Summary
Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.
Abstract
İyi genler kayma ve temporal düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu yöneten ayrılmaz bir parçası olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, nerede ve ne zaman transkripsiyon nükleer alanı içinde yer alıyor anlamak ve aynı hücre çekirdeği içinde enfekte episomes arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için çok değerli olduğunu. Burada, ayirt (IFA) ve RNA-balık olmuştur combinedto belirlemek aktif Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) episomes transkripsiyonu. KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA) Boyama tarafından viral episomes çekirdeği içinde bulunduğu bulmak mümkündür. Buna ek olarak, sadece verimli enfeksiyon sırasında ifade edilir, viral bir gen intron bölgesinin hedef için RNA-balık probları tasarlayarak doğmakta olan RNA transkript bulunabilir. Bu moleküler probları birleşimini kullanarak, büyük viral transkripsiyon fabrikalar Meclisi görselleştirmek ve mekansal düzenleme viral gen ekspresyonu KSHV yeniden etkinleştirme sırasında analiz etmek mümkündür. Anti-RNA polimeraz II antikor boyama dahil olarak, bir de RNA polimeraz II (RNAPII) toplama ve KSHV transkripsiyon yeniden etkinleştirme sırasında arasındaki ilişkiyi görselleştirebilirsiniz.
Introduction
Çekirdek kronolojik zamanmekansal organizasyonu hassas bir şekilde ayarlanmış gen ekspresyonu ökaryotlarda oransal olarak önemli bir rol oynar giderek netlik kazanmıştır. Çoğu doku belirli genler üzerinde birçok kromozomlar dağıtılır ve koordine bir şekilde1belirli uyaranlara yanıt için zaman uyumlu olarak düzenlenmiş olması gerekir. Hücreleri aktif Kromatin hub'lar (ACH) genleri ve CIS düzenleyici bileşenleri belirli nükleer alanı1buluşturan bir yolu olarak oluşturun.
Bu da tarafından çeşitli çalışmalar çekirdeği çok yoğun ve yapışkan görünse de, biyolojik olarak aktif molekülleri çekirdeği oldukça hızlı bir şekilde Difüzyon2erişebilen olduğunu kanıtlanmıştır. Sonucu olarak kısa ömürlü bu özellik, çoğu DNA bağlayıcı proteinler 'için son derece uyumlu ve çok yönlü çekirdek2sağlayan nükleer alanda etrafında kendi yollarını duygu site Bağlayıcısı için site bağlayıcısı üzerinden atlama'.
Biomolecules çekirdeği içinde bu dinamik davranış rağmen nükleer membran gibi organları (ama bunlarla sınırlı olmamak üzere) çekirdekçik, Cajal organları ve promyelötik lösemi nükleer organları (PML-NB) hala mevcut. Bu yapıları birlikte3,4,5 tutun proteinler (PML-NB) çeşitli mekanizmalar tandem DNA yineler (çekirdekçik), rRNA (çekirdekçik) ve Cajal aytac (organları) veya PML gibi yapısal proteinler gibi geçer . Bu yapılar ve diğer cemaat transkripsiyon fabrikalar gibi sadece gerekli bileşenleri yerel konsantrasyonu artırmak, ancak aynı zamanda proteinler ve nükleik asitler sonuçta oluşturmak için bunları içinde kompozisyon düzenleyen iskele olarak hizmet bir verimli hücresel işlevler6için merkezi bir sitedeki.
Nerede ve ne zaman nükleer yapılar formu epigenetik eğitim araştırmacılar için bilgi hazinesi sağlar görselleştirme. Viroloji açısından bakıldığında, KSHV gibi gizlice enfekte virüsler reaktivasyonu önemli ölçüde çekirdeği Peyzaj ve dağıtım nükleer enzimlerin transkripsiyon öncelikle hücresel genlerin viral genler için sonuçta kaydırmaya değiştirir için tamamen işlevsel viral döl7,8üretmek. KSHV viral gen ifadesi kolaylaştırmak için hücresel gen ifade makine nasıl işlemek? Bu bilgileri ayrıca zamansal hücresel gen düzenleyici mekanizmaları ışık.
Diğer herpesviruses gibi KSHV litik çoğaltma ve gecikme süresi olarak adlandırılan iki ömürleri vardır. Gecikme süresi ilişkili genlerin9,10dışında KSHV öncelikle içinde hangi en-in onun viral gen ifade susturulması, gecikme süresi aşamasında yer alır. KSHV üretir gecikme süresi sırasında gecikme süresi yapısal viral genom bağlar ve insan kromozom11viral Kromatin tethers nükleer antijen (LANA), ilişkili. Viral genom ile LANA'ın samimi ilişki nedeniyle IFA ve DAPI leke ve viral episomes ile ilgili olarak ana bilgisayar Kromatin nerede olduğunu bulmak için kullanmak mümkündür.
KSHV reaktivasyonu tek episome düzeyinde ve derneğin diğer viral episomes virüslü bir hücre ile çalışmaya, aktif viral Kromatin situ transkripsiyonu bulmak için bir strateji kurulmuştur. Buna göre LANA ve RNAPII IFA intron RNA-balık ile bu KSHV K-Rta-anahtar viral protein intron bölge (tam sonda dizileri-ebilmek bulunmak Izumiya laboratuar en son yayın8') bağlamak RNA-balık probları oluşturarak kombine edilmiştir gerekli ve yeterli KSHV yeniden etkinleştirme-BT tanımlamak mümkün için transkripsiyon aslında alıyordu nerede8,11,12,13,14,15 yere . Bu intron RNA-balık tekniği araştırmacılar spliced ve sitoplazma16,17' ye ihraç hemen önce nerede mRNA sentezlenir görselleştirmenizi sağlar.
KSHV tarafından phorbol esterleri gibi 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) dahil olmak üzere çeşitli kimyasal uyaranlara yeniden etkinleştirilebilir ve Histon deacetylase inhibitörleri gibi sodyum bütrat, ayrıca KSHV overexpression tarafından yeniden etkinleştirmek için indüklenen viral transkripsiyon faktörü, K-Rta19. Araştırmacılar başarıyla yeniden etkinleştirme18inducing önce hücre döngüsü eşitleyerek KSHV reaktivasyonu verimliliği artmıştır. Böylece, bu belirli çalışmalar için hücreleri bir çift timidin blok (aşağıda açıklanan iletişim kuralı) kullanarak ve TPA ve Doksisiklin (Dox) ile kısa bir süre için inkübe senkronize. Bu deneylerde kullanılan hücre kültürünü cDNA klonlanmış ve K-Rta intron bölgenin içermez Doksisiklin indüklenebilir bir K-Rta kaset olduğundan Doxycyline kullanıldı. Yeniden etkinleştirmek mümkündür ancak KSHV kullanarak sadece K-Rta ifade indüklenen, çeşitli farklı biyokimyasal faktörler nedeniyle K-Rta ifade yalnız bir zayıf reaktivasyonu uyaranlara20olmaktadır araştırmacılar tarafından kanıtlanmıştır. Bunların hepsi birleştirerek ve uyuşturucu incubations kısa bir süre için sınırlayarak, bir güçlü ama aşırı yapay KSHV etkinleştirme görüntüleme için sağlanır.
LANA, RNAPII, etiketleme sonra K-Rta intron ve DNA olarak bu yazıda açıklanan, 3D Floresans görüntüleme widefield deconvolution mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı ile işlendikten sonra aktif viral episomes kayma dağılımını düzgün değerlendirilebilir. Bu tekniği kullanarak, etkin Kromatin hub'ları ve diğer nükleer yapıların oluşumu temel doğa ile ilgili sorular Merkezi okudu olabilir. Aynı viral episomes aynı düzenleyici elemanlarının işleyen tek bir hücreye sahip kronolojik zamanmekansal gen düzenleyici mekanizmaları anlayışı derinleştirmek için benzersiz araştırma aracı temsil edebilir.
Farklı zaman noktalarda sabit birden çok hücre örnekleri doğal olarak dinamik bir moleküler süreci karakterize görüntüleme bir floresan dağıtım ince ya da küçük ölçekli değişiklikleri tespit edilmemiş veya önemsiz kabul kısıtlamadır. Nadir örneğini her hücresinde gözlenen aynı ince değişiklik görüntüler sürece bu doğrudur. Böylece, aktif viral transkripsiyon ve diğer nükleer yapıların tam kronolojik zamanmekansal ilişki eleştirel sabit Imaging'i kullanma değerlendirilemez. Bu teknik sorunları ele almak üzere, viral episomes işaretlenmiş resim canlı hücreleri ve zaman içinde anahtar hücresel enzimler konumunu takip için en iyi yaklaşım olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Bu yordamda kullanılan hücre hatları bulaşıcı virüs içerebilir, dikkatli olun ve yalnızca düzey 2 BSL tesis veya daha yüksek devam edin.
1. hücre hazırlık ve bakım
- Kültür TREx-K-RTA BCBL-1 hücreleri (veya başka bir KSHV enfekte PEL hücre hatları) RPMI1640 orta % 15 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin streptomisin glutamin çözüm ile desteklenmiştir.
- Sürekli olarak büyümeye ve 2 – 4 günde 1:4 oranında tarafından hücreleri bölmek için emin hücreleri ile %5 karbondioksit (CO2), 37 ° C'de büyümek.
- Hücre kültürleri iyi hücre büyümesini ve hücre kültürü yeniden başlatmak veya hücre kültür koşullar buna göre ayarlamak için tavsiye edilir Morfoloji, aksi takdirde onaylamak için her gün bir ışık mikroskobu ile izleyin.
2. timidin eşitleme ve litik indüksiyon
- Bir 10 cm Petri dish, plaka TREx-K-Rta BCBL-1 hücrelerde taze hazırlanan medya (1 x 106 hücreler/2 mL medya)
- 200 mM timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM) çanak, mix ve 18 h için kuluçkaya.
- 500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.
- Hücreler için 8 h S-faz çıkmak izin verir.
- Timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM), mix ve 16 h için kuluçkaya.
- 500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.
- Viral reaktivasyonu ikna etmek için 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, son konsantrasyonu 20 ng/mL) ve Doksisiklin (DOX, nihai toplama 100 ng/mL) hücre kültürü ekleyin, karıştırın ve 4 h için kuluçkaya. K-Rta indüklenebilir kaset olmadan hücre hatlarında TPA (son konsantrasyonu 20 ng/mL ve sodyum bütrat (1 mM)) kullanarak yeniden etkinleştirme teşvik.
- 500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve komple kültür medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Tam kültür medyada resuspend.
- Hücreler için 24 h büyümeye izin.
3. fiksasyon ve Permeabilization
Not: devam etmeden önce sabitleme çözüm (% 3.7 formaldehit DEPC tedavi PBS), Dietil pyrocarbonate tedavi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DEPC-PBS), glisin DEPC PBS olun (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) ve permeabilizating çözüm (% 50 aseton, % 50 metanol) hazırlanır. Genellikle, her slayt en az 0,5 milyon hücre gerektirir, gerekirse çarp ve özellikle hücreleri sağlıklı olmayan ilave hücreler için arka kadar içerir.
- Hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne toplamak.
- Hücreler için 200 x g. yıkama, 2 dk santrifüj kapasitesi 3 kez ile 1 mL steril DEPC PBS hücreleri. 1.2 mL DEPC PBS resuspend.
- (Deneysel Kur tarafından belirlenen) coverslips uygun sayıda 6-şey plaka dipleri yerleştirin.
- Her coverslip DEPC PBS karışımı hücrenin 200 µL pipet, en az 0,5 milyon hücre her slayt üzerinde olduğundan emin olun. Hücreler 2 min için yerleşmek izin ve aşırı DEPC hücreleri sadece ince bir tabaka bırakarak PBS Aspire edin. Bu süreçte kaldırılacak hücreleri normaldir.
Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek. - Dikkatli bir şekilde çözüm (DEPC PBS % 3.7 formaldehit) her kapak kayma sabitleme 1 mL ekleyin. 10 dakikadır düzeltmek hücreleri izin.
- Coverslips 3 kez DEPC PBS ile yıkayın.
- Dikkatle glisin DEPC PBS 1 mL ekleyin (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) her kapak kayma. 5 min için gidermek için hücreleri izin.
- Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca ama hafifçe el 1 dk. aspiratı aşırı DEPC PBS sallamayın. Hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.
- Dikkatle her kapak notu için çözüm (% 50 aseton, metanol % 50) permeabilizing 1 mL ekleyin. 15 dakikadır permeabilize hücrelere izin.
Not: Bu noktada, coverslips-20 ° C-dondurucu için artık bir hafta daha saklanabilir. Donma önlemek veya görüntü kalitesi hızla düşebilir gibi dondurucuya harcanan zamanı en aza indirmek. Hücreleri kalır dondurucu ne zaman ıslak ve kapalı metanol/aseton ve onlar düzgün DEPC PBS ile dondurucu kaldırılması sonra suyla temasa olduğunu emin olmak için emin olun. - Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca sallamak ama hafifçe el 1 dk. için aşırı DEPC PBS Aspire, hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.
4. IFA ve RNA-balık
Not: RNA balık sonda etiketleme ve hazırlık ile ilgili olarak: için K-959 baz çifti, 31 farklı probları intron olduğunu Rta oluşturulan bu 20 baz bir GC içeren çifti her, yaklaşık % 50 içerik. Çalışma ve hisse senedi çözümleri sondalar, sırasıyla 100 µM ve 2.5 µM konsantrasyonları, bölünmemeli idi.
- Mikroskop slaytlar ile gerekli deneysel bilgi ya da bir çeşit ayırt etiket etiket.
- Nemli kağıt havlu ile yapışmalı plastik konteyner alt çizgi.
-
Birincil antikor çözüm hazırlamak (1,5 µL LANA antikor, RNA Pol II antikor 0,75 µL, baker'ın 3 µL Maya tRNA, DEPC PBS 30 µL kadar) ve her coverslip mevcut tarifini çarpın. Birincil antikor çözüm her yer 30 µL mikroskop slayt etiketli.
- İlk faiz birincil antikor titre ve en uygun miktarda kullanın. Serum (asit sıvı) RNase büyük miktarda içerebilir olarak saflaştırılmış IgG, kullandığınızdan emin olun.
- Coverslip (çözüm dış yüzey hücreleri) etiketli mikroskop slaytlar yerleştirin ve nemli kağıt havlu ile konteyner içine slaytlar hareket. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun. Kapsayıcı plastik wrap ile dış kapak. Konteyner 37 ° C için 1 h için bir kuluçka içine taşıyın.
- Bir balık yıkama arabellek (2 x serum sodyum sitrat tampon (SSC) (son), % 10 formamide, % 90 DEPC dH2O) hazırlayın.
- 2 x hibridizasyon arabellek hazırlamak (4 x SSC, % 20 dextran sülfat).
- İkincil antikor ve balık intron sonda arabellek hazırlamak (2 hibridizasyon arabellek (son 1 x Hyb arabellek) x 20 µL, fırıncı mayası 4 µL tRNA (son %10), formamide (son %10), intron K-Rta sonda 4 µL (son 125 nM), 0.8 ikincil antikor, DEPC dH2 µg O kadar 40 µL). Gerekli her slayt için reçete çarpın.
- Kuluçka sonra hücreleri 3 kez DEPC PBS 5 min için 6 iyi plaka ile yıkayın.
- Balık yıkama arabellek 5 min için 3 kez yıkayın. Coverslip balık-yıkama arabellekte karışımı ikincisi antikor ve intron sonda (Adım 4.7) hazırlama bitiş kadar tutun.
- Temiz cam slaytlar için birincil antikor kuluçka hibridizasyon için kullanılan.
- 40 µL ikincil antikor ve her bir cam slayt üzerine solüsyon içeren balık intron sondası yerleştirin.
- Slayda hücrelerle coverslips kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmanız hücre yüzü aşağı bakacak şekilde arabellek üstüne yerleştirin.
- Nemli kağıt havlu ile plastik bir kap içine slaytlar altına yerleştirin. İlk plastik wrap ve sonra alüminyum folyo plastik kapta sarın.
- Kapsayıcı için 16-24 h 37 ° C'de slaytlar ile kuluçkaya.
- Kuluçka sonra dikkatlice coverslip cam slayt kenarından slayt ve geri yukarı dönük olacak şekilde 6 iyi tabak içine koymak ve balık-yıkama arabellekte 3 kere 6 iyi plaka 5 min için hücrelerle yıkayın.
- 2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.
- DAPI (1:1, 000) 2 ekleyin x SSC ve oda sıcaklığında 5 min için oturmak için izin verir.
- 2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.
- Hibridizasyon için kullanılan cam slaytlar temiz ve çözüm cam slaytlar üzerine montaj 10 µL ekleyin.
- Coverslips yüzü aşağı montaj çözümü üzerine yerleştirin. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun.
- Laboratuvar doku ile yavaşça hücreleri ezmeye değil dikkatli olmak aşırı montaj çözüm çıkarın.
- Tırnak cilası kullanarak, coverslips kenarında geniş bir tabaka uygulayın ve kurumasını sağlar.
- Floresans mikroskobu gerçekleştirmek için devam edin.
5. 3D Floresans mikroskobu
Not: protokoller floresan mikroskop sistem kullanılan türü ile değişir iken, aşağıdaki adımları en uygun görüntü verilerini nicel analiz edinimi sağlamak için yardımcı olacaktır.
- Sabit örnekleri pretreat ve anti-fade medya floresan photobleaching görüntüleme sırasında geciktirmek için mount.
- Tüm cep telefonu (veya hücre çekirdeği)-ebilmek esir alma yüksek kalite hedefi (örneğin bir 60 X 1,42 N.A petrol-daldırma lens), alan bakış açısı içinde kullanın.
- Pozlama parametreleri (örneğin, uyarma güç, pozlama süresi) pozitif ve negatif kontrol örnekleri kullanarak her Floresans renk kanalı için ayarlayın. Floresans görüntüleri elde etmek.
Not: yalnızca bir floresan etiketi pozitif kontrol örnekleri de renk kanalları arasında "çapraz karışma" düzeyini belirlemek için kullanılmalıdır. Görüntüleme sabit hücre numuneler için Floresans uyarma güç (biraz daha uzun pozlama süreleri ile) photobleaching en aza indirmek için azaltılabilir. - Görüntüleme protokolü kurulduktan sonra aynı pozlama parametreleri bir çalışmada tüm örnekleri için tutarlı korumak — böylece görüntü verilerini doğru bir şekilde analiz ve karşılaştırıldığında.
- Sonrası edinme görüntü işleme ve 3D yeniden gerçekleştirin. K-Rta transkript RNA-balık sinyal (kırmızı), LANA molekülleri ayirt (yeşil) ve nükleer Kromatin DAPI (mavi) ile lekeli (uygun olduğunda) tanımlayın.
Not: K-Rta ve LANA co kümelenmiş olan hücre çekirdeği bölgelerinde böylece viral transkripsiyon fabrika ve çoğaltma karmaşık ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biraz kısaltılmış bir protokol nerede BCBL-1 hücreler kullanıldı ve sadece LANA ve K-Rta RNA (şekil 1) lekeli gerçekleştirildi. Bu deney nerede viral episomes aktif transkripsiyonu ve hücre bir popülasyondaki KSHV reaktivasyonu bizi canlı tutan heterojen incelemek için bize izin verir. Şekil 1' deki bir ok ile belirtilen hücre içinde farklı K-Rta Floresans viral episomes (LANA ile işaretlenmiş) dağılımı uygun bölgelerde etkin transkripsiyon KSHV genleri yakın yer alan için kanıttır. Aynı örnekte hücreleri ok ucu şekil 1 ' deki miktarlara biri gibi hangi değil önemli ölçüde örtüşen çok zayıf ve diffüz K-Rta Floresans LANA ile sergi görülebilir. Bu genel bulma hücreleri bir nüfus içinde yeniden etkinleştirme bizi canlı tutan ölçüde önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: , Viral episomes etkin transkripsiyon görselleştirme. IFA ve RNA-balık BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen almıştır. BCBL-1 hücreleri değil senkronize ama 4 h kullanarak LANA immunostaining için TPA ve sodyum bütrat ile tedavi, RNA-balık K-Rta intron kırmızı bulunduğu etkin transkripsiyon için hedefleme gerçekleştirildi iken viral genom yeşil renkle görüntülenir. Hücresel Kromatin yazı fiksasyon ve permeabilization DAPI ile lekeli. K-Rta intron ve LANA lekeleri birlikte birleştirildi. Tam ok tam olarak yeniden ve VTFs oluşturan bir hücre işaret eder. Ok ucu yeniden etkinleştirmek için daha yeni başlıyor bir hücre doğru işaret ediyor iken K-Rta sinyali zayıf tarafından önerilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Sonraki timidin eşitleme etkinliğini ifade viral protein K-Rta (Şekil 2) görselleştirme tarafından incelenmiştir. Bir çift timidin blok G1/S faz geçiş TREX BCBL-1 hücreleri eşitlemek için gerçekleştirilen sonra daha önce açıklanan protokol gerçekleştirildi (LANA ve RNAPII boyama). K-Rta boyama inceleyerek, eşitlenmiş hücreleri daha eşitlenmemiş nüfusundan reaktivasyonu uyaranlara yanıt açıkça belirgindir. Izumiya laboratuvar (veri gösterilmez) yürütülen önceki çalışmalardan RNAPII da daha sık K-Rta ile hücre döngüsü senkronizasyondan sonra colocalizes da doğrulandı.
Resim 2: Timidin etkinliğini. RNA-balık TREX K-Rta BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Hücreleri (belirttiği "2 x Thy" başlık) bir çift timidin blok ile senkronize. 4 h K-Rta intron RNA balık probları melezleşmiştir için her iki eşitlenmemiş ve senkronize hücre popülasyonlarının TPA ve DOX ile tedavi edildi. Aynı şekilde parlak kırmızı olan hücreler K-Rta overexpressing değil, bunun yerine (değil gösterilir) Boyama DAPI ile doğrulanmış, öldüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Genel bir not olarak, bu iletişim kuralını yerine getirirken DAPI hücrelerle leke çok önemlidir. Apototic hücreleri kolayca nükleer parçalanma ve blebbing tarafından kabul edilebilir. Ağır indüksiyon uyaranlara ve genel hücre kültür uygulamaları göz önüne alındığında, bazı ölü hücreleri görülen yaygın bir durumdur. Her zaman canlı ve ölü hücreleri arasında ayırt birincil yöntem olarak DAPI ile leke önemlidir. Bazen antikorlar veya RNA probları apoptotik hücrelerde yakalanmayın ve sinyalleri üretmek, sonuç olarak bu hücreleri analizleri dışlamak önemlidir. DAPI boyama birkaç ek işlevler, hizmet edebilir örneğin şekil 3' te, bu okla gösterilen nesne aslında üç ayrı hücre bir yerine olduğu açıktır.
Resim 3 Resim 4 görüldüğü görüntüler böylece daha punctate örüntüyü yaratmak deconvolved unutmamak gerekir. RNAPII leke inceleyerek, hücreler arasındaki fark okla gösterilen ve çevredeki diğer hücreleri görülebilir. Bu RNAPII sinyal deconvolution nedeniyle normalden çok daha okunuyor söz dikkat çekicidir.
3D mikroskobu ile birlikte bu tekniği kullanarak RNAPII, LANA ve K-Rta uzaysal ilişkisi sorgulamak için bize izin verir. Örneğin, şekil 4' te, yüzük benzeri RNAPII yapıları çevre üzerinde noktalı KSHV genleri ile görülebilir. Genel olarak, LANA genellikle RNAPII hücrelerde transkripsiyon fabrikalar geliştirme ile colocalizes. Ancak, tüm LANA nokta çalışmaları 4 RNAPII ile colocalizeth Boyut (zaman) bu fenotip netleştirmek gerekli olurdu. K-Rta sinyalleri ile colocalize değil birkaç LANA noktalar (şekil 4) tek bir hücre içinde bile yeniden etkinleştirme uyaranlara yanıt episomal heterojenlik temsil eklemek önemlidir.
Şekil 3: Kombine IFA ve intron RNA-balık. IFA ve RNA-balık TREX K-Rta BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen almıştır. Viral genom ile immunostaining Lana (yeşil), transkripsiyonu RNA-BALIKLA K-Rta mRNA (sarı) intron bölgenin görselleştirildiği, RNAPII (kırmızı) cemaat IFA ile etiketli ve hücreleri sonunda DAPI görüntüye kullanarak lekeli active bulunduğunu DNA (mavi). Sonra hücreleri yeniden TPA ve DOX kuluçka için 4 h ile etkinleştirildi TREx K-RTA BCBL-1 hücreleri bir çift timidin blok kullanarak senkronize ve 24 saat sonra hücreleri tespit edildi, permeabilized ve daha ileri görüntüleme için hazır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 3 boyutlu görselleştirme Viral transkripsiyon fabrikaların. İntron RNA-balık K-Rta intron problar (açık mavi), RNAPII (kırmızı) ve LANA (yeşil) ve DAPI (koyu mavi) Boyama DNA immunostaining kullanarak. 3D render bir Z yığının mikroskobunun alınan, işlenen ve ticari görüntüleme yazılımı üzerinde inşa deconvolved (malzemelerin tabloya bakın). Sonra yeniden etkinleştirme uyarılmış Çift Kişilik timidin senkronize ve TPA ve 4 h hücreler için DOX ile tedavi TREx K-Rta BCBL-1 hücreleri 28 h işlendi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıra dışı durumlar karşılamak için değiştirilebilir Protokolü bazı yönleri vardır. Fiksasyon ve permeabilization arabellekleri seçiminde de değiştirilebilir. Fiksasyon arabellekleri için paraformaldehyde da etkilidir ve etanol permeabilization için kullanılabilir.
Şoklama formaldehit ile glisin PBS formaldehit sığır serum albumin (BSA) yokluğunda antikorlar devre dışı bırakmasını engeller, ancak coverslips iyice yeterli yıkanır,-ebilmek var olmak Kaptan glisin PBS adım olarak önerilir. İletişim kuralında, sığır serum albümin engelleyen bir çözüm olarak kullanmaktan kaçının. RNA bozulması nedeniyle muhtemelen daha zayıf RNA-balık sinyalleri gösterdi Izumiya laboratuarında pilot çalışmalar yapılmıştır. Birincil antikor için engelleme gerekirse RNase free BSA kullanılması önerilir. Üzerinden geçmiş deneyim, bu antikor belirli ise, BSA eklenmesi tepki gerekli olmadığını fark ettim. Ancak, her zaman tüm kuluçka tRNA adımlar için maya aşırı miktarda dahil etmek için tavsiye edilir RNA yıkımı önlemek. Bu Ajan engelleme olarak tRNA kullanarak belirli RNA-balık sinyalleri arttı fark edilmiştir.
Hücre döngüsü eşitleme bir daha verimli ve zaman uyumlu KSHV etkinleştirme üretmek için uygulamaya konmuştur. Hücre döngüsü eşitleme için hidroksiüreye veya serum açlık alternatif yaklaşımlar olabilir. Hidroksiüreye yalnız ile kuluçka KSHV zayıf yeniden etkinleştirir o hidroksiüreye timidin blok kullanarak olarak etkili olsa da doğrulanmıştır.
Nasıl bu tekniği diğer çalışmalar için uygulanabilir mi? Izumiya lab's en son yayında, bu aktif KSHV episomes ve RNA pol II, RNA transkripsiyonu için temel bir enzim transkripsiyonu Bu colocalization gösterilmiştir. Ancak, bu ortak harekete geçirmek, eş repressors ve hücresel transkripsiyon faktörleri birkaç KSHV gen yönetmelikte yer vardır bilinen. Kantitatif RT-PCR viral transkript miktarının ve viral gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirirken üzerinde bir nüfus kültürlü hücrelerinin (yeniden etkinleştirme ve gizli karışımı) tarihsel olarak kullanılmıştır. Yukarıda açıklanan yaklaşım kullanarak, analizleri viral transkripsiyon incelemek için tek episomal seviyeye daraltılabilir. Böylece, diğer hücresel ve viral enzimlerin kronolojik zamanmekansal yönetmelik onların dernek KSHV reaktivasyonu ile anlayış kazanmak için incelenebilir. Bu da ancak intron değil bozulmuş Eğer RNA intron bölgenin geçici doğa RNA balık probları melezlemek ve genellikle yerelleştirmek onların yıkımı bağımlı olduğu için nerede etkin transkripsiyon, gerçekleşiyor olduğunu belirtmeyi dikkat çekicidir Hemen, Balık probları her zaman etkin transkripsiyon bulunan sinyalleri sunabilirim.
Şu anda, hücresel transkripsiyon fabrikalar oluşumu ve sonraki gen ekspresyonu genomik boyutlarını ve yapılandırma hücresel rehberleri karmaşıklığı nedeniyle arasındaki ilişkiyi araştırmayı zordur. Bu bağlamda, KSHV episomes sonucu olarak nispeten küçük genom büyüklükleri, tanımlanmış reaktivasyonu mekanizmaları açık RNA Pol II toplama oluşumları ile ideal bir araç olabilir. KSHV'ın manipulable viral Mini kromozom kullanarak, herpesvirology hücresel epigenetik araştırma alanı için benzersiz bir açıdan katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu yazının hiçbir mali bağları ya da rakip çakışmaları çıkarları var.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01-DE025985) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-13-383-MPC) tarafından desteklenmiştir. Bu eser, Davis de ABD Tarım Bakanlığı (2015-67015-23268 ve 2014-67015-21787) ve University of California, yeni araştırma girişimi bursu gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
