Summary
Virale transcriptionele fabrieken zijn discrete structuren die zijn verrijkt met cellulaire RNA polymerase II te verhogen van virale gen transcriptie tijdens reactivering. Hier, wordt een methode om te vinden sites van actief het transcriberen van virale chromatine in 3D-nucleaire ruimte door een combinatie van immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie van RNA beschreven.
Abstract
Het is algemeen bekend dat regulering van de ruimtelijke en temporele van genen een integraal onderdeel is van het bestuur van de juiste genexpressie. Het is daarom van onschatbare waarde om te begrijpen waar en wanneer de transcriptie plaats binnen de nucleaire ruimte vindt en visualiseren van de relatie tussen episomes besmet binnen de dezelfde celkern. Hier, zowel de immunofluorescentie (IFA) en de RNA-vis geweest combinedto identificeren actief transcriberen Kaposisarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) episomes. Door kleuring KSHV latency-associated nucleair antigeen (LANA), is het mogelijk om te zoeken waar de virale episomes bestaan in de kern. Bovendien, door het ontwerpen van RNA-vis sondes te richten op de regio intron van een virale gen, die alleen tijdens de productieve infectie wordt uitgedrukt, kunnen ontluikende RNA afschriften bevinden. Met deze combinatie van moleculaire sondes, is het mogelijk voor het visualiseren van de vergadering van grote virale transcriptie fabrieken en analyseren van de ruimtelijke verordening van virale genexpressie tijdens KSHV reactivering. Door anti-RNA polymerase II antilichaam kleuring, kunt een ook de vereniging tussen aggregatie van RNA polymerase II (RNAPII) en KSHV transcriptie tijdens reactivering visualiseren.
Introduction
Het steeds duidelijker dat de spatio organisatie van de kern een belangrijke rol speelt bij het moduleren van fijn-tuned genexpressie in eukaryoten geworden. Meeste weefsel specifieke genen zijn verdeeld over vele chromosomen en geregeld moeten worden synchroon om te reageren op specifieke stimuli in een gecoördineerde wijze1. Cellen bouwen actieve chromatine hubs (ACH) als een manier van het samenbrengen van genen en hun cis-regulerende componenten op een specifieke nucleaire ruimte1.
Ook is gebleken uit verschillende studies dat hoewel de kern zeer dichte en viskeuze lijkt, biologisch actieve moleculen de kern vrij snel via diffusie2 doorkruisen kunnen. Als gevolg van deze efemere eigenschap springen meeste DNA-bindende proteïnen' ' van de site te binden aan de site, het gevoel van hun weg rond de nucleaire ruimte, die het mogelijk voor een zeer adaptief en veelzijdige kern2 maaktbindend.
Ondanks dit dynamische gedrag van biomoleculen binnen de kern, nucleaire organen zonder membranen zoals (maar niet beperkt tot) de nucleolus Cajal organen en de promyelocytic leukemie nucleaire organen (PML-NB) bestaan nog steeds. Het is door een aantal mechanismen zoals tandem DNA herhalingen (nucleolus), rRNA (nucleolus) en structurele proteïnen zoals coilin (Cajal instanties) of PML eiwitten (PML-NB) die houden van deze constructies samen3,4,5 . Deze structuren en andere congregaties zoals transcriptie fabrieken dienen als steigers die niet alleen de plaatselijke concentratie van vereiste onderdelen te verhogen, maar ook het reguleren van de samenstelling van eiwitten en nucleïnezuren binnen hen uiteindelijk maken een centrale site voor efficiënte cellulaire functies6.
Visualiseren van wanneer en waar nucleaire structuren vorm biedt een schat aan informatie aan onderzoekers bestuderen van de epigenetica. Vanuit een perspectief van de virologie, de reactivering van latent geïnfecteerde virussen, zoals KSHV, aanzienlijk verandert het landschap van de kern en de verspreiding van nucleaire enzymen verschuiving transcriptie voornamelijk van cellulaire genen naar virale genen, uiteindelijk te volledig functionele virale nageslacht7,8te produceren. Hoe KSHV de cellulaire gen expressie machines om virale genexpressie manipuleren? Dergelijke informatie kan ook licht werpen op tijdelijke cellulaire gene regulerende mechanismen.
KSHV heeft net als alle andere infectieziekte, twee levenscyclus genaamd lytische replicatie en latentie. KSHV bevindt zich voornamelijk in de latentie fase in die de meeste van haar virale gen expressie het zwijgen is opgelegd, behalve latency genen9,10 verbonden. Tijdens KSHV produceert latency verbonden latentie nucleair antigeen (LANA), die constitutively bindt het virale genoom en aanbinden van virale chromatine tot en met de menselijke chromosoom11. Vanwege LANA's intieme relatie met het virale genoom is het mogelijk gebruik van IFA en DAPI vlek te zoeken waar de virale episomes waren ten opzichte van de chromatine host.
Studeren KSHV reactivering op één isomer niveau en de associatie met andere virale episomes in een geïnfecteerde cel, is een strategie om te zoeken actief transcriberen virale chromatine in situ opgezet. Dienovereenkomstig, LANA en RNAPII IFA met intron RNA-vis werden samengevoegd, door het genereren van sondes van RNA-vis die zich binden aan de intron regio (exacte sonde sequenties kunnen worden gevonden in de Izumiya lab's meest recente publicatie8) van KSHV K-Rta-de belangrijkste virale eiwitten die is wezenlijke en voldoende voor KSHV reactivering-het was mogelijk om te identificeren waar transcriptie eigenlijk nam plaats8,11,12,13,14,15 . Deze intron RNA-vis techniek kan onderzoekers te visualiseren waar mRNA is wordt getranscribeerd onmiddellijk voordat het wordt verbinding aan de randen en geëxporteerd naar cytoplasma16,17.
KSHV kunnen opnieuw worden geactiveerd door verschillende chemische prikkels, met inbegrip van phorbol esters zoals 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) en histone deacetylase remmers zoals natrium butyraat, bovendien KSHV kunnen worden opgewekt reactiveren met overexpressie van de virale transcriptiefactor, K-Rta19. Onderzoekers hebben met succes de efficiëntie van KSHV reactivering stegen met synchroniseren van de cel cycli voorafgaand aan inducerende reactivering18. Dus, voor deze bijzondere studies, cellen zijn gesynchroniseerd met behulp van een dubbele thymidine blok (protocol hieronder beschreven) en geïncubeerd met TPA en doxycycline (Dox) voor een korte tijd. Doxycyline werd gebruikt omdat de cellijn gebruikt in deze experimenten heeft een doxycycline-afleidbare K-Rta cassette, die werd gekloond van cDNA en omvat niet de intron regio van K-Rta. Hoewel het mogelijk is te activeren met behulp van de KSHV alleen geïnduceerde K-Rta expressie, het is bewezen door andere onderzoekers dat wegens een verscheidenheid van verschillende biochemische factoren K-Rta expressie alleen blijkt te zijn van een zwakke reactivering stimuli20. Door het combineren van al deze, en door de beperking van de drug-incubations voor een korte periode van tijd, werd een robuuste maar niet overdreven kunstmatige KSHV reactivering bereikt voor imaging.
Na het labelen van LANA, RNAPII, K-Rta introns, en DNA als in dit artikel wordt beschreven, 3D fluorescentie imaging werd uitgevoerd met behulp van een Microscoop widefield deconvolutie. Na verwerking met beeldbewerkingssoftware, kan de ruimtelijke spreiding van actieve virale episomes naar behoren worden geëvalueerd. Met deze techniek kan kunnen de centrale vraagstukken met betrekking tot het fundamentele karakter van de vorming van actieve chromatine hubs en andere nucleaire structuren worden bestudeerd. Met identieke virale episomes in één cel die dezelfde regelgevende elementen verwerkt kan vertegenwoordigen een unieke onderzoeksinstrument te verdiepen van het inzicht in Spatio gene regulerende mechanismen.
Een beperking van imaging meerdere cel specimens vastgesteld op verschillende tijdstippen een inherent dynamische moleculaire proces karakteriseren is dat subtiele of kleinschalige wijzigingen in fluorescentie distributie onopgemerkt zijn of onbelangrijk geacht. Dit geldt tenzij in het zeldzame geval, elke cel waargenomen dezelfde subtiele wijziging weergegeven. Worden dus de volledige Spatio relatie en actieve virale schrijffouten en andere nucleaire structuren kan niet kritisch geëvalueerd met behulp van vaste imaging. De beste aanpak is om deze technische uitdagingen, afbeelding levende cellen die virale episomes gemarkeerd en volgen van de locatie van de belangrijkste cellulaire enzymen na verloop van tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: De cellijnen die worden gebruikt in deze procedure besmettelijke virussen bevatten, wees voorzichtig en alleen gaan in niveau 2 BSL faciliteit of hoger.
1. cel voorbereiding en onderhoud
- Cultuur TREx-K-RTA BCBL-1 cellen (of een ander KSHV besmet PEL cellijnen) in RPMI1640 medium aangevuld met 15% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline streptomycine glutamine oplossing.
- Het groeien van cellen bij 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2), om ervoor te zorgen voortdurend groeien en cellen splitsen door een verhouding van 1:4 elke 2-4 dagen.
- Celculturen controleren met een lichte Microscoop, wordt elke dag om goede celgroei en morfologie, anders die het wordt aanbevolen te starten de celcultuur of daaraan aan te passen de kweekomstandigheden cel te bevestigen.
2. thymidine synchronisatie en lytische inductie
- In een 10 cm petrischaal, plaat TREx-K-Rta BCBL-1 cellen in vers bereide media (1 x 106 cellen/2 mL van media)
- Toevoegen van 200 mM thymidine (eindconcentratie: 2 mM) aan de schotel, meng en incubeer gedurende 18 h.
- Centrifuge de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g. wassen van de cellen met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), nogmaals centrifugeren en resuspendeer de cellen in de vers bereide media. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten. Resuspendeer in vers bereide media.
- De cellen om af te sluiten van de S-fase voor 8u toestaan.
- Toevoegen van thymidine (eindconcentratie: 2 mM), meng en incubeer gedurende 16 h.
- Centrifuge de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g. wassen van de cellen met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), nogmaals centrifugeren en resuspendeer de cellen in de vers bereide media. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten. Resuspendeer in vers bereide media.
- Om virale reactivering, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, eindconcentratie 20 ng/mL) en doxycycline (DOX, eindconcentratie 100 ng/mL) toevoegen aan de celcultuur, meng en incubeer gedurende 4 uur. Stimuleren voor cellijnen zonder een K-Rta afleidbare cassette, reactiveren met behulp van TPA (eindconcentratie 20 ng/mL en natrium butyraat (1 mM)).
- Centrifuge de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g. wassen van de cellen met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), nogmaals centrifugeren en resuspendeer de cellen in volledige voedingsbodems. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten. Resuspendeer in volledige voedingsbodems.
- De cellen groeien gedurende 24 uur toestaan.
3. fixatie en Permeabilization
Opmerking: Voordat u verdergaat, zorg ervoor fixing oplossing (3,7% formaldehyde in DEPC-behandelde PBS), diethyl pyrocarbonate behandeld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (DEPC-PBS), glycine DEPC PBS (eindconcentratie van glycine: 100 mM) en permeabilizating oplossing (50% aceton, 50% methanol) zijn bereid. Typisch, zal elke dia vereisen ten minste 0,5 miljoen cellen, vermenigvuldigen indien nodig en voorzien van extra cellen waar terug omhoog, vooral als cellen niet gezond zijn.
- Cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge verzamelen.
- Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten op 200 x g. Wash de cellen 3 keer met 1 mL steriele DEPC PBS. Resuspendeer in 1.2 mL DEPC PBS.
- Plaats het juiste aantal coverslips (bepaald door de experimentele opzet) in de bodem van een 6-well-plaat.
- Pipetteer 200 µL van de cel DEPC PBS mengsel op elke dekglaasje aan, Controleer of ten minste 0,5 miljoen cellen op elke dia. De cellen te regelen voor 2 min toestaan en gecombineerd overtollige DEPC PBS verlaten van slechts een dunne laag van cellen. Het is normaal voor cellen in dit proces worden verwijderd.
Let op: PFA is giftig, adequate bescherming dragen. - Voeg voorzichtig 1 mL van oplossing (3,7% formaldehyde in DEPC PBS) voor elk cover-slip vaststelling. Toestaan dat de cellen voor 10 min vast te stellen.
- Wassen coverslips 3 keer met DEPC PBS.
- Voeg voorzichtig 1 mL glycine DEPC PBS (eindconcentratie van glycine: 100 mM) aan elke cover slip. De cellen om quench voor 5 min toestaan.
- Voeg 1,5 mL DEPC PBS en beide plaats op een shaker voor 5 min of schud stevig maar voorzichtig in de hand voor 1 min. Aspirate de overtollige DEPC PBS. Wees voorzichtig niet te verstoren van de cellen. Herhaal deze stap voor een totaal van 3 wasbeurten.
- Voeg voorzichtig 1 mL van oplossing (50% aceton, 50% methanol) voor elk cover-slip permeabilizing. De cellen aan de permeabilize voor 15 min toestaan.
Opmerking: Op dit punt, de coverslips kunnen worden opgeslagen in een vriezer van-20 ° C niet langer dan een week. Voorkomen van bevriezing of minimaliseren van de tijd doorgebracht in de vriezer, zoals beeldkwaliteit kan snel worden afgebroken. Zorg ervoor dat wanneer het in de vriezer die de cellen blijven natte en overdekte in methanol/aceton, en om ervoor te zorgen dat ze goed hydrateren met DEPC PBS na verwijdering uit de diepvries. - Voeg 1,5 mL DEPC PBS en beide plaats op een shaker voor 5 min of schud stevig maar voorzichtig in de hand voor 1 min. gecombineerd de overtollige DEPC PBS, wees voorzichtig niet te verstoren van de cellen. Herhaal deze stap voor een totaal van 3 wasbeurten.
4. IFA en RNA-vis
Opmerking: Met betrekking tot RNA vis sonde labeling en voorbereiding: voor de K-Rta intron oftewel 959 baseparen, 31 verschillende sondes werden gegenereerd die werden 20 basenparen elk, een GC met inhoud van ongeveer 50%. Beroeps- en voorraad oplossingen van de sondes waren aliquoted in 100 µM en 2,5 µM concentraties, respectievelijk.
- Label Microscoop dia's met de nodige experimentele gegevens of één of andere soort te onderscheiden label.
- Lijn de bodem van een afsluitbare plastic container met een vochtige papieren handdoek.
-
Bereid de oplossing primair antilichaam (1,5 µL van LANA antilichaam, 0,75 µL van RNA Pol II antilichaam, 3 µL van baker's yeast tRNA, DEPC PBS tot 30 µL), en vermenigvuldigen recept voor elke dekglaasje aan aanwezig. Plaats 30 µL van primair antilichaam oplossing op elk label microscoopglaasje.
- Het primaire antilichaam van belang eerst Titreer en gebruik het optimaal bedrag. Moet u gebruiken gezuiverde IgG, aangezien serum (ascites vloeistof) grote hoeveelheid RNase kan bevatten.
- Plaats het dekglaasje aan (cellen tegenover de oplossing) in de labels Microscoop dia's en de dia's in de container met de vochtige papieren handdoek verplaatsen. Wees voorzichtig niet om bubbels. Betrekking hebben op de buitenkant van de container met plastic wrap. Verplaats de container in een incubator ingesteld op 37 ° C gedurende 1 uur.
- Voorbereiden van een vis was buffer (2 x zoute Natriumcitraat buffer (SSC) (finale), 10% formamide, 90% DEPC dH2O).
- Bereiden van 2 x kruising Buffer (4 x SSC, 20% dextran sulfaat).
- Het secundaire antilichaam en vis intron sonde buffer voorbereiden (20 µL van 2 x kruising buffer (finale 1 x Hyb Buffer), 4 µL van bakkersgist tRNA (laatste 10%), 4 µL van formamide (laatste 10%), intron K-Rta sonde (laatste 125 nM), 0.8 µg secundair antilichaam, DEPC dH2 O tot 40 µL). Vermenigvuldigen recept voor elke dia nodig.
- Na incubatie, wassen cellen 3 keer met DEPC PBS in een 6 goed plaat voor elke 5 min.
- Wassen met vis was buffer 3 keer voor elke 5 min. Houd dekglaasje aan vis-was buffer tot finish voorbereiding mengsel van tweede antilichaam en intron sonde (stap 4.7).
- Schoon glas slides die gebruikt worden voor primair antilichaam-incubatie voor hybridisatie.
- Plaats 40 µL van het secundair antilichaam en vis intron sonde met oplossing op elk glasplaatje.
- Plaats de coverslips met de cellen in de dia's met de kant van de cel naar beneden op de top van de buffer, worden voorzichtig niet om de bubbels.
- Plaats de dia's in een plastic container met een vochtige papieren handdoek op de bodem. Wikkel de plastic container in eerste plasticfolie en vervolgens aluminiumfolie.
- Incubeer de container met de dia's bij 37 ° C gedurende 16-24 uur.
- Na incubatie, zorgvuldig Schuif het dekglaasje aan vanaf de rand van het glasplaatje, en terug te zetten in 6 goed platen naar boven, en wassen van cellen met vis-was buffer 3 keer in een 6 goed plaat voor elke 5 min.
- Wassen van de cellen 2 keer met 2 x SSC.
- DAPI (1:1, 000) toevoegen in de 2 x SSC en laat het zitten voor 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen van de cellen 2 keer met 2 x SSC.
- Schoon het glas slides die gebruikt worden voor hybridisatie en voeg 10 µL oplossing in de dia's van glas te monteren.
- Zet het hoofd van de coverslips naar beneden op de montage oplossing. Wees voorzichtig niet om bubbels.
- Met een weefsel van het laboratorium, verwijder voorzichtig de overtollige montage oplossing, dat evenwel niet tot het pletten van de cellen.
- Met behulp van nagellak, breng een ruime laag rond de rand van de coverslips en laten drogen.
- Ga verder met het uitvoeren van fluorescentie microscopie.
5. 3D fluorescentie microscopie
Opmerking: Hoewel protocollen met het soort fluorescentie Microscoop systeem gebruikt variëren zal, de volgende stappen zal ertoe bijdragen de verwerving van optimale afbeeldingsgegevens voor kwantitatieve analyse.
- Voorbehandeling van vaste monsters en mount in anti-fade media fluorescentie photobleaching vertragen tijdens imaging.
- De doelstelling van een hoge kwaliteit (zoals een 60 X 1.42 N.A olie-immersie objectief), die vangen kan een hele cel (of de celkern) in het veld-of-view te gebruiken.
- Parameters van de blootstelling (bijvoorbeeldexcitatie macht, belichtingstijd) voor elk kleurkanaal van de fluorescentie, met behulp van positieve - en negatieve-controlemonsters instellen. Fluorescentie beelden te verwerven.
Opmerking: Positieve controlemonsters die slechts één fluorescerende label bevatten moeten ook worden gebruikt om te bepalen van het niveau van "crosstalk" tussen de kleurkanalen. Voor imaging vaste cel specimens, kan fluorescentie excitatie macht worden verminderd (met iets langere belichtingstijden) photobleaching minimaliseren. - Zodra het imaging protocol is vastgesteld, handhaven dezelfde blootstelling parameters consistent zijn voor alle monsters in een studie — zodat afbeeldingsgegevens kan nauwkeurig worden geanalyseerd en vergeleken.
- Na overname beeldverwerking en 3D reconstructie uit te voeren. Identificeren van de K-Rta transcripties door RNA-vis signaal (rood), LANA moleculen door immunofluorescentie (groen), en nucleaire chromatine (indien van toepassing) gekleurd met DAPI (blauw).
Opmerking: Regio's van de celkern, waarin K-Rta en LANA mede geclusterde zijn, worden dus verondersteld te zijn verbonden met de virale transcriptie fabrieken en replicatie complex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een enigszins verkorte protocol was uitgevoerd waar BCBL-1 cellen werden gebruikt en alleen LANA en K-Rta RNA werden gekleurd (Figuur 1). Dit experiment kan we onderzoeken waar actief overzetten virale episomes zijn en de heterogeniteit van de reactie op KSHV reactivering stimuli in een bevolking van cellen. In de cel aangegeven door de pijl in Figuur 1is de verschillende K-Rta fluorescentie in regio's die aansluiten op de verdeling van virale episomes (gemarkeerd met LANA) bewijs voor actieve transcriptie plaatsvindt dicht bij de KSHV genomen. In hetzelfde monster, kunnen cellen zoals aangegeven door de pijlpunt in Figuur 1 worden waargenomen, die veel zwakker en diffuse K-Rta fluorescentie vertonen die aanzienlijk niet overlapt met LANA. Dit illustreert de algemene vaststelling dat binnen een bevolking van cellen er aanzienlijke verschillen in de mate van reactie op reactivering stimuli.
Figuur 1: Visualiseren van actieve transcriptie van virale episomes. IFA en RNA-vis werd uitgevoerd op BCBL-1 cellen. De BCBL-1-cellen werden niet gesynchroniseerd maar behandeld met TPA en natrium butyraat voor 4 h. LANA met behulp van immunokleuring, virale genoom waren gevisualiseerd in het groen, terwijl RNA-vis werd uitgevoerd gericht op K-Rta introns aan gelegen actieve transcriptie in het rood. Cellulaire chromatine was gekleurd post fixatie en permeabilization met DAPI. K-Rta intron en LANA vlekken werden samengevoegd. De volledige pijl wijst naar een cel die is volledig opnieuw geactiveerd en is het vormen van VTFs. Terwijl de pijlpunt naar een cel die pas net begonnen wijst is te activeren, zoals voorgesteld door het zwakke signaal van de K-Rta. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De effectiviteit van thymidine synchronisatie werd vervolgens onderzocht door het visualiseren van de expressie van virale eiwitten K-Rta (Figuur 2). Na een dubbele thymidine blok werd uitgevoerd om te synchroniseren TREX BCBL-1 cellen bij de G1/S-fase-overgang, het protocol beschreven werd uitgevoerd (zonder LANA en RNAPII kleuring). Door het onderzoek van de K-Rta kleuring, is het duidelijk dat de gesynchroniseerde cellen meer gereageerd op de reactivering prikkels dan de niet-gesynchroniseerde bevolking. Uit eerdere onderzoeken in het lab Izumiya (gegevens niet worden weergegeven), is gevalideerd dat RNAPII ook colocalizes vaker met K-Rta na synchronisatie van de celcyclus.
Figuur 2: Thymidine effectiviteit. RNA-vis werd uitgevoerd op TREX K-Rta BCBL-1 cellen. De cellen (aangegeven door de "2 x Thy" titel) zijn gesynchroniseerd met een dubbele thymidine blok. Zowel niet-gesynchroniseerde en gesynchroniseerde cel populaties werden behandeld met TPA en DOX voor 4 h. K-Rta introns werden gekruist voor RNA vis sondes. Cellen die uniform fel rood zijn zijn niet overexpressing K-Rta, in plaats daarvan zijn ze dood, gevalideerd met DAPI kleuring (niet afgebeeld). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Als een algemene nota is het zeer belangrijk om cellen met DAPI vlek bij de uitvoering van dit protocol. Apototic cellen kunnen gemakkelijk worden herkend door nucleaire fragmentatie en blebbing. Gezien de zware inductie prikkels en de algemene cel cultuur praktijken, is het gebruikelijk dat sommige dode cellen te bezien. Het is belangrijk om altijd vlek met DAPI als een primaire methode te onderscheiden van levende en dode cellen. Soms antilichamen of RNA sondes zal gepakt in de apoptotic cellen en signalen produceren, dus het is belangrijk om die cellen uitsluiten van analyses. DAPI kleuring kan dienen verschillende extra functies, bijvoorbeeld in Figuur 3, het is duidelijk dat het object aangegeven door de pijl eigenlijk drie afzonderlijke cellen in plaats van één is.
Het is belangrijk op te merken dat de beelden weergegeven in Figuur 3 en Figuur 4 zijn deconvolved waardoor een meer punctate patroon. Door het onderzoek van de RNAPII vlek, het verschil tussen de cellen aangegeven door de pijl en de andere omliggende cellen kunnen worden gezien. Het is opmerkelijk te noemen dat het signaal van de RNAPII veel meer dan normaal als gevolg van deconvolutie uitgesproken is.
Met behulp van 3D microscopie naast deze techniek stelt ons in staat om te ondervragen van de ruimtelijke relatie tussen RNAPII, LANA en K-Rta. Bijvoorbeeld in Figuur 4, kunnen ring-achtige RNAPII structuren worden gezien met KSHV genoom gestippeld in de periferie. LANA colocalizes in het algemeen, meestal met RNAPII in cellen ontwikkelen transcriptie fabrieken. Echter, niet alle van de puntjes LANA colocalize met RNAPII, studies met inbegrip van de 4th dimensie (keer) zou moeten verduidelijken dit fenotype. Het is belangrijk om toe te voegen dat de paar puntjes van LANA die doen niet colocalize met K-Rta signalen de episomal heterogeniteit in de reactie op reactivering stimuli zelfs binnen een afzonderlijke cel (Figuur 4 vertegenwoordigen).
Figuur 3: Gecombineerd IFA en intron RNA-vis. IFA en RNA-vis werd uitgevoerd op TREX K-Rta BCBL-1 cellen. Virale genoom waren hier gevestigd met immunokleuring van LANA (groen), actieve transcriptie werd gevisualiseerd met RNA-vis intron regio K-Rta mRNA (geel), RNAPII (rood) congregaties waren gelabeld met IFA en de cellen werden ten slotte gekleurd DAPI met afbeelding DNA (blauw). TREx K-RTA BCBL-1 cellen zijn gesynchroniseerd met een dubbele thymidine blok, dan cellen werden gereactiveerd via incubatie met TPA en DOX gedurende 4 uur, en 24 h later de cellen werden vastgesteld, permeabel en verder bereid voor imaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: 3D visualisatie van virale transcriptie fabrieken. Intron RNA-vis met behulp van K-Rta intron sondes (licht blauw), immunokleuring van DAPI DNA kleuring (donkerblauw), RNAPII (rood) en LANA (groen). Deconvolved 3D weergave van een Z-stack op de loep genomen, verwerkt en gebouwd op commerciële denkbaar software (Zie de tabel van materialen). TREx K-Rta BCBL-1 cellen dubbele thymidine gesynchroniseerd en vervolgens behandeld met TPA en DOX voor 4 h. cellen werden 28 h verwerkt nadat reactivering werd gestimuleerd. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn enkele aspecten van het protocol dat kan worden gewijzigd zodat ongewone omstandigheden. De keuze van fixatie en permeabilization buffers kan ook worden gewijzigd. Paraformaldehyde is ook effectief voor fixatie buffers, en ethanol kan worden gebruikt voor permeabilization.
Blussen de formaldehyde met glycine die PBS wordt aanbevolen als het formaldehyde verhindert het uitschakelen van de antilichamen in afwezigheid van bovien serumalbumine (BSA), maar als de coverslips worden gewassen grondig genoeg, de glycine PBS stap kan worden overgeslagen. Vermijd het gebruik van bovien serumalbumine als een blokkerende oplossing in het protocol. Proefstudies uitgevoerd in het lab van de Izumiya toonde zwakkere signalen van de RNA-FISH, vermoedelijk als gevolg van aantasting van het RNA. Als voor het primaire antilichaam blokkeren nodig is, is het aanbevolen om gebruik RNase gratis BSA. Uit eerdere ervaringen, werd er gemerkt dat als het antilichaam specifiek is, opneming van BSA niet nodig in de reactie is. Het is echter raadzaam om altijd een overtollige hoeveelheid gist tRNA in alle incubatie stappen om te voorkomen dat de aantasting van het RNA. Het is opgevallen dat specifieke RNA-vis signalen met behulp van tRNA als agent blokkeren verhoogd.
Celcyclus synchronisatie is uitgevoerd om te produceren van een meer efficiënte en synchrone KSHV reactivering. Voor de synchronisatie van de celcyclus wellicht hydroxyurea of serum honger alternatieve benaderingen. Het is bevestigd dat hydroxyurea is zo effectief als het gebruik van een blok van thymidine, hoewel incubatie met hydroxyurea alleen KSHV zwak reactiveert.
Hoe kan deze techniek worden toegepast op andere studies? In de meest recente publicatie van het lab Izumiya, werd aangetoond dat colocalization van KSHV episomes en RNA pol II, een essentiële enzym voor RNA transcriptie actief te transcriberen. Het is echter bekend dat er een aantal CO activators, co repressors, en cellulaire transcriptionele factoren betrokken bij KSHV genregulatie zijn. Kwantitatieve RT-PCR is historisch gebruikt op een bevolking (mengsel van zowel reactiveren en latente) van gekweekte cellen, virale afschriften te kwantificeren en beoordelen van de effecten op de virale genexpressie. Met behulp van de hierboven beschreven benadering, kunnen analyses worden teruggebracht tot de één episomal niveau te onderzoeken van virale transcriptie. Zo kan de spatio regulering van andere cellulaire en virale enzymen worden onderzocht om het inzicht in hun associatie met KSHV reactivering. Het is ook opmerkelijk te noemen dat omdat de RNA intron regio van voorbijgaande aard is afhankelijk van hun afbraak die sondes van RNA vis te vermengen en meestal lokaliseren waar actieve transcriptie plaatsvindt, maar als de introns niet zijn gedegradeerd VIS sondes kunnen onmiddellijk, signalen die niet altijd in de buurt van actieve transcriptie liggen presenteren.
Op dit moment is het moeilijk om te bestuderen van de relatie tussen de vorming van cellulaire transcriptie fabrieken en latere genexpressie vanwege hun genomic grootte en complexiteit van de configuratie van cellulaire promotors. KSHV episomes kunnen in dit opzicht een ideaal hulpmiddel als gevolg van hun grootte van relatief kleine genoom, gedefinieerde reactivering mechanismen met duidelijke RNA Pol II statistische formaties. Met behulp van KSHV de manipuleerbare virale mini chromosoom, kan herpesvirology bijdragen tot het onderzoeksveld cellulaire epigenetica vanuit een unieke invalshoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van deze paper hebben geen financiële banden of concurrerende belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R01-DE025985) en door een Amerikaans kanker maatschappij Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van de U.S. Department of Agriculture (2015-67015-23268 en 2014-67015-21787) en het nieuwe initiatief onderzoeksbeurs van Universiteit van Californië, Davis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
