجيا، خلاف ذلك فمن المستحسن إعادة تشغيل ثقافة الخلية أو تعديل شروط ثقافة الخلية تبعاً لذلك.

2-thymidine المزامنة وتحريض الحال

  1. في 10 سم طبق بيتري، طازج لوحة TREx-كهيئه الطرق والمواصلات BCBL-1 الخلايا في وسائط الإعلام (1 × 106 خلايا/2 مل من وسائل الإعلام)
  2. إضافة thymidine 200 ملم (التركيز النهائي: 2 مم) إلى الطبق، مزيج واحتضانها ح 18.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الطازجة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام الطازجة.
  4. السماح للخلايا لإنهاء مرحلة ثانية ح 8.
  5. إضافة thymidine (التركيز النهائي: 2 مم) وخلط واحتضانها ح 16.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الطازجة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام الطازجة.
  7. للحث على إعادة تنشيط الفيروسات، إضافة 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (طن سنوياً، التركيز النهائي 20 نانوغرام/ملليلتر) والدوكسي (دوكس، تركيز نهائي 100 نانوغرام/مل) في ثقافة الخلية وخلط واحتضانها ح 4. لخطوط الخلايا دون كاسيت إيندوسيبلي كهيئه الطرق والمواصلات، تحفز على إعادة تنشيط استخدام طن سنوياً (التركيز النهائي 20 نانوغرام/مليلتر والصوديوم butyrate (1 مم)).
  8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة كاملة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام ثقافة كاملة.
  9. السماح للخلايا أن تنمو على ح 24.

3-التثبيت وبيرميبيليزيشن

ملاحظة: قبل المتابعة، تأكد من تحديد الحل (3.7% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني تعامل ديبك)، ثنائي إثيل بيروكاربوناتي معاملة مخزنة الفوسفات المالحة (ديبك-برنامج تلفزيوني)، جليكاين "ديبك برنامج تلفزيوني" (تركيز جليكاين النهائي: 100 ملم) والحل بيرميبيليزاتينج (50% الأسيتون، 50% ميثانول) يتم إعدادها. عادة، كل شريحة سوف تتطلب على الأقل 0.5 مليون الخلايا وتتضاعف إذا لزم الأمر وتشمل خلايا إضافية للخلف حتى لا سيما إذا كانت الخلايا غير صحية.

  1. جمع الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 200 x غ. غسيل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من "برنامج تلفزيوني ديبك" العقيمة. ريسوسبيند 1.2 مل من برنامج تلفزيوني ديبك.
  3. ضع العدد المناسب من كوفيرسليبس (يحدده الإعداد التجريبية) في القيعان من لوحة 6-جيدا.
  4. "الماصة؛" ميليلتر 200 خلية خليط "ديبك برنامج تلفزيوني" على كل ساترة، والتأكد من وجود خلايا على الأقل 0.5 مليون على كل شريحة. السماح للخلايا بتسوية لمدة 2 دقيقة، ونضح PBS ديبك الزائدة التي تترك سوى طبقة رقيقة من الخلايا. فمن الطبيعي بالنسبة للخلايا المراد إزالتها في هذه العملية.
    تنبيه: منهاج العمل السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
  5. أضف 1 مل من تحديد الحل (3.7% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني ديبك) لكل كشف الغطاء بعناية. السماح للخلايا لإصلاح لمدة 10 دقائق.
  6. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع "برنامج تلفزيوني ديبك".
  7. أضف 1 مل جليكاين "ديبك برنامج تلفزيوني" بعناية (التركيز النهائي جليكاين: 100 ملم) لكل كشف الغطاء. السماح للخلايا لإخماد لمدة 5 دقائق.
  8. إضافة 1.5 مل "برنامج تلفزيوني ديبك" وأي مكان في شاكر لمدة 5 دقائق أو هزة بحزم ولكن برفق في اليد للحد الأدنى 1 أسبيراتي "برنامج تلفزيوني ديبك" الزائدة. احرص على عدم تعطيل الخلايا. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 3 يغسل.
  9. أضف 1 مل من بيرميبيليزينج الحل (الأسيتون 50%، 50% ميثانول) لكل كشف الغطاء بعناية. السماح للخلايا إلى بيرميبيليزي لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزينها في كوفيرسليبس في ثلاجة-20 درجة مئوية لمدة لا تزيد على أسبوع واحد. تجنب تجميد أو تقليل الوقت الذي يقضيه في الثلاجة كما يمكن أن تتحلل جودة الصورة بسرعة. تأكد من أن عند في الثلاجة التي تظل الخلايا رطبة ومغطاة في الميثانول/الأسيتون، وضمان أنها ترطيب بشكل صحيح مع "برنامج تلفزيوني ديبك" بعد إزالة من الثلاجة.
  10. إضافة 1.5 مل "برنامج تلفزيوني ديبك" وأي مكان في شاكر لمدة 5 دقائق أو هزة بقوة ولكن برفق في يد نضح للحد الأدنى 1 "برنامج تلفزيوني ديبك" الزائدة، يجب الحرص على عدم تعطيل الخلايا. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 3 يغسل.

4-إيفا، والجيش الملكي النيبالي-الأسماك

ملاحظة: فيما يتعلق بتسمية مسبار "الحمض النووي الريبي الأسماك" وإعداد: كهيئه الطرق والمواصلات إنترون وهو 959 قاعدة أزواج، وتحقيقات مختلفة 31 تم إنشاؤها التي كانت 20 قاعدة أزواج كل منها يحتوي على نشرة مصورة عمومية المحتوى من حوالي 50%. حلول العمل والأسهم التحقيقات كانت الكوتيد إلى 100 ميكرومتر و 2.5 ميكرون التركيزات، على التوالي.

  1. التسمية شرائح المجهر مع المعلومات التجريبية اللازمة أو نوعا من تسمية مميزة.
  2. خط الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك يمكن إغلاقها بشرط مع منشفة ورقية رطبة.
  3. إعداد الحل جسم الأولية (1.5 ميليلتر جسم LANA، ميليلتر 0.75 من جسم رنا بول الثاني، 3 ميليلتر من خبازة خميرة الحمض الريبي النووي النقال، "برنامج تلفزيوني ديبك" ما يصل إلى 30 ميليلتر)، وتتكاثر بوصفه لكل ساترة الحالية. مكان 30 ميليلتر من محلول جسم الأولية على كل شريحة المجهر المسمى.
    1. تيتراتي جسم الأولية ذات الأهمية الأولى واستخدم المبلغ الأمثل. تأكد من استخدام مفتش المنقي، المصل (سائل الاستسقاء) قد تحتوي على كمية كبيرة من رناسي.
  4. ضع ساترة (الخلايا التي تواجه الحل) على الشرائح المجهر المسمى ونقل الشرائح إلى الحاوية مع منشفة ورقية رطبة. احرص على عدم إدخال فقاعات. تغطية السطح الخارجي للحاوية مع غلاف بلاستيكي. نقل الحاوية إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية ح 1.
  5. إعداد المخزن مؤقت يغسل السمك (2 x المالحة سترات الصوديوم العازلة (SSC) (نهائي)، ميثلامين 10%، 90% dH ديبك2س).
  6. إعداد 2 × التهجين المخزن المؤقت (4 x SSC، كبريتات ديكستران 20%).
  7. إعداد الأجسام المضادة الثانوية والأسماك إنترون المسبار المخزن المؤقت (20 ميليلتر من 2 × التهجين المخزن المؤقت (1 النهائي x هيب المخزن المؤقت)، 4 ميليلتر بيكر للخميرة الحمض الريبي النووي النقال (النهائي 10%)، 4 ميليلتر من ميثلامين (النهائي 10%)، مسبار إنترون كهيئه الطرق والمواصلات (125 النهائي nM)، 0.8 ميكروغرام للجسم المضاد الثانوي، dH ديبك2 يا ما يصل إلى 40 ميليلتر). اضرب وصفه لكل الشرائح المطلوبة.
  8. بعد الحضانة، يغسل خلايا 3 مرات مع "برنامج تلفزيوني ديبك" في لوحة 6 جيدا لمدة 5 دقائق.
  9. يغسل مع المخزن المؤقت ليغسل السمك 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل. تبقى ساترة في المخزن المؤقت ليغسل السمك حتى الانتهاء من إعداد خليط من ثانيا التحقيق جسم وانترون (الخطوة 4، 7).
  10. الشرائح الزجاجية النظيفة المستخدمة لتفريخ جسم الأولية التهجين.
  11. ضع ميليلتر 40 جسم الثانوية ومسبار إنترون الأسماك التي تحتوي على الحل على كل شريحة الزجاج.
  12. ضع كوفيرسليبس مع الخلايا على الشرائح مع الجانب الخلية أسفل فوق المخزن المؤقت، ويكون حذراً من عدم إدخال فقاعات.
  13. وضع الشرائح في وعاء من بلاستيك مع منشفة ورقية رطبة على الجزء السفلي. التفاف الحاويات البلاستيكية في غلاف بلاستيكي أولاً ثم رقائق الألومنيوم.
  14. احتضان الحاوية مع الشرائح في 37 درجة مئوية ح 16-24.
  15. بعد الحضانة، بعناية الشريحة ساترة من الحافة من الشريحة الزجاجية، ووضع مرة أخرى في 6 لوحات جيدا مواجهة، وتغسل الخلايا مع المخزن المؤقت ليغسل السمك 3 مرات في 6 لوحة جيدا لمدة 5 دقائق في كل.
  16. تغسل الخلايا مرات 2 مع 2 x SSC.
  17. إضافة DAPI (1:1، 000) في 2 x SSC، والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  18. تغسل الخلايا مرات 2 مع 2 x SSC.
  19. تنظيف الشرائح الزجاجية المستخدمة التهجين، وإضافة 10 ميليلتر لتركيب محلول على الشرائح الزجاجية.
  20. ضع الوجه كوفيرسليبس إلى أسفل على الحل المتصاعدة. احرص على عدم إدخال فقاعات.
  21. بلطف مع أنسجة مختبرية، إزالة الحل تركيب الزائدة، مع الحرص على عدم الاسكواش الخلايا.
  22. استخدام طلاء الأظافر، تطبيق طبقة وافرة حول حافة كوفيرسليبس والسماح لتجف.
  23. المضي قدما لإجراء الفحص المجهري الأسفار.

5-3D Fluorescence الفحص المجهري

ملاحظة: في حين سوف تختلف بروتوكولات مع نوع نظام مجهر الأسفار المستخدمة، ستساعد الخطوات التالية لضمان الحصول على بيانات الصورة المثلى للتحليل الكمي.

  1. بريتريت عينات الثابتة وجبل في وسائل الإعلام تتلاشى المضادة لتأخير فوتوبليتشينج fluorescence أثناء التصوير.
  2. استخدام هدف عالية جودة (مثل 60 × 1.42 N.A نفط-غمر عدسة)، الذي يمكن التقاط كل خلية (أو نواة الخلية) في الحقل من العرض.
  3. تعيين معلمات التعرض (مثل، قوة الإثارة، وزمن التعرض للضوء) لكل قناة لون الأسفار، باستخدام عينات مراقبة إيجابية وسلبية. الحصول على الصور الفلورية.
    ملاحظة: مراقبة إيجابية العينات التي تحتوي على التسمية الفلورسنت واحدة فقط يجب ستستخدم أيضا لتحديد مستوى "الحديث المتبادل" بين قنوات اللون. للتصوير عينات الخلايا الثابتة، يمكن تخفيض طاقة الإثارة الفلورية (مع التعرض لأوقات أطول قليلاً) للتقليل من فوتوبليتشينج.
  4. متى أنشئت في بروتوكول التصوير، الحفاظ على نفس المعلمات التعرض متسقة بالنسبة لجميع العينات في دراسة – حيث أنه يمكن تحليل ومقارنة بيانات الصورة بدقة.
  5. أداء معالجة ما بعد اقتناء الصور وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. تحديد النصوص كهيئه الطرق والمواصلات بإشارة الجيش الملكي النيبالي-الأسماك (أحمر)، والجزيئات LANA الفلورة (الأخضر)، والكروماتين النووي (حيثما ينطبق ذلك) ملطخة DAPI (أزرق).
    ملاحظة: مناطق نواة الخلية، التي كهيئه الطرق والمواصلات LANA وشارك متفاوت المسافات، وبالتالي يعتقد أن تترافق مع المصانع الفيروسية النسخ والنسخ المتماثل معقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كان تنفيذ بروتوكول مختصرة قليلاً حيث استخدمت خلايا BCBL-1 وإلا LANA ورنا كهيئه الطرق والمواصلات كانت الملون (الشكل 1). هذه التجربة يسمح لنا بالنظر فيها بنشاط الاختزال ابيسوميس الفيروسية وعدم تجانس الاستجابة للمحفزات تنشيط كشف في عدد أن خلايا. في الخلية هو مبين بالسهم في الشكل 1، الأسفار كهيئه الطرق والمواصلات متميزة في المناطق التي تطابق توزيع ابيسوميس الفيروسية (ملحوظ مع LANA) أدلة للنسخ النشطة أخذ مكان قريب من كشف الجينوم. في نفس العينة، الخلايا مثل واحد يعني برأس السهم في الشكل 1 يمكن ملاحظة، التي يحمل كثير منتشر وأضعف كهيئه الطرق والمواصلات الأسفار التي لا تتداخل إلى حد كبير مع LANA. ويوضح هذا الاستنتاج العام أن داخل عدد خلايا هناك تباين كبير في درجة الاستجابة للمحفزات إعادة التنشيط.

Figure 1
رقم 1: تصور النسخ النشطة من الفيروسية ابيسوميس. إيفا، والجيش الملكي النيبالي-الأسماك أجرى على خلايا BCBL-1. الخلايا BCBL-1 لم تتم مزامنة بل تعامل مع بوتيرات طن سنوياً والصوديوم ل immunostaining LANA استخدام 4 حاء، كانت تصور الجينوم الفيروسي باللون الأخضر، بينما أنجز الجيش الملكي النيبالي-الأسماك استهداف introns كهيئه الطرق والمواصلات للنسخ النشطة الموجودة باللون الأحمر. وكان الملون الكروماتين الخلوية وتثبيت وظيفة، وبيرميبيليزيشن مع DAPI. إنترون كهيئه الطرق والمواصلات والبقع LANA تم دمجها معا. يشير السهم بالكامل إلى خلية قد أعادت تنشيط تماما وهو تشكيل فتفس. وفي حين يشير رأس السهم نحو خلية هو فقط بداية لإعادة تنشيط، حسبما اقترحه إشارة ضعيفة كهيئه الطرق والمواصلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التالية بحثت فعالية المزامنة thymidine تصور التعبير عن البروتين الفيروسي K-المواصلات (الشكل 2). بعد تم تنفيذ كتلة thymidine مزدوجة لمزامنة TREX BCBL-1 الخلايا في مرحلة انتقالية المرحلة G1/S، تم تنفيذ البروتوكول السابق ذكره (دون LANA ورنابي تلطيخ). عن طريق فحص تلطيخ كهيئه الطرق والمواصلات، من الواضح أن الخلايا متزامنة يستجيب أكثر لإعادة تنشيط المحفزات من السكان غير المتزامنة. من الدراسات السابقة التي أجريت في مختبر إيزومييا (البيانات لا تظهر)، أنه تم التحقق من أن رنابي أيضا كولوكاليزيس أكثر تواترا مع كهيئه الطرق والمواصلات بعد المزامنة دورة الخلية.

Figure 2
رقم 2: فعالية thymidine. وأجرى الجيش الملكي النيبالي-الأسماك على خلايا ك TREX-هيئة الطرق والمواصلات BCBL-1. الخلايا (المؤشرة "2 x خاصتك" العنوان) كانت متزامنة مع كتلة thymidine مزدوجة. يعاملون كل السكان خلية المتزامنة وغير المتزامنة مع طن سنوياً ودوكس لتم تهجين introns h. 4 كهيئه الطرق والمواصلات "الحمض النووي الريبي الأسماك" المسابير. الخلايا التي يتم أحمر موحد لا يتم overexpressing كهيئه الطرق والمواصلات، وبدلاً من ذلك ميتة، التحقق من صحة مع DAPI تلطيخ (لا تظهر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وكملاحظة عامة، من المهم جداً وصمة عار الخلايا مع DAPI عند تنفيذ هذا البروتوكول. يمكن بسهولة التعرف على خلايا أبوتوتيك بتجزئة النووية وبلبينغ. نظراً للمحفزات التعريفي الثقيلة وممارسات الثقافة العامة الخلية، من الشائع لبعض الخلايا الميتة أن ينظر. من المهم دائماً وصمة عار مع DAPI كوسيلة أساسية تمييز بين الخلايا الحية والميتة. أحياناً الأجسام المضادة أو تحقيقات الجيش النيبالي الملكي سوف ننشغل في الخلايا أبوبتوتيك وتنتج الإشارات، ونتيجة لذلك من المهم أن استبعاد تلك الخلايا من التحليلات. تلوين DAPI يمكن أن تخدم العديد من الوظائف الإضافية، على سبيل المثال في الشكل 3، فإنه من الواضح أن الكائن هو مبين بالسهم فعلا ثلاث خلايا منفصلة بدلاً من واحدة.

من المهم ملاحظة أن الصور المعروضة في الشكل 3 و 4 الشكل كانت ديكونفولفيد مما يخلق نمطاً أكثر الشروريه. عن طريق فحص وصمة عار رنابي، أشار إلى الفرق بين الخلايا بالسهم ويمكن رؤية الخلايا الأخرى المحيطة بها. جدير بالذكر أن نذكر أن إشارة رنابي هو أكثر وضوحاً من المعتاد بسبب deconvolution.

استخدام الفحص المجهري 3D جنبا إلى جنب مع هذا الأسلوب يسمح لنا باستجواب العلاقة المكانية بين رنابي و LANA كهيئه الطرق والمواصلات. على سبيل المثال، في الشكل 4، يمكن رؤية الهياكل الشبيهة بخاتم رنابي مع كشف الجينوم منقط على الهامش. بشكل عام، كولوكاليزيس LANA عادة مع رنابي في الخلايا النامية المصانع النسخ. ومع ذلك، ليس كل من النقاط LANA كولوكاليزي مع رنابي، الدراسات بما في ذلك 4ال البعد (الوقت) سيكون من الضروري توضيح هذا النمط الظاهري. من المهم إضافة أن النقاط LANA القليلة التي لا كولوكاليزي مع إشارات كهيئه الطرق والمواصلات وتمثل عدم تجانس ابيسومال في الاستجابة للمحفزات تنشيط حتى داخل خلية مفردة (الشكل 4).

Figure 3
الشكل 3: "إيفا جنبا إلى جنب" وانترون الجيش الملكي النيبالي-الأسماك- إيفا، والجيش الملكي النيبالي-الأسماك أجرى على خلايا ك TREX-هيئة الطرق والمواصلات BCBL-1. الجينوم الفيروسي كانت موجودة مع إيمونوستينينج LANA (الأخضر)، نشطة النسخ كان متصور مع الجيش الملكي النيبالي-أسماك منطقة إنترون كهيئه الطرق والمواصلات مرناً (أصفر)، والتجمعات رنابي (الأحمر) كانت تسميته بايفا، والخلايا كانت الملون وأخيراً استخدام DAPI للصورة الحمض النووي (أزرق). خلايا ك TREx-هيئة الطرق والمواصلات BCBL-1 كانت متزامنة باستخدام كتلة thymidine مزدوجة، ثم أعيد تنشيط الخلايا عن طريق الحضانة مع طن سنوياً ودوكس ح 4، وبعد 24 ساعة تم إصلاح الخلايا، بيرميبيليزيد، وكذلك على استعداد للتصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: 3D التصور المصانع النسخ الفيروسية. الجيش الملكي النيبالي إنترون-الأسماك استخدام المواصلات ك إنترون المسابر (أزرق فاتح)، immunostaining رنابي (أحمر) و LANA (الأخضر)، والحمض النووي DAPI تلطيخ (أزرق داكن). ديكونفولفيد عرض ثلاثي الأبعاد مكدس Z المتخذة في المجهر وتجهيزها وشيدت في برامج التصوير التجاري (انظر الجدول للمواد). تم تجهيز خلايا ك TREx-هيئة الطرق والمواصلات BCBL-1 thymidine مزدوجة متزامنة وثم تعامل مع طن سنوياً ودوكس للخلايا 4 h. ح 28 بعد إعادة تنشيط وحفز. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك بعض الجوانب للبروتوكول التي يمكن تعديلها لاستيعاب ظروف غير عادية. ويمكن أيضا تغيير خيار التثبيت و permeabilization المخازن المؤقتة. للمخازن المؤقتة للتثبيت، بارافورمالدهيد أيضا فعال ويمكن استخدام الإيثانول بيرميبيليزيشن.

تبريد الفورمالدهايد مع جليكاين يوصي برنامج تلفزيوني كما أنه يمنع فورمالدهايد تعطيل الأجسام المضادة في حالة عدم وجود ألبومين المصل البقري (BSA)، ولكن إذا كان يتم غسلها كوفيرسليبس دقة كافية، يمكن تخطي هذه الخطوة برنامج تلفزيوني جليكاين. في البروتوكول، وتجنب استخدام ألبومين المصل البقري كحل حظر. إجراء دراسات تجريبية في مختبر إيزومييا أظهرت إشارات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك الأضعف، يفترض أن سبب تدهور الجيش الملكي النيبالي. إذا حجب لجسم الابتدائي ضروري، فإنه من المستحسن استخدام رناسي الحرة جيش صرب البوسنة. من التجربة السابقة، لوحظ أن إدراج جيش صرب البوسنة ليس ضروريا في رد الفعل في حالة معينة الجسم،. ومع ذلك، من المستحسن دائماً إدراج مبلغ فائض من الخميرة الحمض الريبي النووي النقال في الحضانة جميع الخطوات للحيلولة دون تدهور الجيش الملكي النيبالي. وقد لوحظ أن استخدام الحمض الريبي النووي النقال كحظر عامل زيادة محددة الجيش الملكي النيبالي-الأسماك الإشارات.

تم تنفيذ المزامنة دورة الخلية لإنتاج إعادة تنشيط كشف أكثر كفاءة ومتزامن. لتزامن دورة الخلية، المجاعة هيدروكسيوريا أو المصل قد يكون النهج البديلة. قد أكد أن هيدروكسيوريا قدر فعالية استخدام كتلة thymidine، رغم أن الحضانة مع هيدروكسيوريا وحدها بإعادة تنشيط كشف ضعيفة.

كيف يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسات أخرى؟ في منشور مختبر إيزومييا في آخر، تبين أن كولوكاليزاتيون للكتابة بنشاط ابيسوميس كشف ورنا بول الثاني، إنزيم ضروري للحمض النووي الريبي النسخ. ومع ذلك، فمن المعروف أن هناك عددا من وسائل تفعيل المشارك، ريبريسورس المشارك، وعوامل النسخي الخلوية المشاركة في كشف تنظيم الجينات. تاريخيا استخدمت RT-PCR الكمي في عدد سكان (خليط من إعادة تنشيط وخفية) من الخلايا المستزرعة، التحديد الكمي للنصوص الفيروسية، وتقييم آثار على تعبير الجينات الفيروسية. استخدام النهج المذكور أعلاه، يمكن تضييق التحليلات إلى أسفل إلى مستوى ابيسومال واحد لدراسة النسخ الفيروسية. وهكذا، يمكن دراسة تنظيم الزمانية المكانية للإنزيمات الخلوية والفيروسية الأخرى التبصر في ارتباطها بتنشيط كشف. الجدير بالذكر أيضا أن أذكر أنه نظراً للطابع عابر منطقة إنترون الحمض النووي الريبي مرهون بتدهورها هجن تحقيقات "الجيش الملكي النيبالي الأسماك" وعادة تعريب النسخ النشطة يجري فيها، إلا إذا هي لا المتدهورة في إينترونس على الفور، يمكن أن يقدم المسابير الأسماك الإشارات التي لا تقع دائماً قرب النسخ النشطة.

من الصعب الوقت الحاضر، لدراسة العلاقة بين تكوين النسخ الخلوية المصانع والتعبير الجيني اللاحقة نظراً لأحجام الجينوم وتعقيد تكوين مروجين الخلوية. وفي هذا الصدد، كشف ابيسوميس يمكن أن تكون أداة مثالية نتيجة حجمها الجينوم صغيرة نسبيا، آليات إعادة تنشيط المعرفة مع تشكيلات تجميع الجيش الملكي النيبالي بول الثاني واضحة. باستخدام مانيبولابل كروموسوم لكشف المصغر الفيروسية، هيربيسفيرولوجي يمكن أن تسهم ميدان البحوث الخلوية التخلق من زاوية فريدة من نوعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

واضعي هذه الورقة ليس لهم علاقات مالية أو تضارب المصالح المتنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من منحة "المعاهد الوطنية للصحة" (R01-DE025985) و "الأمريكية سرطان المجتمع البحث الباحث تحكيم" (RSG-13-383-MPC). وأيد هذا العمل أيضا منح من وزارة الزراعة الأمريكية (2015-67015-23268 و 2014-67015-21787) ومنحة مبادرة بحوث جديدة من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium 1650 GlutaMAX Gibco by Life Technologies 61870-036 Needs to be warmed to 37 °C
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Inc. FB-11
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco by Life Technologies 10378-016
Thymidine  Sigma Aldrich T9250
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution Gibco by Life Technologies 14190-144
TPA Sigma Aldrich P1585
Sodium Butyrate  Sigma Aldrich B5887
Formaldehyde Solution  Sigma Aldrich 252549 Corrosive, toxic, health hazard
Diethyl Pyrocarbonate Sigma Aldrich D-5758 Acute toxicity 
Glycine Sigma Aldrich 410225
Acetone Sigma Aldrich 179124 Flammable, toxic
Methanol Fisher Chemical  67-56-1 Flammable, toxic, health hazard
Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 EMD Milipore 05-623
Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae)  Sigma Aldrich 9014-25-9
Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) Thermo Fisher Scientific  15557044
Formamide  Sigma Aldrich 295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution EMD Milipore 1916C093
DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific  D1306
slowFade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Micro cover glass 22x22 Matsunami C022221
VoloCITY 3D imaging software
DeltaVision microscope
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).

Tags

علم الأحياء الدقيقة، ومسألة 131، مصنع النسخ الفيروسية، كشف، ساركومه كابوزي المرتبطة هربس، النسخ، رنا بوليميراز الثاني، الجيش الملكي النيبالي-الأسماك، النسخ النشطة
الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. … More

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56832, doi:10.3791/56832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter