Summary
Viral transcriptional fabrikker er diskret strukturer som er beriket med cellular RNA polymerase II å øke viral genet transkripsjon under aktivering. Her, er en metode for å finne steder av aktivt transkribere viral chromatin i 3D-nuclear rom av en kombinasjon av immunofluorescence flekker og i situ RNA hybridisering beskrevet.
Abstract
Det er velkjent at romlige og tidsmessige regulering av gener er en integrert del av styrende riktig genuttrykk. Derfor er det uvurderlig å forstå hvor og når transkripsjon finner sted innen kjernefysiske og visualisere forholdet mellom episomes infisert i den samme celle kjerne. Her, både immunofluorescence (IFA) og RNA-fisk har vært combinedto identifisere aktivt transkribere Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV) episomes. Av flekker KSHV ventetid-assosiert kjernefysiske antigen (LANA), er det mulig å finne der viral episomes finnes i kjernen. Dessuten, ved å utforme RNA-fisk sonder mot regionen intron med et virus som uttrykkes bare under produktiv infeksjon, kan begynnende RNA utskrifter ligge. Bruker denne kombinasjonen av molekylære sonder, er det mulig å visualisere samlingen av store viral transkripsjon fabrikker og analysere romlige regulering av viral genuttrykk under KSHV reaktivering. Ved anti-RNA polymerase II antistoff flekker, kan man også visualisere tilknytningen mellom RNA polymerase II (RNAPII) aggregering og KSHV transkripsjon under aktivering.
Introduction
Det har blitt stadig klarere at spatiotemporal organiseringen av kjernen spiller en viktig rolle i modulerende finstemt byggkorn under eukaryoter. De fleste vev bestemte gener er fordelt på mange kromosomer, og må reguleres synkront for å svare på spesifikke stimuli i en koordinert måte1. Celler konstruere aktive chromatin huber (ACH) som en måte å bringe sammen gener og deres cis-regulatoriske komponentene til en bestemt kjernefysiske område1.
Det har også vist av ulike studier at selv om kjernen synes svært tette og tyktflytende, biologisk aktive molekyler kan traversere kjernen ganske raskt via diffusjon2. Av flyktige egenskapen hoppe de fleste DNA bindende proteiner' ' fra bindende område til bindende område, føler seg rundt den kjernefysiske plassen, noe som gir en svært tilpasningsdyktige og allsidig kjernen2.
Til tross for denne dynamiske virkemåten av biomolecules i kjernen kjernefysiske organer uten membraner som (men ikke begrenset til) kjerne, Cajal organer, og promyelocytic leukemi kjernefysiske organer (PML-NB) fremdeles eksisterer. Det er gjennom en rekke mekanismer som tandem DNA gjentar (kjerne), rRNA (kjerne) og strukturelle proteiner som Marianne (Cajal organer) eller PML proteiner (PML-NB) som holder disse konstruksjoner sammen3,4,5 . Disse strukturene og andre menigheter som transkripsjon fabrikker tjene som stillaser som ikke bare øke lokale konsentrasjonen av nødvendige komponenter, men også regulere sammensetningen av proteiner og nukleinsyrer i dem til slutt lage en sentrale området for effektiv cellulære funksjoner6.
Visualisere når og hvor kjernefysiske strukturer-skjemaet gir en mengde informasjon til forskere studere epigenetics. Fra et virologi perspektiv, reaktivering av latently infisert virus, som KSHV, vesentlig endrer landskapet i kjernen og distribusjon av kjernefysiske enzymer skifte transkripsjon hovedsakelig fra cellulære gener til viral gener, slutt å produsere fullt funksjonell viral avkom7,8. Hvordan KSHV manipulere mobilnettet gene expression maskiner å lette viral genuttrykk? Slik informasjon kan også kaste lys over timelige mobilnettet genet regulatoriske mekanismer.
Som alle andre herpesviruses har KSHV to sykluser kalt lytisk replikering og ventetid. KSHV ligger hovedsakelig i ventetid scenen, der mesteparten av sin viral genet uttrykk er taushet, bortsett fra ventetid forbundet gener9,10. Under ventetid KSHV produserer tilknyttet ventetid kjernefysiske antigen (LANA), som constitutively binder viral genomer og tethers viral chromatin menneskelige kromosomet11. På grunn av LANAS intimt forhold til viral genomet er det mulig å bruke IFA og DAPI flekker og finne hvor de viral episomes var i forhold til verten chromatin.
For å studere KSHV reaktivering på én episome nivå og tilknytning til andre viral episomes i en infiserte cellen, er en strategi for å finne aktivt transkribere viral chromatin i situ etablert. Følgelig ble LANA og RNAPII IFA med intron RNA-fisk kombinert, ved å generere RNA-fisk sonder som binder til regionen intron (nøyaktig sonde sekvenser kan finnes i Izumiya lab siste publikasjon8) KSHV K-Rta-the nøkkel viral protein som er viktig og tilstrekkelig for KSHV aktivering-det var mulig å identifisere hvor transkripsjon faktisk tok sted8,11,12,13,14,15 . Denne intron RNA-fisk teknikk kan forskere å visualisere hvor mRNA er blir transkriberte umiddelbart før det er skjøtes og eksportert til cytoplasma16,17.
KSHV kan aktiveres av ulike kjemiske stimuli inkludert phorbol estere som 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) og histone deacetylase hemmere som natrium butyrate, i tillegg KSHV kan bli overtalt til å reaktivere ved overuttrykte viral transkripsjon faktor, K-Rta19. Forskere har økte effektiviteten av KSHV aktivering ved å synkronisere cellens sykluser før inducing reaktivering18. Således, for disse bestemte studier, celler ble synkronisert ved hjelp av en dobbel thymidine blokk (protokoll beskrevet nedenfor), og inkubert med TPA og doxycycline (Dox) for en kort tid. Doxycyline ble brukt fordi cellen linjen benyttet i disse eksperimentene har en doxycycline-induserbart K-Rta kassetten, som ble klonet fra cDNA og omfatter ikke intron regionen K-Rta. Selv om det er mulig å aktivere KSHV bruker bare indusert K-Rta uttrykk, det er bevist av andre forskere at på grunn av ulike biokjemiske faktorer K-Rta uttrykk alene viser seg for å være en svak reaktivering stimuli20. Ved å kombinere alle disse, og ved å begrense narkotika incubations til en kort tidsperiode, ble en robust, men ikke altfor kunstig KSHV reaktivering oppnådd for bildebehandling.
Etter merking LANA, RNAPII, K-Rta introns og DNA som beskrevet i denne hvitboken, 3D fluorescens imaging ble utført widefield deconvolution mikroskop. Etter behandling med redigeringsprogramvare, kan den romlige fordelingen av aktive viral episomes bli skikkelig evaluert. Bruker denne teknikken, kan de sentrale spørsmålene om grunnleggende natur av dannelse av aktive chromatin huber og andre kjernefysiske strukturer studeres. Har identiske viral episomes i en enkelt celle som behandler de samme regulatoriske elementene kan representere en unik forskning verktøyet å utdype forståelsen av spatiotemporal genet regulatoriske mekanismer.
En begrensning av imaging flere celle prøver fast på ulike tidspunkt betegner en iboende dynamisk molekylær prosess er det subtile eller mindre endringer i fluorescens distribusjon er uoppdaget eller anses ubetydelig. Dette gjelder med mindre i sjeldne tilfeller, hver celle observert viser samme subtile endringen. Dermed kan fullt spatiotemporal forholdet mellom aktive viral transkripsjon og andre kjernefysiske strukturer ikke kritisk evalueres med fast imaging. For å løse disse tekniske utfordringer, er den beste tilnærmingen å bilde lever celler som merket viral episomes og følge plasseringen av viktige mobilnettet enzymer over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: Linjer brukes i denne prosedyren inneholde smittsomme virus, være forsiktig og bare gå i nivå 2 BSL anlegget eller høyere.
1. celle utarbeidelse og vedlikehold
- Kultur TREx-K-RTA BCBL-1 cellene (eller en annen KSHV infisert PEL linjer) i RPMI1640 medium med 15% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin glutamin løsning.
- Vokse cellene på 37 ° C med 5% karbondioksid (CO2), gjør at å kontinuerlig vokse og dele celler av forholdet 1:4 hver 2-4 dager.
- Overvåke cellekulturer med lys mikroskop hver dag for å bekrefte god cellevekst og morfologi, ellers det anbefales å starte cellekultur eller justere celle kultur betingelsene tilsvarende.
2. thymidine synkronisering og lytisk induksjon
- I en 10 cm Petriskål, plate TREx-K-Rta BCBL-1 celler i ferskt tilberedte medier (1 x 106 celler/2 mL av media)
- Legge til 200 mM thymidine (siste konsentrasjon: 2 mM) fatet, bland og ruge 18 h.
- Sentrifuger celler for 5 min på 500 x g. vaske cellene med sterilt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS), sentrifuge igjen og resuspend celler i nylagde media. Gjenta for totalt 3 vasker. Resuspend i nylagde medier.
- At cellene å avslutte S-fase 8 h.
- Legge til thymidine (siste konsentrasjon: 2 mM), bland og ruge 16 h.
- Sentrifuger celler for 5 min på 500 x g. vaske cellene med sterilt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS), sentrifuge igjen og resuspend celler i nylagde media. Gjenta for totalt 3 vasker. Resuspend i nylagde medier.
- For å indusere viral reaktivering, legger 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, siste konsentrasjon 20 ng/mL) og doxycycline (DOX, siste konsentrasjon 100 ng/mL) til cellekultur, bland og ruge 4 h. For linjer uten en K-Rta induserbart kassett, stimulere reaktivering bruker TPA (siste konsentrasjon 20 ng/mL og natrium butyrate (1 mM)).
- Sentrifuger celler for 5 min på 500 x g. vaske cellene med sterilt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS), sentrifuge igjen og resuspend celler i fullstendig kultur medier. Gjenta for totalt 3 vasker. Resuspend i fullstendig kultur medier.
- At cellene å vokse for 24 timer.
3. fiksering og Permeabilization
Merk: Før du fortsetter, kontroller fikse løsning (3,7% formaldehyd i DEPC-behandlet PBS), diethyl pyrocarbonate-behandlet fosfat-bufret saltvann (DEPC-PBS), glysin DEPC PBS (siste konsentrasjon av glysin: 100 mM) og permeabilizating løsning (50% aceton, 50% metanol) er forberedt. Vanligvis vil hvert lysbilde kreve minst 0,5 millioner celler, multiplisere eventuelt og inkluderer ekstra celler for tilbake opp spesielt hvis celler ikke er sunt.
- Samle celler i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Sentrifuge cellene i 2 minutter ved 200 x g. vask cellene 3 ganger med 1 mL steril DEPC PBS. Resuspend på 1,2 mL DEPC PBS.
- Plass det aktuelle antallet coverslips (bestemmes av eksperimentelle oppsettet) i bunnen av en 6-vel plate.
- Pipetter 200 µL av cellen DEPC PBS blanding på hver dekkglassvæske, sikre at minst 0,5 millioner celler på hvert lysbilde. At cellene å bosette seg i 2 minutter, og Sug opp overflødig DEPC PBS forlate bare et tynt lag av celler. Det er normalt for celler fjernes i denne prosessen.
Forsiktig: PFA er giftig, ha passende beskyttelse. - Forsiktig legge 1 mL av fikse løsning (3,7% formaldehyd i DEPC PBS) til hver cover slip. At cellene å fastsette for 10 min.
- Vask coverslips 3 ganger med DEPC PBS.
- Forsiktig legge 1 mL av glysin DEPC PBS (siste konsentrasjon av glysin: 100 mM) til hver cover slip. At cellene å slukke i 5 min.
- Legge til 1,5 mL DEPC PBS og enten plass i en shaker i 5 min eller riste godt, men forsiktig i hånden i 1 leveringstanken overflødig DEPC PBS. Pass på at du ikke forstyrre cellene. Gjenta dette trinnet for totalt 3 vasker.
- Forsiktig legge 1 mL av permeabilizing løsning (50% aceton, 50% metanol) hver cover slip. At cellene å permeabilize i 15 min.
Merk: På dette punktet, coverslips kan lagres i en 20 ° C fryser lenger enn en uke. Unngå frysing eller minimere tiden tilbrakte i fryseren som bildekvalitet kan redusere raskt. Pass på at når du er i fryseren som cellene er våt og dekket i metanol/aceton, og å sikre at de riktig rehydrate med DEPC PBS etter fjerning fra fryseren. - Legge til 1,5 mL DEPC PBS og enten plass i en shaker i 5 min eller rist godt men forsiktig i hånden i 1 Sug opp overflødig DEPC PBS, være forsiktig med å forstyrre cellene. Gjenta dette trinnet for totalt 3 vasker.
4. IFA og RNA-fisk
Merk: Om RNA fisk sonde merking og forberedelser: For the K-Rta intron som er 959 base parene, 31 forskjellige sonder ble generert som var 20 base parene hver, som inneholder en GC innhold på ca 50%. Arbeidstiden og lager løsninger av sonder var aliquoted i 100 µM og 2,5 µM konsentrasjoner, henholdsvis.
- Etiketten objektglass nødvendig eksperimentelle informasjon eller en slags skjelnes etiketten.
- Line bunnen av en sealable plastboks med en fuktig papirhåndkle.
-
Forberede den primære antistoff løsningen (1,5 µL av LANA antistoff, 0,75 µL RNA Pol II antistoff, 3 µL av baker's gjær tRNA, DEPC PBS opptil 30 µL), og multiplisere oppskrift på hver dekkglassvæske finnes. Sted 30 µL av primære antistoff løsning på hver merket microscope skyve.
- Sjarmere primære antistoffer rundt først og bruker den optimale mengden. Pass på å bruke renset IgG, da serum (ascites væske) kan inneholde store mengder RNase.
- Plasser dekkglassvæske (celler mot løsningen) på de merket objektglass og flytte lysbildene i beholderen med fuktig papirhåndkle. Vær forsiktig med å innføre bobler. Dekk utsiden av beholderen med plast brytes. Flytte beholderen til en inkubator satt til 37 ° C i 1 time.
- Forberede en fisk vaskebuffer (2 x saltvann natriumsitrat buffer (SSC) (siste), 10% formamide, 90% DEPC dH2O).
- Forberede 2 x hybridisering Buffer (4 x SSC, 20% dekstran sulfate).
- Sekundær antistoffer og FISH intron sonde buffer (20 µL av 2 x hybridisering buffer (siste 1 x Hyb Buffer), 4 µL av gjær tRNA (siste 10%), 4 µL av formamide (siste 10%), intron K-Rta sonde (siste 125 nM), 0,8 µg sekundære antistoff, DEPC dH2 O opptil 40 µL). Multiplisere oppskrift på hvert lysbilde nødvendig.
- Inkubasjon vaskes celler 3 ganger med DEPC PBS i en 6 godt plate i 5 min.
- Vask med fisk vaskebuffer 3 ganger i 5 minutter hver. Vær dekkglassvæske fisk-vaskebuffer til slutt forberede blanding av andre antistoff og intron sonde (trinn 4.7).
- Rent glass lysbilder brukes for primære antistoff inkubasjonstiden for hybridisering.
- Plass 40 µL av sekundær antistoffer og FISH intron sonde som inneholder løsningen på hver objektglass.
- Plass coverslips med celler på lysbildene med cellen side vender ned på bufferen, vær forsiktig for ikke å innføre bobler.
- Plass lysbildene i en plastboks med en fuktig papirhåndkle på bunnen. Pakk plast beholderen i første plastfolie og deretter aluminiumsfolie.
- Inkuber beholderen med lysbildene ved 37 ° C i 16-24 h.
- Ved forsiktig skyve dekkglassvæske fra kanten av lysbildet glass og satt tilbake i 6 bra plater vendt opp og vaskes celler med fisk-vaskebuffer 3 ganger i en 6 godt plate i 5 min.
- Vask cellene 2 ganger med 2 x SSC.
- Legg til DAPI (1:1, 000) i 2 x SSC og la sitte i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene 2 ganger med 2 x SSC.
- Rengjør glasset lysbildene brukes for hybridisering og legge 10 µL av montering løsning på glass lysbilder.
- Plass coverslips med skjermsiden ned på montering løsningen. Vær forsiktig med å innføre bobler.
- Med et laboratorium vev, forsiktig fjerne overflødig montering løsningen, være forsiktig med å ta knekken på cellene.
- Bruker neglelakk, gjelder et rikelig lag rundt kanten av coverslips og la det tørke.
- Fortsette å utføre fluorescens mikroskopi.
5. 3D fluorescens mikroskopi
Merk: Protokoller varierer med type fluorescens mikroskop systemet brukes følgende hjelper med å sikre oppkjøpet av optimal bildedata for kvantitativ analyse.
- Pretreat fast prøver og montere i anti-fade media å utsette fluorescens photobleaching under bildebehandling.
- Bruke et høykvalitets mål (for eksempel en 60 X 1,42 N.A oljeneddyp linse), som kan ta en hel celle (eller cellekjernen) i feltet-of-view.
- Angi eksponering parametere (f.eks, eksitasjon makt, eksponeringstid) for hver fargekanal fluorescens, positiv og negativ kontroll utvalg. Hente fluorescens bilder.
Merk: Positiv kontroll prøver som inneholder bare én fluorescerende etiketten skal også brukes til å bestemme nivået av "crosstalk" mellom fargekanaler. For bildebehandling fast celle prøver reduseres fluorescens eksitasjon makt (med litt lengre lukkertider) for å minimere photobleaching. - Når imaging protokollen er etablert, opprettholde de samme eksponering parameterne konsekvent for alle prøvene i en studie, slik at bildet kan være nøyaktig analysert og forhold.
- Utføre etter oppkjøp bildebehandling og 3D rekonstruksjon. Identifisere K-Rta transkripsjoner av RNA-fisk signal (rød), LANA molekyler av immunofluorescence (grønn) og kjernefysiske chromatin (eventuelt) med DAPI (blå).
Merk: Regioner cellekjernen, der K-Rta og LANA er co klynger antas dermed knyttes viral transkripsjon fabrikker og replikering komplekse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En noe forkortet protokoll ble utført der BCBL-1 celler ble brukt og bare LANA og K-Rta RNA ble farget (figur 1). Dette eksperimentet tillater oss å undersøke hvor aktivt transkribere viral episomes er og mangfold i respons på KSHV reaktivering stimuli i en populasjon av celler. I celle pilens i figur 1er den distinkte K-Rta fluorescensen i regioner som tett svarer fordelingen av viral episomes (merket med LANA) bevis for aktive transkripsjon sted nær KSHV genomer. I samme utvalget, kan celler som den tilkjennegitt av pilspiss i figur 1 observeres, som viser mye svakere og diffus K-Rta fluorescens som ikke overlapper betydelig med LANA. Dette illustrerer generelt å finne at i en populasjon av celler det er betydelig variasjon i graden av respons på reaktivering stimuli.
Figur 1: Visualisering aktive transkripsjon av viral episomes. IFA og RNA-fisk ble utført på BCBL-1 celler. BCBL-1 cellene ble ikke synkronisert, men behandles med TPA og natrium butyrate for 4 h. bruker LANA immunostai-, viral genomer var visualisert i grønt, mens RNA-fisk ble utført målretting K-Rta introns til ligger aktive transkripsjon i rødt. Mobil chromatin ble farget innlegget fiksering og permeabilization med DAPI. K-Rta intron og LANA flekker ble flettet sammen. Full pilen peker på en celle som har fullt aktivert og danner VTFs. Mens Pilspissen peker mot en celle som bare begynner å aktivere på nytt, som foreslått av svake K-Rta signalet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Neste ble effektiviteten av thymidine synkronisering undersøkt av visualisere uttrykk for viral protein K-Rta (figur 2). Når en dobbel thymidine blokk ble utført for å synkronisere TREX BCBL-1 cellene på G1/S fase overgangen, protokollen beskrevet tidligere ble utført (uten LANA og RNAPII flekker). Ved å undersøke den K-Rta flekker, er det tydelig at synkroniserte celler svarte mer til reaktivering stimuli enn befolkningen usynkroniserte. Fra tidligere studier gjennomført i Izumiya lab (data ikke vist), har det blitt validert at RNAPII også colocalizes oftere med K-Rta etter celle syklus synkronisering.
Figur 2: Thymidine effektivitet. RNA-fisk ble utført på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Cellene (angitt av den "2 x din" tittelen) ble synkronisert med en dobbel thymidine blokk. Begge usynkroniserte og synkronisert celle populasjoner ble behandlet med TPA og DOX for 4 h. K-Rta introns var hybridiserte RNA fisk sonder. Celler som er jevnt lys rød er ikke overexpressing K-Rta, i stedet de er døde, godkjent med DAPI flekker (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som et generelt notat er det svært viktig å flekken celler med DAPI når du utfører denne protokollen. Apototic celler kan lett bli gjenkjent av kjernefysiske fragmentering og blebbing. Gitt de tunge induksjon stimuli og generell celle kultur praksis, er det vanlig for noen døde celler å bli sett. Det er viktig å alltid flekker med DAPI som primær metode for å skjelne mellom levende og døde celler. Noen ganger antistoffer eller RNA sonder vil bli fanget i apoptotisk cellene og produsere signaler, derfor er det viktig å utelate disse cellene fra analyser. DAPI farging kan tjene flere tilleggsfunksjoner, for eksempel i Figur 3, er det klart at objektet pilens er faktisk tre separate celler i stedet for én.
Det er viktig å merke seg at bildene som vises i Figur 3 og Figur 4 var deconvolved dermed skape et mer vises punctate mønster. Ved å undersøke RNAPII flekken, forskjellen mellom cellene pilens og andre omkringliggende cellene kan sees. Det er bemerkelsesverdig å nevne at RNAPII signalet er mye tydeligere enn vanlig på grunn av deconvolution.
Bruke 3D mikroskopi sammen med denne teknikken tillater oss å forhøre romlige forholdet mellom RNAPII og LANA K-Rta. For eksempel i Figur 4, kan ring-lignende RNAPII strukturer sees med KSHV genomer strødd på periferi. Generelt, colocalizes LANA vanligvis med RNAPII i cellene utvikle transkripsjon fabrikker. Men ikke alle LANA prikkene colocalize med RNAPII, studier inkludert 4th dimensjon (tid) ville være nødvendig å avklare dette fenotypen. Det er viktig å legge til at noen LANA prikkene som ikke colocalize med K-Rta signaler representerer den episomal heterogenitet i svaret til reaktivering stimuli selv innenfor en enkeltcelle (Figur 4).
Figur 3: Kombinert IFA og intron RNA-fisk. IFA og RNA-fisk ble utført på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Viral genomer lå med immunostaining av LANA (grønn), aktiv transkripsjon var visualisert med RNA-fisk intron regionen i K-Rta mRNA (gul), RNAPII (rød) menigheter ble merket med IFA og cellene var endelig farget med DAPI til bilde DNA (blå). TREx K-RTA BCBL-1 celler ble synkronisert med en dobbel thymidine blokk, deretter celler ble aktivert på nytt via inkubasjon TPA og DOX 4 h, og 24 timer senere cellene er løst, permeabilized, og videre forberedt for avbilding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 3D-visualisering av Viral transkripsjon. Intron RNA-fisk med K-Rta intron sonder (lys blå), immunostai-RNAPII (rød), LANA (grønn) og DAPI DNA flekker (mørk blå). Deconvolved 3D-gjengivelse av en Z stabel tatt på mikroskopet, behandlet og bygget på kommersiell programvare (se tabellen materialer). TREx K-Rta BCBL-1 celler dobbel thymidine synkronisert og behandles med TPA og DOX for 4 h. celler ble behandlet 28 h etter aktivering ble stimulert. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er noen aspekter av protokollen som kan endres for å imøtekomme uvanlige omstendigheter. Valg av fiksering og permeabilization buffere kan også endres. For fiksering buffere, paraformaldehyde er også effektiv og etanol kan brukes til permeabilization.
Slukke formaldehyd med glysin PBS er anbefalt som det hindrer at formaldehyd deaktivere antistoffer i fravær av bovin serum albumin (BSA), men hvis coverslips er vasket grundig nok, glysin PBS steg kan hoppet. I protokollen, unngå å bruke bovin serum albumin som blokkerer løsning. Pilotstudier gjennomført i Izumiya laboratoriet viste svakere RNA-fisk signaler, antagelig på grunn av RNA degradering. Hvis blokkerer primære antistoffer er nødvendig, anbefales det å bruke RNase gratis BSA. Fra tidligere erfaring, ble det bemerket at hvis antistoffer er bestemt, inkludering av BSA ikke er nødvendig i reaksjonen. Det anbefales imidlertid alltid inkludere mye gjær tRNA i alle inkubasjonstiden skritt å hindre RNA nedbrytning. Det har blitt konstatert at bruker tRNA som blokkerer agent økt RNA-fisk sender.
Cellen syklus synkronisering er implementert for å produsere en mer effektiv og synkrone KSHV reaktivering. For cellen syklus synkronisering, kan hydroxyurea eller serum sult være alternative tilnærminger. Det er bekreftet at hydroxyurea er så effektiv som å bruke en thymidine blokk, selv om inkubasjon med hydroxyurea alene reaktiverer KSHV svakt.
Hvordan kan denne teknikken brukes på andre studier? I Izumiya lab siste publikasjon, ble det vist at colocalization av aktivt transkribere KSHV episomes og RNA pol II, et viktig enzym for RNA transkripsjon. Men er det kjent at det er en rekke co aktivator, co repressors og mobilnettet transcriptional faktorer involvert i KSHV gene regulering. Kvantitativ RT PCR har historisk blitt brukt på innbyggere (blanding av både reaktivere og latente) kulturperler celler, kvantifisere viral transkripsjoner, og vurdere virkningene på viral genuttrykk. Ved hjelp av tilnærming som beskrevet ovenfor, kan analyser trangt innløp ned til én episomal nivå undersøke viral transkripsjon. Dermed kan spatiotemporal regulering av andre cellulære og viral enzymer undersøkes for å få innsikt i tilknytningen KSHV reaktivering. Det er også bemerkelsesverdig å nevne at fordi RNA intron regionens forbigående Art er avhengig av deres fornedrelse som RNA fisk sonder hybridize og vanligvis lokalisere hvor aktiv transkripsjon finner sted, men hvis introns ikke er degradert umiddelbart, kan fisk sonder presentere signaler som ikke alltid befinner seg i nærheten av aktive transkripsjon.
For øyeblikket er det vanskelig å studere forholdet mellom dannelsen av mobilnettet transkripsjon fabrikker og påfølgende genuttrykk på grunn av genomisk størrelsen og kompleksiteten av konfigurasjonen av mobilnettet arrangører. I denne forbindelse kan KSHV episomes være et ideelt verktøy som følge av relativt liten genomet størrelse, definerte reaktivering mekanismer med klart RNA Pol II samlet formasjoner. Ved KSHV'S manipulable viral mini kromosom kan herpesvirology bidra til feltet mobilnettet epigenetics forskning fra en unik vinkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne av notatet har ingen økonomiske bånd eller konkurrerende interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health grant (R01-DE025985) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd fra US Department of Agriculture (2015-67015-23268 og 2014-67015-21787) og nye forskningsstipend initiativ fra University of California, Davis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
