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Biology

3 डी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वायरल प्रतिलेखन कारखानों के कार्यात्मक इमेजिंग

Published: January 18, 2018 doi: 10.3791/56832

Summary

वायरल transcriptional कारखानों असतत संरचनाओं कि सेलुलर आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय से समृद्ध कर रहे है के लिए प्रतिक्रियाशीलता के दौरान वायरल जीन प्रतिलेखन वृद्धि कर रहे हैं । यहां, एक विधि सक्रिय रूप से 3 डी परमाणु अंतरिक्ष में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और सीटू आरएनए संकरण में से एक संयोजन के द्वारा वायरल क्रोमेटिन लिखित की साइटों का पता लगाने के लिए वर्णित है ।

Abstract

यह सर्वविदित है कि स्थानिक और जीन के लौकिक विनियमन उचित जीन अभिव्यक्ति शासी का एक अभिंन हिस्सा है । नतीजतन, यह समझने के लिए अमूल्य है, जहां और जब प्रतिलेखन परमाणु अंतरिक्ष के भीतर जगह ले जा रहा है और एक ही कोशिका नाभिक के भीतर संक्रमित episomes के बीच संबंध कल्पना । यहाँ, दोनों इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आइएफए) और आरएनए-मछली सक्रिय रूप से combinedto Kaposi की सार्कोमा-एसोसिएटेड gerpevirusnoy (KSHV) episomes पहचान की गई है । KSHV विलंबता से जुड़े परमाणु प्रतिजन (लाना) दाग से, यह पता लगाने के लिए जहां वायरल episomes नाभिक के भीतर मौजूद संभव है । इसके अलावा, आरएनए-मछली जांच डिजाइन द्वारा एक वायरल जीन है, जो केवल उत्पादक संक्रमण के दौरान व्यक्त की है intron क्षेत्र को लक्षित करने के लिए, नवजात आरएनए टेप स्थित किया जा सकता है । आणविक जांच के इस संयोजन का उपयोग करना, यह बड़े वायरल टेप कारखानों के विधानसभा कल्पना और KSHV पुनर्सक्रियण के दौरान वायरल जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक विनियमन विश्लेषण संभव है । विरोधी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय एंटीबॉडी धुंधला सहित द्वारा, एक भी पुनः क्रियाशीलता के दौरान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (RNAPII) एकत्रीकरण और KSHV प्रतिलेखन के बीच संघ कल्पना कर सकते हैं.

Introduction

यह तेजी से स्पष्ट है कि नाभिक के spatiotemporal संगठन eukaryotes में पतले देखते जीन अभिव्यक्ति नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है हो गया है । अधिकांश ऊतक विशिष्ट जीन कई गुणसूत्रों पर वितरित कर रहे है और एक समंवित तरीके से1में विशिष्ट उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए तुल्यकालिक विनियमित किया जाना चाहिए । कोशिकाओं एक विशिष्ट परमाणु अंतरिक्ष1करने के लिए एक साथ जीन और उनके सीआईएस नियामक घटकों को लाने के एक तरीके के रूप में सक्रिय क्रोमेटिन हब () का निर्माण ।

यह भी विभिंन अध्ययनों द्वारा प्रदर्शित किया गया है कि हालांकि नाभिक बहुत घने और चिपचिपा लगता है, जैविक रूप से सक्रिय अणुओं नाभिक पार नहीं बल्कि जल्दी से प्रसार के माध्यम से कर सकते है2। इस अल्पकालिक संपत्ति का एक परिणाम के रूप में, बाइंडिंग साइट से सबसे डीएनए बंधन प्रोटीन ' छलांग ' बंधन साइट के लिए, परमाणु अंतरिक्ष के आसपास अपने रास्ते लग रहा है, जो एक उच्च अनुकूली और बहुमुखी नाभिक के लिए अनुमति देता है2

नाभिक के भीतर इस तरह के अणुओं के गतिशील व्यवहार के बावजूद, जैसे झिल्ली के बिना परमाणु शरीर (लेकिन तक सीमित नहीं) nucleolus, Cajal निकायों, और promyelocytic ल्यूकेमिया परमाणु निकायों (पीएमएल-एनबी) अभी भी मौजूद हैं । यह ऐसे मिलकर डीएनए को दोहराता (nucleolus), rRNA (nucleolus) और संरचनात्मक प्रोटीन जैसे coilin (Cajal निकायों) या पीएमएल प्रोटीन (पीएमएल-NB) के रूप में इस तरह के तंत्र की एक किस्म के माध्यम से है कि इन का एक साथ निर्माण पकड़3,4,5 . इन संरचनाओं और प्रतिलेखन कारखानों जैसे अंय सभाओं मचान है कि न केवल आवश्यक घटकों के स्थानीय एकाग्रता बढ़ाने के रूप में सेवा है, लेकिन यह भी प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की संरचना को विनियमित करने के लिए उंहें अंततः बनाने के लिए कुशल सेलुलर कार्यों के लिए केंद्रीय साइट6

visualizing जब और जहां परमाणु संरचनाओं फार्म epigenetics अध्ययन शोधकर्ताओं को जानकारी का खजाना प्रदान करता है । एक वायरोलॉजी परिप्रेक्ष्य से, इस तरह के KSHV के रूप में अव्यक्त रूप से संक्रमित वायरस, के पुनर्क्रियाशीलता, काफी नाभिक और परमाणु एंजाइमों के वितरण के परिदृश्य को बदलने के लिए मुख्य रूप से सेलुलर जीन से प्रतिलेखन बदलाव वायरल जीन के लिए, अंततः पूरी तरह कार्यात्मक वायरल संतति7,8का उत्पादन । कैसे KSHV वायरल जीन अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए सेलुलर जीन अभिव्यक्ति मशीनरी में हेरफेर करता है? इस तरह की जानकारी भी लौकिक सेलुलर जीन विनियामक तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है ।

अंय सभी herpesviruses की तरह, KSHV दो जीवन चक्र lytic प्रतिकृति और विलंबता कहा जाता है । KSHV मुख्य रूप से विलंबता चरण में रहता है, जिसमें अपने वायरल जीन अभिव्यक्ति की सबसे खामोश है, सिवाय विलंबता जुड़े जीन9,10. विलंबता KSHV के दौरान विलंबता जुड़े परमाणु प्रतिजन (लाना) है, जो constitutively वायरल जीनोम और तार मानव गुणसूत्र11के लिए वायरल क्रोमेटिन बांध उत्पादन करता है । के वायरल जीनोम के साथ LANA अंतरंग संबंध के कारण, यह संभव है कि आइएफए और DAPI का उपयोग करने के लिए दाग और पता लगाने जहां वायरल episomes मेजबान क्रोमेटिन के संबंध में थे ।

एकल episome स्तर पर KSHV पुनर्सक्रियण का अध्ययन करने और संक्रमित कोशिका में अन्य वायरल episomes के साथ सहयोग करने के लिए, सीटू में सक्रिय रूप से टाइपिंग वायरल क्रोमेटिन का पता लगाने की रणनीति स्थापित की गई है । तदनुसार, LANA और RNAPII आइएफए intron आरएनए-मछली के साथ संयुक्त थे, आरएनए-मछली जांच है कि intron क्षेत्र के लिए बाध्य पैदा करके (सटीक जांच अनुक्रम KSHV K के सबसे हाल ही में प्रकाशन8में पाया जा सकता है)-आरटीए-कुंजी वायरल प्रोटीन है कि आवश्यक और KSHV पुनर्क्रियाशीलता के लिए पर्याप्त है-यह पहचान जहां प्रतिलेखन वास्तव में जगह8,11,12,13,14,15 . यह intron आरएनए-मछली तकनीक शोधकर्ताओं कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है, जहां mRNA पहले यह ब्याह किया जाता है और कोशिका करने के लिए निर्यात16,17.

KSHV जैसे 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (टीपीए) और citrullinated deacetylase अवरोधकों जैसे सोडियम butyrate के रूप में phorbol एस्टर सहित विभिन्न रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा पुनः सक्रिय किया जा सकता है, इसके अतिरिक्त KSHV के व्यक्त द्वारा पुनः सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया जा सकता वायरल टेप फैक्टर, कश्मीर-आरटीए19। शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक पुनर्क्रियाशीलता उत्प्रेरण से पहले सेल के चक्र को सिंक्रनाइज़ करके KSHV पुनर्सक्रियण की दक्षता में वृद्धि की है18. इस प्रकार, इन विशेष अध्ययन के लिए, कोशिकाओं को एक डबल thymidine ब्लॉक (प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित) का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किया गया और टीपीए और doxycycline (Dox) के साथ एक कम समय के लिए मशीन । Doxycyline उपयोग किया गया था क्योंकि इन प्रयोगों में उपयोग की गई सेल लाइन में एक doxycycline-inducible k-आरटीए कैसेट है, जिसे सीडीएनए से क्लोन किया गया था और इसमें k-आरटीए का intron क्षेत्र शामिल नहीं है । हालांकि यह केवल प्रेरित k-आरटीए अभिव्यक्ति का उपयोग कर KSHV को पुनः सक्रिय करने के लिए संभव है, यह अन्य शोधकर्ताओं द्वारा सिद्ध किया गया है कि विभिन्न जैव रासायनिक कारकों की एक किस्म के कारण कश्मीर-आरटीए अभिव्यक्ति अकेले एक कमजोर reसक्रियण उत्तेजनाओं20साबित होता है. इन सभी के संयोजन से, और समय की एक छोटी अवधि के लिए दवा की मशीन को सीमित करके, एक मजबूत लेकिन नहीं पीढ़ी कृत्रिम KSHV पुनर्क्रियाशीलता इमेजिंग के लिए प्राप्त किया गया था ।

के बाद लेबल LANA, RNAPII, K-आरटीए introns, और डीएनए के रूप में इस पत्र में वर्णित, 3d प्रतिदीप्ति इमेजिंग एक widefield deconvolution माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रसंस्करण के बाद, सक्रिय वायरल episomes के स्थानिक वितरण ठीक से मूल्यांकन किया जा सकता है । इस तकनीक का प्रयोग करते हुए, सक्रिय क्रोमेटिन केन्द्रों और अन्य नाभिकीय संरचनाओं के गठन के मौलिक स्वरूप के संबंध में केंद्रीय प्रश्नों का अध्ययन किया जा सकता है । एक ही सेल है कि एक ही नियामक तत्वों प्रक्रियाओं में समान वायरल episomes होने spatiotemporal जीन विनियामक तंत्र की समझ को गहरा करने के लिए एक अनूठा अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।

इमेजिंग एकाधिक सेल अलग समय अंक पर तय नमूनों की एक स्वाभाविक गतिशील आणविक प्रक्रिया की सीमा है कि सूक्ष्म या छोटे पैमाने प्रतिदीप्ति वितरण में परिवर्तन नहीं पता चला रहे है या तुच्छ समझा । यह सही है जब तक कि दुर्लभ उदाहरण में, हर कोशिका मनाया समान सूक्ष्म परिवर्तन प्रदर्शित करता है । इस प्रकार, सक्रिय वायरल प्रतिलेखन और अंय परमाणु संरचनाओं का पूरा spatiotemporal संबंध गंभीर रूप से तय इमेजिंग का उपयोग कर मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है । इन तकनीकी चुनौतियों का पता करने के लिए, सबसे अच्छा तरीका वायरल episomes चिह्नित किया है और समय के साथ प्रमुख सेलुलर एंजाइमों के स्थान का पालन करने के लिए है कि छवि जीवित कोशिकाओं के लिए है ।

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Protocol

चेतावनी: इस प्रक्रिया में प्रयुक्त सेल लाइनों संक्रामक वायरस होते हैं, सावधान रहना और केवल स्तर 2 बीएसएल सुविधा या उच्चतर में आगे बढ़ना ।

1. सेल की तैयारी और रखरखाव

  1. संस्कृति TREx-K-आरटीए BCBL-1 कोशिकाओं (या एक अंय KSHV संक्रमित पॅल सेल लाइनों) RPMI1640 मध्यम में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन streptomycin glutamine समाधान के साथ पूरक ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2) के साथ बढ़ती कोशिकाओं, सुनिश्चित करने के लिए लगातार विकसित करने के लिए और 1:4 के अनुपात से हर 2-4 दिन कोशिकाओं विभाजित करने के लिए ।
  3. अच्छा सेल विकास और आकृति विज्ञान की पुष्टि करने के लिए हर दिन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ सेल संस्कृतियों की निगरानी, अन्यथा यह सेल संस्कृति को पुनः आरंभ करने के लिए या तदनुसार सेल संस्कृति शर्तों को समायोजित करने के लिए सिफारिश की है.

२. Thymidine तुल्यकालन आणि Lytic प्रेरणे

  1. एक 10 सेमी पेट्री डिश में, प्लेट TREx-K-आरटीए BCBL-ताजा तैयार मीडिया में 1 कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं मीडिया के 2 मिलीलीटर)
  2. डिश, मिश्रण और 18 एच के लिए मशीन के लिए २०० mm thymidine (अंतिम एकाग्रता: 2 मिमी) जोड़ें ।
  3. ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक बाँझ 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धो, फिर से केंद्रापसारक, और हौसले से तैयार मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड । 3 बहाकर की कुल के लिए दोहराएं । नए सिरे से तैयार मीडिया में पुनर्निलंबित ।
  4. कक्षों को 8 ज के लिए S-phase से बाहर निकलने दें ।
  5. thymidine जोड़ें (अंतिम एकाग्रता: 2 मिमी), मिश्रण और 16 एच के लिए मशीन ।
  6. ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक बाँझ 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धो, फिर से केंद्रापसारक, और हौसले से तैयार मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड । 3 बहाकर की कुल के लिए दोहराएं । नए सिरे से तैयार मीडिया में पुनर्निलंबित ।
  7. वायरल पुनः सक्रियण प्रेरित करने के लिए, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-एसीटेट (टीपीए, अंतिम एकाग्रता 20 एनजी/एमएल) और doxycycline (DOX, अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/एमएल) सेल संस्कृति के लिए, मिश्रण और 4 एच के लिए मशीन । एक K-आरटीए inducible कैसेट के बिना सेल लाइनों के लिए, टीपीए का उपयोग कर पुनर्क्रियाशीलता उत्तेजित (अंतिम एकाग्रता 20 एनजी/एमएल और सोडियम butyrate (1 मिमी)) ।
  8. ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक बाँझ 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) बफर के साथ कोशिकाओं को धो, फिर से केंद्रापसारक, और पूरा संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को पुनः स्थगित । 3 बहाकर की कुल के लिए दोहराएं । पूर्ण संस्कृति मीडिया में पुनर्निलंबित ।
  9. 24 h के लिए कक्षों को बढ़ने दें ।

3. निर्धारण और Permeabilization

नोट: आगे बढ़ने से पहले, फिक्सिंग समाधान सुनिश्चित (DEPC-इलाज पंजाब में ३.७% formaldehyde), diethyl pyrocarbonate-इलाज फॉस्फेट-बफर खारा (DEPC-पंजाबियों), glycine DEPC पंजाबियों (glycine के अंतिम एकाग्रता: १०० मिमी) और permeabilizating समाधान (५०% एसीटोन, ५०% मेथनॉल) तैयार कर रहे हैं । विशेष रूप से, प्रत्येक स्लाइड कम ५००,००० कक्षों की आवश्यकता होगी, यदि आवश्यक हो तो गुणा करें और कक्षों के स्वस्थ होने पर विशेष रूप से वापस जाने के लिए अतिरिक्त कक्ष शामिल करें ।

  1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  2. २०० x जी में 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को केंद्रापसारक DEPC पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं 3 बार धो लो । DEPC पंजाब के १.२ मिलीलीटर में पुनर्निलंबित ।
  3. coverslips की उचित संख्या प्लेस (प्रयोगात्मक सेटअप द्वारा निर्धारित) एक 6 अच्छी तरह से थाली के नीचे में ।
  4. पिपेट २०० सेल के µ एल DEPC प्रत्येक coverslip पर पंजाब के मिश्रण, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइड पर कम से ५००,००० कोशिकाओं रहे हैं । कोशिकाओं 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, और महाप्राण अतिरिक्त DEPC केवल कोशिकाओं की एक पतली परत छोड़ने पंजाबियों । इस प्रक्रिया में कक्षों को निकाला जाना सामांय है ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, उपयुक्त संरक्षण पहनते हैं ।
  5. ध्यान से हल फिक्सिंग के 1 मिलीलीटर (DEPC पंजाब में ३.७% formaldehyde) प्रत्येक कवर पर्ची के लिए जोड़ें । 10 मिनट के लिए ठीक करने के लिए कक्षों की अनुमति दें ।
  6. DEPC पंजाबियों के साथ 3 बार coverslips धो लें ।
  7. ध्यान से glycine DEPC पंजाबियों के 1 मिलीलीटर (glycine के अंतिम एकाग्रता: १०० मिमी) प्रत्येक कवर पर्ची के लिए जोड़ें । कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए बुझाने की अनुमति दें ।
  8. DEPC पंजाबियों के १.५ मिलीलीटर और 5 मिनट के लिए एक बरतन पर या तो जगह जोड़ें या दृढ़ता से हिला, लेकिन हाथ में धीरे से 1 min. महाप्राण अतिरिक्त DEPC पंजाबियों के लिए । कोशिकाओं को बाधित करने के लिए नहीं सावधान रहना । इस चरण को कुल 3 धुल के लिए दोहराएं ।
  9. ध्यान से प्रत्येक कवर स्लिप करने के लिए 1 मिलीलीटर permeabilizing समाधान (५०% एसीटोन, ५०% मेथनॉल) जोड़ें । 15 मिनट के लिए permeabilize करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें ।
    नोट: इस बिंदु पर, coverslips एक-20 ° c फ्रीजर में अब एक सप्ताह से अधिक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । ठंड से बचने या फ्रीजर में बिताए समय को कम करने के रूप में छवि गुणवत्ता जल्दी नीचा कर सकते हैं । सुनिश्चित करें कि जब फ्रीजर में है कि कोशिकाओं को गीला और मेथनॉल/एसीटोन में शामिल रहते हैं, और यह सुनिश्चित करना है कि वे ठीक से फ्रीजर से हटाने के बाद DEPC पंजाबियों के साथ reहाइड्रेट ।
  10. DEPC पंजाबियों के १.५ मिलीलीटर और 5 मिनट के लिए एक बरतन पर या तो जगह जोड़ें या दृढ़ता से हिला, लेकिन धीरे हाथ में 1 min. महाप्राण अतिरिक्त DEPC पंजाबियों के लिए, कोशिकाओं को बाधित नहीं सावधान रहना । इस चरण को कुल 3 धुल के लिए दोहराएं ।

4. आइएफए और आरएनए-मछली

नोट: आरएनए मछली जांच लेबलिंग और तैयारी के बारे में: के लिए K-आरटीए intron जो ९५९ आधार जोड़े, 31 अलग जांच उत्पंन किया गया है कि 20 आधार जोड़े थे प्रत्येक, के बारे में ५०% की GC सामग्री युक्त । कार्य और जांच के स्टॉक समाधान १०० µ एम और २.५ µ मीटर सांद्रता, क्रमशः में aliquoted थे ।

  1. आवश्यक प्रयोगात्मक जानकारी या अलग लेबल के कुछ प्रकार के साथ लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड ।
  2. एक नम कागज तौलिया के साथ एक सील प्लास्टिक कंटेनर के नीचे लाइन ।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार (१.५ µ एल के LANA एंटीबॉडी, ०.७५ µ एल के आरएनए पोल द्वितीय एंटीबॉडी, बेकर खमीर µ के 3 tRNA एल, DEPC पंजाबियों अप करने के लिए 30 µ एल), और प्रत्येक coverslip वर्तमान के लिए नुस्खा गुणा. प्रत्येक लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 30 µ एल प्लेस ।
    1. अनुमापन पहले ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी और इष्टतम राशि का उपयोग करें । शुद्ध आईजीजी का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो, के रूप में सीरम (जलोदर द्रव) RNase की बड़ी मात्रा में हो सकता है.
  4. coverslip (हल का सामना करना पड़ कोशिकाओं) लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्लेस और नम कागज तौलिया के साथ कंटेनर में स्लाइड ले जाएं । बुलबुले का परिचय नहीं सावधान रहना । प्लास्टिक लपेटो के साथ कंटेनर के बाहरी कवर । 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक मशीन में कंटेनर ले जाएँ ।
  5. एक मछली धोने बफर (2x खारा सोडियम साइट्रेट बफर (एसएससी) (अंतिम), 10% formamide, ९०% DEPC डीएच2O) तैयार करें ।
  6. 2x संकरण बफर (4x एसएससी, 20% dextran सल्फेट) तैयार करें ।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी और मछली intron जांच बफर (2x संकरण बफर के 20 µ एल तैयार (अंतिम 1x Hyb बफर), बेकर के खमीर tRNA के 4 µ l (अंतिम 10%), 4 µ l की formamide (अंतिम 10%), intron K-्त जांच (final १२५ nM), ०.८ µ g ऑफ सेकंडरी एंटीबॉडी, DEPC डीएच2 ४० µ एल तक ओ). हर स्लाइड की जरूरत के लिए नुस्खा गुणा ।
  8. मशीन के बाद, धोने की कोशिकाओं 5 मिनट प्रत्येक के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में DEPC पंजाबियों के साथ 3 बार ।
  9. 5 मिनट प्रत्येक के लिए मछली धोने बफर 3 बार के साथ धो लें । coverslip में रखें मछली-धोने बफर खत्म जब तक दूसरे एंटीबॉडी और intron जांच के मिश्रण की तैयारी (४.७ कदम) ।
  10. स्वच्छ ग्लास स्लाइड संकरण के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया ।
  11. प्लेस ४० माध्यमिक एंटीबॉडी और मछली intron प्रत्येक गिलास स्लाइड पर समाधान युक्त जांच के µ एल ।
  12. सेल की ओर से बफर के ऊपर नीचे का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड पर कोशिकाओं के साथ coverslips प्लेस, बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहना ।
  13. स्लाइड को एक प्लास्टिक कंटेनर में तल पर एक नम कागज तौलिया के साथ रखें । पहले प्लास्टिक लपेटो में प्लास्टिक कंटेनर लपेटें और फिर एल्यूमीनियम पंनी ।
  14. 16-24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड के साथ कंटेनर मशीन ।
  15. गर्मी के बाद, ध्यान से कांच स्लाइड के किनारे से coverslip स्लाइड, और 6 अच्छी तरह से ऊपर का सामना करना पड़ प्लेटों में वापस डाल दिया, और मछली के साथ धोने कोशिकाओं-धो 5 मिनट के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में 3 बार बफर ।
  16. 2x एसएससी के साथ कोशिकाओं को धो 2 बार ।
  17. 2x एसएससी में DAPI (1:1000) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं ।
  18. 2x एसएससी के साथ कोशिकाओं को धो 2 बार ।
  19. संकरण के लिए इस्तेमाल कांच स्लाइड साफ है, और कांच स्लाइड पर बढ़ते समाधान के 10 µ एल जोड़ें ।
  20. coverslips चेहरा बढ़ते समाधान पर नीचे रखें । बुलबुले का परिचय नहीं सावधान रहना ।
  21. एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ, धीरे अतिरिक्त बढ़ते समाधान को दूर करने के लिए, स्क्वैश कोशिकाओं को सावधान नहीं किया जा रहा है ।
  22. नेल पॉलिश का प्रयोग, coverslips के किनारे के आसपास एक पर्याप्त परत लागू करते हैं और शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  23. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें ।

5.3d प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

नोट: जबकि प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली के प्रकार का इस्तेमाल किया, निंनलिखित कदम मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इष्टतम छवि डेटा के अधिग्रहण को सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी के साथ भिंन होगा ।

  1. प्रतिदीप्ति photobleaching इमेजिंग के दौरान देरी करने के लिए निश्चित नमूनों और विरोधी फीका में माउंट मीडिया का इलाज ।
  2. उच्च गुणवत्ता उद्देश्य (जैसे कि एक 60X १.४२ N. a तेल-विसर्जन लेंस) का उपयोग करें, जो क्षेत्र के दृश्य में एक पूरे सेल (या सेल नाभिक) पर कब्जा कर सकते हैं ।
  3. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों का उपयोग कर, प्रत्येक प्रतिदीप्ति रंग चैनल के लिए जोखिम मानकों (उदा., उत्तेजना पावर, एक्सपोज़र समय) सेट करें । प्रतिदीप्ति छवियां प्राप्त ।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण नमूने है कि केवल एक फ्लोरोसेंट लेबल भी रंग चैनलों के बीच "crosstalk" के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इमेजिंग निश्चित सेल नमूनों के लिए, प्रतिदीप्ति उत्तेजना शक्ति (थोड़ा अधिक जोखिम समय के साथ) कम photobleaching को कम किया जा सकता है ।
  4. एक बार इमेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की गई है, एक ही जोखिम एक अध्ययन में सभी नमूनों के लिए सुसंगत मापदंडों को बनाए रखने-ताकि छवि डेटा सही विश्लेषण किया जा सकता है और तुलना में ।
  5. प्रदर्शन के बाद अधिग्रहण छवि प्रसंस्करण और 3 डी पुनर्निर्माण । आरएनए द्वारा कश्मीर-आरटीए टेप की पहचान-मछली संकेत (लाल), इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा लाना अणु (हरा), और परमाणु क्रोमेटिन (जहां लागू) DAPI (नीला) के साथ दाग ।
    नोट: सेल नाभिक के क्षेत्रों, जिसमें K-आरटीए और LANA सह संकुल रहे हैं, इस प्रकार वायरल प्रतिलेखन कारखानों और प्रतिकृति परिसर के साथ जुड़े माना जाता है ।

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Representative Results

एक थोड़ा संक्षिप्त प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया गया था, जहां BCBL-1 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया था और केवल LANA और कश्मीर-आरटीए आरएनए सना (चित्रा 1) थे. इस प्रयोग की जांच करने के लिए हमें अनुमति देता है जहां सक्रिय रूप से वायरल episomes टाइप कर रहे है और कोशिकाओं की आबादी में KSHV पुनर्सक्रियण उत्तेजनाओं के जवाब के विविधता । कक्ष में चित्र 1में तीर द्वारा इंगित किया गया, विशिष्ट K-आरटीए प्रतिदीप्ति क्षेत्रों में बारीकी से वायरल episomes के वितरण से मेल खाती है (LANA के साथ चिह्नित) सक्रिय प्रतिलेखन के लिए सबूत है KSHV जीनोम के करीब जगह ले । एक ही नमूने में, जैसे कि एक चित्रा 1 में ऐरोहेड द्वारा प्रतीक के रूप में कोशिकाओं को देखा जा सकता है, जो काफी कमजोर और फैलाना K-आरटीए प्रतिदीप्ति है कि काफी LANA के साथ ओवरलैप नहीं करता प्रदर्शन. यह सामांय लग रहा है कि कोशिकाओं की आबादी के भीतर वहां सक्रियकरण उत्तेजनाओं के जवाब की डिग्री में काफी भिंनता है दिखाता है ।

Figure 1
चित्र 1: वायरल episomes की सक्रिय प्रतिलेखन visualizing । BCBL-१ की कोशिकाओं पर आइएफए और आरएनए-मछली का प्रदर्शन किया गया । BCBL-1 कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ नहीं किया गया लेकिन टीपीए और सोडियम butyrate के साथ इलाज के लिए 4 ज. LANA immunostaining का उपयोग कर, वायरल जीनोम हरे रंग में visualized थे, जबकि आरएनए-मछली लाल रंग में सक्रिय प्रतिलेखन के लिए कश्मीर आरटीए introns लक्ष्यीकरण प्रदर्शन किया गया था । सेलुलर क्रोमेटिन पोस्ट निर्धारण और DAPI के साथ permeabilization दाग था । कश्मीर-आरटीए intron और LANA दाग एक साथ विलय कर दिया गया । पूर्ण तीर को पूरी तरह से सक्रिय है और VTFs बनाने है एक सेल को इंगित करता है । हालांकि ऐरोहेड एक ऐसे सेल की ओर इशारा कर रहा है जो केवल फिर से सक्रिय होने लगा है, जैसा कि कमजोर कश्मीर-आरटीए सिग्नल ने सुझाया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अगला thymidine तुल्यकालन की प्रभावशीलता वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति की कल्पना द्वारा जांच की थी कश्मीर-आरटीए (चित्रा 2) । एक डबल thymidine ब्लॉक G1/एस चरण संक्रमण पर TREX BCBL-1 कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए किया गया था के बाद, पहले से वर्णित प्रोटोकॉल (LANA और RNAPII धुंधला के बिना) किया गया था । कश्मीर का परीक्षण करके-आरटीए धुंधला, यह स्पष्ट रूप से स्पष्ट है कि सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं unसिंक्रनाइज़्ड जनसंख्या की तुलना में reसक्रियण उत्तेजनाओं के लिए और अधिक प्रतिक्रिया व्यक्त की है । पिछले Izumiya लैब में किए गए अध्ययनों से (डेटा नहीं दिखाया गया है), यह मान्य किया गया है कि RNAPII भी अधिक बार K-आरटीए के साथ सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन के बाद colocalizes.

Figure 2
चित्र 2: Thymidine प्रभावशीलता. आरएनए-मछली TREX K-आरटीए BCBL-1 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया । कोशिकाओं ("2x तेरा" शीर्षक से संकेत) एक डबल thymidine ब्लॉक के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया । दोनों अनसिंक्रनाइज़्ड और सिंक्रनाइज़ सेल आबादी के साथ टीपीए और DOX के लिए इलाज किया गया 4 h. K-आरटीए introns आरएनए मछली जांच करने के लिए संकर थे । कोशिकाओं है कि समान रूप से चमकीले लाल है K-आरटीए व्यक्त नहीं कर रहे हैं, इसके बजाय वे मर चुके हैं, DAPI धुंधला के साथ मांय (नहीं दिखाया गया है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक सामांय नोट के रूप में, यह बहुत DAPI के साथ कोशिकाओं दाग जब इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन महत्वपूर्ण है । Apototic कोशिकाओं को आसानी से परमाणु विखंडन और blebbing द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है । भारी प्रेरण उत्तेजनाओं और सामान्य कोशिका संस्कृति प्रथाओं को देखते हुए, यह कुछ मृत कोशिकाओं को देखा जा करने के लिए आम है । यह हमेशा के लिए एक प्राथमिक विधि के रूप में DAPI के साथ दाग के लिए जीना और मृत कोशिकाओं के बीच विचार महत्वपूर्ण है । कई बार एंटीबॉडी या आरएनए जांच अपोप्तोटिक कोशिकाओं में पकड़ा और संकेतों का उत्पादन हो जाएगा, फलस्वरूप यह विश्लेषण से उन कोशिकाओं को बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है. DAPI धुंधला कई अतिरिक्त कार्यों की सेवा कर सकते हैं, उदाहरण के लिए चित्रा 3में, यह स्पष्ट है कि तीर द्वारा दर्शाई गई वस्तु वास्तव में तीन अलग कोशिकाओं के बजाय एक है ।

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया छवियों इस प्रकार एक अधिक कबरा पैटर्न बनाने deconvolved थे. RNAPII दाग का परीक्षण करके, तीर और आसपास के अन्य कोशिकाओं द्वारा इंगित कोशिकाओं के बीच अंतर देखा जा सकता है । यह उल्लेख करने के लिए उल्लेखनीय है कि RNAPII संकेत deconvolution के कारण सामान्य से ज्यादा स्पष्ट है.

इस तकनीक के साथ 3 डी माइक्रोस्कोपी का उपयोग हमें RNAPII, लाना, और कश्मीर के बीच स्थानिक संबंध पूछताछ करने के लिए अनुमति देता है-आरटीए । उदाहरण के लिए, चित्रा 4में, अंगूठी की तरह RNAPII संरचनाओं KSHV परिधि पर बिंदीदार जीनोम के साथ देखा जा सकता है । सामांय में, LANA आमतौर पर प्रतिलेखन कारखानों के विकास की कोशिकाओं में RNAPII के साथ colocalizes । हालांकि, RNAPII के साथ LANA डॉट्स colocalize के सभी नहीं, 4गु आयाम (समय) सहित अध्ययन इस phenotype को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक होगा । यह कि कश्मीर के साथ colocalize नहीं है कि कुछ LANA डॉट्स जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है-आरटीए संकेतों भी एक व्यक्तिगत सेल (चित्रा 4) के भीतर reसक्रियण उत्तेजनाओं के जवाब में episomal विविधता का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Figure 3
चित्र 3: संयुक्त आइएफए और intron आरएनए-मछली । TREX K-आरटीए BCBL-1 कक्षों पर आइएफए और आरएनए-मछली का प्रदर्शन किया गया । वायरल जीनोम लाना (हरा) के immunostaining के साथ स्थित थे, सक्रिय प्रतिलेखन आरएनए के साथ visualized-कश्मीर के intron क्षेत्र के मछली-आरटीए mRNA (पीला), RNAPII (लाल) सभाओं आइएफए के साथ लेबल थे, और कोशिकाओं अंत में दाग थे छवि के लिए DAPI का उपयोग डीएनए (नीला) । TREx K-आरटीए BCBL-1 कोशिकाओं एक डबल thymidine ब्लॉक का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किया गया, तो कोशिकाओं टीपीए और 4 एच के लिए DOX के साथ मशीन के माध्यम से सक्रिय थे, और 24 ज बाद में कोशिकाओं को ठीक किया गया, permeabilized, और आगे इमेजिंग के लिए तैयार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: वायरल प्रतिलेखन कारखानों के 3 डी दृश्य । Intron आरएनए-मछली का उपयोग कश्मीर-आरटीए Intron जांच (हल्का नीला), immunostaining के RNAPII (लाल) और LANA (हरा), और DAPI डीएनए धुंधला (डार्क ब्लू) । Deconvolved एक जेड के 3 डी प्रतिपादन माइक्रोस्कोप पर ले लिया स्टैक, संसाधित और वाणिज्यिक इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर निर्माण (सामग्री की तालिका देखें). TREx K-आरटीए BCBL-1 कक्ष डबल thymidine सिंक्रनाइज़ और फिर टीपीए के साथ इलाज किया और 4 के लिए DOX h. reसक्रियण के बाद उत्तेजित किया गया था कोशिकाओं 28 h संसाधित किए गए थे । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

वहां प्रोटोकॉल है कि असामांय परिस्थितियों को समायोजित बदला जा सकता है के कुछ पहलुओं रहे हैं । निर्धारण और permeabilization के चुनाव भी बदले जा सकते थें. निर्धारण बफ़र्स के लिए, paraformaldehyde भी प्रभावी है और इथेनॉल permeabilization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

glycine पंजाबियों के साथ formaldehyde शमन की सिफारिश की है के रूप में यह गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) की अनुपस्थिति में एंटीबॉडी को अक्षम करने से formaldehyde रोकता है, लेकिन अगर coverslips अच्छी तरह से पर्याप्त धोया जाता है, glycine पंजाबियों कदम छोड़ दिया जा सकता है । प्रोटोकॉल में, एक अवरुद्ध समाधान के रूप में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन का उपयोग कर से बचें । पायलट अध्ययन Izumiya प्रयोगशाला में किए गए कमजोर आरएनए-मछली संकेतों, संभवतः शाही सेना के क्षरण के कारण दिखाया । यदि प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए ब्लॉकिंग की जरूरत है, यह RNase मुक्त BSA का उपयोग करने की सिफारिश की है । पिछले अनुभव से, यह ध्यान दिया गया है कि यदि एंटीबॉडी विशिष्ट है, BSA के शामिल किए जाने की प्रतिक्रिया में आवश्यक नहीं है । हालांकि, यह हमेशा के लिए सभी गर्मी में शाही सेना के क्षरण को रोकने के कदम में खमीर tRNA की एक अतिरिक्त राशि शामिल करने के लिए सिफारिश की है । यह ध्यान दिया गया है कि अवरुद्ध एजेंट के रूप में tRNA का उपयोग विशिष्ट आरएनए-मछली संकेतों में वृद्धि हुई ।

एक अधिक कुशल और सिंक्रोनस KSHV पुनर्सक्रियण का उत्पादन करने के लिए कक्ष सायकल सिंक्रनाइज़ेशन लागू किया गया है । सेल चक्र तुल्यकालन के लिए, hydroxyurea या सीरम भुखमरी वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है । यह पुष्टि की गई है कि hydroxyurea एक thymidine ब्लॉक का उपयोग कर के रूप में के रूप में प्रभावी है, हालांकि hydroxyurea अकेले के साथ मशीन कमजोर KSHV reएक्टिवेट करता है ।

इस तकनीक को अन्य अध्ययनों पर कैसे लागू किया जा सकता है? Izumiya है लैब सबसे हाल ही में प्रकाशन में, यह दिखाया गया है कि सक्रिय रूप से टाइप करने के colocalization KSHV episomes और आरएनए पोल द्वितीय, आरएनए प्रतिलेखन के लिए एक आवश्यक एंजाइम. हालांकि, यह ज्ञात है कि वहां सह के एक नंबर उत्प्रेरक, सह दमन, और सेलुलर transcriptional कारकों KSHV जीन विनियमन में शामिल हैं । मात्रात्मक RT-पीसीआर ऐतिहासिक रूप से एक जनसंख्या पर इस्तेमाल किया गया है (दोनों को पुनः सक्रिय करने और अव्यक्त) के प्रसंस्कृत कोशिकाओं का मिश्रण, वायरल टेप बढ़ाता है, और वायरल जीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव का आकलन । ऊपर वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करना, विश्लेषण एकल episomal स्तर के लिए नीचे संकुचित किया जा सकता है वायरल प्रतिलेखन की जांच । इस प्रकार, अंय सेलुलर और वायरल एंजाइमों के spatiotemporal विनियमन KSHV पुनर्सक्रियण के साथ अपने संघ में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए जांच की जा सकती है । यह भी उल्लेख है कि क्योंकि आरएनए intron क्षेत्र के क्षणिक प्रकृति उनके क्षरण पर निर्भर है कि आरएनए मछली जांच संकरण और आम तौर पर जहां सक्रिय प्रतिलेखन स्थान ले जा रहा है स्थानीयकरण, लेकिन अगर introns नीचा नहीं कर रहे हैं तुरंत, मछली जांच संकेत है कि हमेशा सक्रिय प्रतिलेखन के पास स्थित नहीं है मौजूद कर सकते हैं ।

फिलहाल, यह सेलुलर प्रतिलेखन कारखानों और बाद में जीन उनके जीनोमिक आकार और सेलुलर प्रमोटरों के विंयास की जटिलता के कारण अभिव्यक्ति के गठन के बीच संबंधों का अध्ययन करना मुश्किल है । इस संबंध में, KSHV episomes उनके अपेक्षाकृत छोटे जीनोम आकार का एक परिणाम के रूप में एक आदर्श उपकरण हो सकता है, स्पष्ट आरएनए पोल द्वितीय कुल संरचनाओं के साथ पुनर्क्रियाशीलता तंत्र परिभाषित किया । KSHV के manipulable वायरल मिनी गुणसूत्र का उपयोग करके, herpesvirology एक अद्वितीय कोण से सेलुलर epigenetics अनुसंधान क्षेत्र में योगदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

इस अखबार के लेखकों के पास कोई वित्तीय संबंध या हितों की प्रतिस्पर्धा का संघर्ष है.

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान (R01-DE025985) द्वारा समर्थित किया गया था और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च विद्वान पुरस्कार (RSG-13-383-MPC) द्वारा । यह काम भी अमेरिका के कृषि विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित (2015-67015-23268 और 2014-67015-21787) और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस से नए अनुसंधान पहल अनुदान था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium 1650 GlutaMAX Gibco by Life Technologies 61870-036 Needs to be warmed to 37 °C
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Inc. FB-11
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco by Life Technologies 10378-016
Thymidine  Sigma Aldrich T9250
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution Gibco by Life Technologies 14190-144
TPA Sigma Aldrich P1585
Sodium Butyrate  Sigma Aldrich B5887
Formaldehyde Solution  Sigma Aldrich 252549 Corrosive, toxic, health hazard
Diethyl Pyrocarbonate Sigma Aldrich D-5758 Acute toxicity 
Glycine Sigma Aldrich 410225
Acetone Sigma Aldrich 179124 Flammable, toxic
Methanol Fisher Chemical  67-56-1 Flammable, toxic, health hazard
Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 EMD Milipore 05-623
Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae)  Sigma Aldrich 9014-25-9
Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) Thermo Fisher Scientific  15557044
Formamide  Sigma Aldrich 295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution EMD Milipore 1916C093
DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific  D1306
slowFade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Micro cover glass 22x22 Matsunami C022221
VoloCITY 3D imaging software
DeltaVision microscope
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15

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References

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Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. More

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56832, doi:10.3791/56832 (2018).

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