Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Funktionel billeddannelse af Viral transskription fabrikker ved hjælp af 3D Fluorescens mikroskopi

Published: January 18, 2018 doi: 10.3791/56832

Summary

Viral transcriptional fabrikker er diskrete strukturer, der er beriget med cellulære RNA polymerase II at øge virale gen transskription under genaktivering. Her, er en metode til at finde websteder af aktivt transskribere viral kromatin i 3D nukleare plads ved en kombination af immunofluorescens farvning og i situ RNA hybridisering beskrevet.

Abstract

Det er velkendt at rumlige og tidsmæssige reguleringen af gener er en integreret del af for ordentlig genekspression. Derfor er det uvurderligt at forstå, hvor og Hvornår transskription finder sted inden for nuklear plads og at visualisere forholdet mellem episomes smittet inden for den samme cellekernen. Her både immunofluorescens (IFA) og RNA-fisk har været combinedto identificere aktivt transskribere Kaposis sarkom-associerede herpesvirus (KSHV) episomes. Ved farvning KSHV latency-associerede nukleare antigen (LANA), er det muligt at lokalisere hvor viral episomes findes i kernen. Derudover ved at designe RNA-fisk sonder at målrette regionen intronnet af et virale gen, som er udtrykt kun under produktive infektion, kan spirende RNA udskrifter være placeret. Med denne kombination af molekylære sonder, er det muligt at visualisere samling af store viral transskription fabrikker og analysere den rumlige regulering af viral genekspression under KSHV reaktivering. Af herunder anti-RNA polymerase II antistoffarvning, kan man også visualisere tilknytningen mellem RNA-polymerase II (RNAPII) aggregering og KSHV transskription under genaktivering.

Introduction

Det er blevet stadig mere klart, at den spatiotemporelle organisation af kernen spiller en vigtig rolle i modulerende fint afstemt genekspression i eukaryoter. De fleste væv specifikke gener er fordelt på mange kromosomer og skal reguleres synkront for at reagere på specifik stimuli i en koordineret1. Celler konstruere aktive kromatin hubs (ACH) som en måde at samle gener og deres cis-regulerende komponenter til en bestemt nukleare plads1.

Det er også blevet påvist af forskellige undersøgelser, at selv om kernen synes meget tætte og tyktflydende, biologisk aktive molekyler kan krydse kernen ret hurtigt via diffusion2. Som følge af denne kortvarige ejendom springe de fleste DNA-bindende proteiner' ' fra bindende site bindende site, føle deres måde omkring den nukleare plads, som giver mulighed for en meget adaptive og alsidig kerne2.

Trods denne dynamiske opførsel af biomolekyler i kernen, nukleare organer uden membraner såsom (men ikke begrænset til) den nucleolus, Cajal organer og promyelocyt leukæmi nukleare organer (PML-NB) stadig eksisterer. Det er gennem en række mekanismer som tandem DNA gentager (nucleolus), rRNA (nucleolus) og strukturelle proteiner som Merete (Cajal organer) eller PML proteiner (PML-NB) der holder disse konstruktioner sammen3,4,5 . Disse strukturer og andre menigheder såsom transskription fabrikker tjene som stilladser, der ikke kun øger den lokale koncentration af nødvendige komponenter, men også regulere sammensætningen af proteiner og nukleinsyrer inden for dem i sidste ende oprette et centrale websted for effektiv cellulære funktioner6.

Visualisering, hvornår og hvor nukleare strukturer form giver et væld af oplysninger til forskere studerer Epigenetik. Fra en virologi perspektiv, reaktivering af latent inficerede vira, såsom KSHV, væsentligt ændrer landskabet af kernen og distribution af nukleare enzymer til at flytte transskription primært fra cellulære gener til virale gener, i sidste ende til producere fuldt funktionel viral afkom7,8. Hvordan KSHV manipulere cellulære gen expression maskiner at lette viral genekspression? Sådanne oplysninger kunne også kaste lys over tidsmæssige cellulære gen reguleringsmekanismer.

Ligesom alle andre herpesvirus har KSHV to livscyklusser kaldet lytisk replikering og ventetid. KSHV primært er bosat i stadiet ventetid, hvor hovedparten af sin virale gen expression er tavshed, undtagen latency forbundet gener9,10. Under latency KSHV producerer forbundet latency nukleare antigen (LANA), som constitutively binder de virale genomer og bindsler viral kromatin til menneskets kromosom11. På grund af LANAS intime forhold med den virale genom er det muligt at bruge IFA og DAPI pletten og lokalisere hvor de virale episomes var i forhold til værten kromatin.

For at studere KSHV reaktivering ved enkelt episome niveau og sammenslutning med andre virale episomes i en inficeret celle, er der opstillet en strategi til at lokalisere aktivt transskribere viral kromatin i situ . I overensstemmelse hermed, LANA og RNAPII IFA med intron RNA-fisk blev kombineret, ved at generere RNA-fisk sonder, der binder til regionen intron (nøjagtige sonde sekvenser kan findes i Izumiya lab's seneste publikation8) KSHV K-Rta-den nøglen viral protein, der er nødvendigt og tilstrækkeligt for KSHV reaktivering-det var muligt at identificere hvor transskription faktisk finder sted8,11,12,13,14,15 . Denne intron RNA-fisk teknik gør det muligt for forskere at visualisere, hvor mRNA er ved at blive transskriberet umiddelbart før det er splejset og eksporteres til cytoplasma16,17.

KSHV kan genaktiveres af forskellige kemiske stimuli herunder phorbol estere såsom 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) og Histon deacetylase hæmmere såsom natrium butyrat, desuden KSHV kan tilskyndes til at genaktivere ved overekspression af den virale transkriptionsfaktor, K-Rta19. Forskere har med held øget effektivitet af KSHV reaktivering ved at synkronisere den celle cyklusser før inducerende reaktivering18. Således, for disse særlige undersøgelser, celler blev synkroniseret ved hjælp af en dobbelt thymidine blok (protokollen beskrevet nedenfor) og inkuberes med TPA og doxycyclin (Dox) i en kort tid. Doxycyline blev brugt, fordi den cellelinie, udnyttes i disse eksperimenter har en doxycyclin-inducerbar K-Rta kassette, som var klonet fra cDNA og ikke indeholder intron region af K-Rta. Selv om det er muligt at reaktivere KSHV bruger kun induceret K-Rta udtryk, det er blevet bevist af andre forskere, at K-Rta udtryk alene på grund af en lang række forskellige biokemiske faktorer viser sig for at være et svagt reaktivering stimuli20. Ved at kombinere alle disse, og ved at begrænse drug inkubationer til en kort periode, blev en robust, men ikke alt for kunstig KSHV reaktivering opnået for billeddannelse.

Efter mærkning LANA, RNAPII, K-Rta introner og DNA som beskrevet i denne hvidbog, 3D fluorescens imaging blev udført ved hjælp af en widefield deconvolution mikroskop. Efter behandling med imaging software, kan den geografiske fordeling af aktive viral episomes evalueres ordentligt. Brug af denne teknik, kan de centrale spørgsmål vedrørende den grundlæggende karakter af dannelsen af aktive kromatin hubs og andre nukleare strukturer studeres. At have identiske viral episomes i en enkelt celle, der behandler de samme regulerende elementer kan udgøre en unik forskningsværktøj til at uddybe forståelsen af spatiotemporelle gen reguleringsmekanismer.

En begrænsning af imaging flere celle prøver fast på forskellige tidspunkter for at karakterisere en i sagens natur dynamiske molekylære proces er at subtile eller små ændringer i fluorescens distribution er uopdaget eller anses for ubetydelig. Dette gælder medmindre i de sjældne tilfælde, hver celle iagttaget viser den samme subtile ændring. Således, det fuld spatiotemporelle forholdet mellem aktive viral transskription og andre nukleare strukturer kan ikke kritisk evalueres ved hjælp af faste billedbehandling. For at imødegå disse tekniske udfordringer, er den bedste fremgangsmåde at billedet levende celler, der har markeret viral episomes og følge placeringen af vigtige cellulære enzymer over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Cellelinjer, der anvendes i denne procedure indeholder smitsomme virus, Vær forsigtig og kun gå frem i niveau 2 BSL facilitet eller højere.

1. celle forberedelse og vedligeholdelse

  1. Kultur TREx-K-RTA BCBL-1 celler (eller en anden KSHV inficeret PEL cellelinjer) i RPMI1640 medium suppleret med 15% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin glutamin løsning.
  2. Vokse celler ved 37 ° C med 5% kuldioxid (CO2), og sørg for, at løbende vokse og Opdel celler af et forhold på 1:4 hver 2-4 dage.
  3. Overvåge cellekulturer med et lysmikroskop hver dag for at bekræfte god cellevækst og morfologi, ellers det anbefales at genstarte den cellekultur eller tilpasse celle kultur betingelser i overensstemmelse hermed.

2. thymidine synkronisering og lytisk induktion

  1. I en 10 cm petriskål, plade TREx-K-Rta BCBL-1 celler i frisklavet media (1 x 106 celler/2 mL af medier)
  2. Tilføje 200 mM thymidine (endelig koncentration: 2 mM) til fadet, blandes og inkuberes i 18 h.
  3. Centrifuge celler i 5 min på 500 x g. Cellerne vaskes med steril 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), centrifugeres igen og resuspend celler i frisklavede medier. Gentag i alt 3 vasker. Resuspend i frisklavede medier.
  4. Tillad cellerne at afslutte S-fase for 8 h.
  5. Tilføje thymidine (endelig koncentration: 2 mM), blandes og inkuberes i 16 h.
  6. Centrifuge celler i 5 min på 500 x g. Cellerne vaskes med steril 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), centrifugeres igen og resuspend celler i frisklavede medier. Gentag i alt 3 vasker. Resuspend i frisklavede medier.
  7. For at fremkalde viral reaktivering, tilføje 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, slutkoncentration 20 ng/mL), og doxycyclin (DOX, slutkoncentration 100 ng/mL) til cellekultur, blandes og inkuberes i 4 h. For cellelinjer uden en K-Rta inducerbar kassette, stimulere reaktivering ved hjælp af TPA (slutkoncentration 20 ng/mL og natrium butyrat (1 mM)).
  8. Centrifuge celler i 5 min på 500 x g. Cellerne vaskes med steril 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), centrifugeres igen og resuspend celler i fuldstændig kultur medier. Gentag i alt 3 vasker. Resuspend i fuldstændig kultur medier.
  9. Tillad celler til at vokse i 24 timer.

3. fiksering og Permeabilization

Bemærk: Før du fortsætter, sikre fastsættelse løsning (3,7% formaldehyd i DEPC-behandlet PBS), diethyletheren pyrocarbonate-behandlet fosfatbufferet saltopløsning (DEPC-PBS), glycin DEPC PBS (endelig koncentration af glycin: 100 mM) og permeabilizating løsning (50% acetone, 50% methanol) er forberedt. Typisk vil hvert dias kræve mindst 0,5 millioner celler, bliver mangedoblet, hvis nødvendigt og omfatter ekstra celler for ryggen op, især hvis celler ikke er sundt.

  1. Indsamle celler ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør.
  2. Der centrifugeres celler for 2 min på 200 x g. vaske cellerne 3 gange med 1 mL sterilt DEPC PBS. Resuspend i 1,2 mL af DEPC PBS.
  3. Placere det passende antal coverslips (bestemmes af opsætningen af eksperimenterende) i bunden af en 6-godt plade.
  4. Tilsæt 200 µL af cellen DEPC PBS blandingen på hver coverslip, sikre, at mindst 0,5 millioner celler på hvert dias. Tillader cellerne til at nøjes med 2 min, og Opsug overskydende DEPC PBS forlader kun et tyndt lag af celler. Det er normale for cellerne til at blive fjernet i denne proces.
    Forsigtig: PFA er giftigt, bære passende beskyttelse.
  5. Omhyggeligt tilsættes 1 mL af fastsættelse af hver dække slip løsning (3,7% formaldehyd i DEPC PBS). Tillad cellerne til at lave i 10 min.
  6. Vask coverslips 3 gange med DEPC PBS.
  7. Omhyggeligt tilsættes 1 mL af glycin DEPC PBS (endelig koncentration af glycin: 100 mM) til hver dække slip. Tillad celler til at slukke for 5 min.
  8. Der tilsættes 1,5 mL DEPC PBS og enten sted på en shaker i 5 min eller ryste fast, men forsigtigt i hånden i 1 min. aspirat overskydende DEPC PBS. Vær omhyggelig med ikke at cellerne sprænges. Gentag dette trin for i alt 3 vasker.
  9. Omhyggeligt tilsættes 1 mL permeabilizing løsning (50% acetone, 50% methanol) til hver dække slip. Tillad celler til permeabilize i 15 min.
    Bemærk: På dette tidspunkt, at coverslips kan gemmes i en-20 ° C fryser ikke længere end en uge. Undgå frysning eller minimere det tidsforbrug i fryseren som billedkvaliteten kan forringes hurtigt. Sørg for, at når i fryseren, som cellerne forblive våd og dækket i methanol/acetone, og for at sikre, at de korrekt rehydrere med DEPC PBS efter fjernelse fra fryseren.
  10. Der tilsættes 1,5 mL DEPC PBS og enten sted på en shaker i 5 min eller ryste fast, men forsigtigt i hånden i 1 min. Opsug den overskydende DEPC PBS, være omhyggelig med ikke at cellerne sprænges. Gentag dette trin for i alt 3 vasker.

4. IFA og RNA-fisk

Bemærk: Med hensyn til RNA fisk sonde mærkning og forberedelse: For the K-Rta intron, som er 959 basepar, 31 forskellige sonder blev genereret der var 20 basepar hver, der indeholder en GC indhold af ca. 50%. Arbejds- og lager løsninger af sonderne var aliquoted til 100 µM og 2,5 µM koncentrationer, henholdsvis.

  1. Label objektglas med nødvendige eksperimentelle oplysninger eller en slags skelnes etiket.
  2. Linje i bunden af en genlukkelig plast beholder med et fugtigt stykke køkkenrulle.
  3. Forberede den primære antistof løsning (1,5 µL af LANA antistof, 0,75 µL af RNA Pol II antistof, 3 µL af baker's gær tRNA, DEPC PBS op til 30 µL), og formere opskrift for hver coverslip til stede. Sted 30 µL af primære antistof løsning på hver mærket objektglas.
    1. Titreres det primære antistof af interesse først og bruge den optimale mængde. Sørg for at bruge renset IgG, som serum (ascites væske) kan indeholde store mængder af RNase.
  4. Placere coverslip (celler står over for løsningen) på mærket objektglas og flytte dias i containeren med et fugtigt stykke køkkenrulle. Vær omhyggelig med ikke at indføre bobler. Dække ydersiden af beholderen med plastfolie. Flytte beholderen i en inkubator, indstillet til 37 ° C i 1 time.
  5. Forberede en fisk vaskebuffer (2 x saltvand natrium citratbuffer (SSC) (endelige), 10% formamid, 90% DEPC dH2O).
  6. Forberede 2 x hybridisering Buffer (4 x SSC, 20% dextran sulfat).
  7. Forberede sekundær antistof og fisk intron sonde buffer (20 µL af 2 x hybridisering buffer (endelige 1 x Hyb Buffer), 4 µL af bagegær tRNA (sidste 10%), 4 µL af formamid (sidste 10%), intron K-Rta sonde (endelige 125 nM), 0,8 µg sekundær antistof, DEPC dH2 O op til 40 µL). Formere opskrift på hvert dias behov.
  8. Efter inkubationen vaske cellerne 3 gange med DEPC PBS i en 6 godt plade i 5 min.
  9. Vask med fisk vaskebuffer 3 gange i 5 min. Holde coverslip i fisk-wash buffer indtil finish forberede blanding af andet antistof og intron sonde (trin 4.7).
  10. Rene glas dias, som bruges til primære antistof inkubation i hybridisering.
  11. Anbring 40 µL af sekundær antistof og fisk intron sonde indeholdende løsning til hvert glas dias.
  12. Placer coverslips med celler på dias med celle side vender nedad på toppen af bufferen, Vær omhyggelig med ikke at indføre bobler.
  13. Placer diassene i en plast beholder med et fugtigt stykke køkkenrulle nederst. Wrap plastikbeholder i første plastikfolie og derefter aluminiumsfolie.
  14. Inkuber container med dias ved 37 ° C i 16-24 timer.
  15. Efter inkubationen omhyggeligt skub coverslip fra kanten af glas dias, og sættes tilbage i 6 godt plader opad, og vaske cellerne med fisk-wash buffer 3 gange i en 6 godt plade i 5 min.
  16. Cellerne vaskes 2 gange med 2 x SSC.
  17. Tilføje DAPI (1:1, 000) i 2 x SSC og lad den sidde i 5 min. ved stuetemperatur.
  18. Cellerne vaskes 2 gange med 2 x SSC.
  19. Rene glas lysbilleder brugt til hybridisering, og tilsæt 10 µL af montering løsning på glas dias.
  20. Placer coverslips ansigt ned på montering løsning. Vær omhyggelig med ikke at indføre bobler.
  21. Med et laboratorium væv, forsigtigt fjerne overskydende montering løsning, være omhyggelig med ikke at mase cellerne.
  22. Bruger neglelak, Påfør en rigelig lag omkring kanten af coverslips og lad tørre.
  23. Gå videre til at udføre Fluorescens mikroskopi.

5. 3D Fluorescens mikroskopi

Bemærk: Mens protokoller varierer med typen af fluorescens mikroskop system anvendes følgende trin vil bidrage til at sikre erhvervelse af optimal billeddata til kvantitativ analyse.

  1. Forbehandle faste prøver og montere i anti-fade medier at forsinke fluorescens photobleaching under imaging.
  2. Brug en høj kvalitetsmål (f.eks. en 60 X 1.42 Nielsen oliebestan linse), som kan fange en hel celle (eller cellekerne) i field-of-view.
  3. Indstille eksponering parametre (f.eks., excitation magt, eksponeringstid) for hver fluorescens farvekanal, ved hjælp af positiv - og negativ-kontrolprøver. Erhverve fluorescens billeder.
    Bemærk: Positive kontrolprøver, der indeholder kun én fluorescerende etiket skal også bruges til at bestemme graden af "krydstale" mellem farvekanaler. Til billeddannelse fast celle prøver, kan fluorescens excitation magt reduceres (med lidt længere eksponeringstider) for at minimere photobleaching.
  4. Når imaging-protokollen er blevet etableret, opretholde de samme eksponering parametre konsekvent til alle prøver i en undersøgelse — saa billeddata kan være præcist analyseret og sammenlignet.
  5. Udføre efter købet billedbehandling og 3D rekonstruktion. Identificere K-Rta udskrifter af RNA-fisk signal (rød), LANA molekyler ved immunofluorescens (grøn) og nukleare kromatin (eventuelt) farves med DAPI (blå).
    Bemærk: Regioner i cellekernen, hvor K-Rta og LANA er co klynger, der således menes at være forbundet med viral transskription fabrikker og replikering komplekse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En lidt forkortet protokol blev udført, hvor BCBL-1 celler blev brugt og kun LANA og K-Rta RNA var plettet (figur 1). Dette eksperiment giver os mulighed at undersøge hvor aktivt overførsel viral episomes er og heterogenitet af respons på KSHV reaktivering stimuli i en population af celler. I cellen angivet med pil i figur 1, er de forskellige K-Rta fluorescens i regioner, der nøje svarer til fordelingen af viral episomes (markeret med LANA) bevis for aktiv transskription finder sted tæt på KSHV genomer. I den samme prøve ses celler som tilkendegivet ved pilespidsen i figur 1 , som udviser meget svagere og diffuse K-Rta fluorescens der ikke væsentligt overlapper med LANA. Dette illustrerer den generelle konstatering, inden for en befolkning af celler er betydelig variation i graden af svar til reaktivering stimuli.

Figure 1
Figur 1: Visualisere aktive transskription af viral episomes. IFA og RNA-fisk blev udført på BCBL-1 celler. BCBL-1 celler blev ikke synkroniseret men behandlet med TPA og natrium butyrat for 4 h. ved hjælp af LANA immunfarvning, viral genomer blev visualiseret i grøn, mens RNA-fisk blev udført målretning K-Rta introner til placeret aktiv transskription med rødt. Cellulære kromatin var plettet post fiksering og permeabilization med DAPI. K-Rta intron og LANA pletter blev flettet sammen. Fuld pilen peger på en celle, der er fuldt genaktiveret og danner VTFs. Mens pilespidsen peger mod en celle, der kun lige begyndt at genaktivere, som foreslået af den svage K-Rta signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Næste blev effektiviteten af thymidine synkronisering undersøgt ved at visualisere udtryk for viral protein K-Rta (figur 2). Efter en dobbelt thymidine blok blev udført for at synkronisere TREX BCBL-1 celler på G1/S fase overgang, protokollen tidligere beskrevet blev udført (uden LANA og RNAPII farvning). Ved at undersøge K-Rta farvning, er det tydeligt, at synkroniserede celler reageret mere på reaktivering stimuli end den ikke-synkroniserede befolkning. Fra tidligere undersøgelser i Izumiya lab (data ikke vist), er blevet valideret, at RNAPII også colocalizes oftere med K-Rta efter cellecyklus synkronisering.

Figure 2
Figur 2: Thymidine effektiviteten. RNA-fisk blev udført på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Cellerne (angivet af den "2 x Thy" titel) blev synkroniseret med en dobbelt thymidine blok. Både ikke-synkroniserede og synkroniseret cellepopulationer blev behandlet med TPA og DOX for 4 h. Kristensen-Rta introner var hybridiseret at RNA fisk sonder. Celler, der er ensartet lyse rød overekspression ikke K-Rta, i stedet de er døde, valideret med DAPI farvning (ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Som en generel bemærkning er det meget vigtigt at plette celler med DAPI, når du udfører denne protokol. Apototic celler kan let genkendes af nukleare fragmentering og blebbing. I betragtning af de tunge induktion stimuli og generelle celle kultur praksis, er det fælles for nogle døde celler skal ses. Det er vigtigt at altid pletten med DAPI som en primære metode til at skelne mellem levende og døde celler. Undertiden antistoffer eller RNA-sonder vil blive fanget i de apoptotiske celler og producerer signaler, derfor er det vigtigt at udelukke disse celler fra analyser. DAPI farvning kan tjene flere ekstra funktioner, for eksempel i figur 3, det er klart, at objektet angivet med pilen er faktisk tre separate celler i stedet for én.

Det er vigtigt at bemærke, at de billeder, der vises i figur 3 og figur 4 var deconvolved, således at der skabes en mere punktformet mønster. Ved at undersøge RNAPII pletten, forskellen mellem cellerne angivet med pilen og andre omkringliggende celler kan ses. Det er værd at nævne, at RNAPII signalet er langt mere udtalt end normalt på grund af deconvolution.

Ved hjælp af 3D mikroskopi sammen med denne teknik giver os mulighed at afhøre den rumlige forhold mellem RNAPII, LANA og K-Rta. For eksempel, i figur 4, kan ring-lignende RNAPII strukturer ses med KSHV genomer prikket i periferien. I almindelighed, colocalizes LANA typisk med RNAPII i cellerne udvikle transskription fabrikker. Dog, ikke alle af LANA prikker colocalize med RNAPII, undersøgelser, herunder 4th dimension (tid) ville være nødvendig for at tydeliggøre denne fænotype. Det er vigtigt at tilføje, at de par LANA prikker, der ikke colocalize med K-Rta signaler repræsenterer episomal heterogenitet i svaret til reaktivering stimuli selv inden for en enkelt celle (figur 4).

Figure 3
Figur 3: Kombineret IFA og intron RNA-fisk. IFA og RNA-fisk blev udført på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Viral genomer var placeret med immunfarvning af LANA (grøn), aktive transskription blev visualiseret med RNA-fisk i regionen intron af K-Rta mRNA (gul), RNAPII (rød) menigheder var mærket med IFA, og cellerne blev endelig farves ved hjælp af DAPI til billede DNA (blå). TREx K-RTA BCBL-1 celler blev synkroniseret ved hjælp af en dobbelt thymidine blok, så celler blev reaktiveret via inkubation med TPA og DOX i 4 h, og 24 timer senere cellerne var fast, permeabilized, og yderligere beredt for billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: 3D visualisering af Viral transskription fabrikker. Intron RNA-fisk ved hjælp af K-Rta intron sonder (lyseblå), immunfarvning af RNAPII (rød) og LANA (grøn) og DAPI DNA farvning (mørkeblå). Deconvolved 3D-gengivelse af en Z stak taget på mikroskopet, forarbejdet og bygget på kommercielle billedbehandlingsprogrammer (se tabel over materialer). TREx K-Rta BCBL-1 celler dobbelt thymidine synkroniseres og derefter behandlet med TPA og DOX for 4 h. celler blev behandlet 28 h efter reaktivering blev stimuleret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er nogle aspekter af protokollen, som kan blive ændret for at imødekomme usædvanlige omstændigheder. Valget af fiksation og permeabilization buffere kan også ændres. Til fiksation buffere, PARAFORMALDEHYD er også effektiv og ethanol kan anvendes til permeabilization.

Quenching formaldehyd med glycin PBS er anbefales, da det forhindrer formaldehyd i deaktivering af antistoffer i mangel af bovint serumalbumin (BSA), men hvis coverslips er skyllet grundigt nok, glycin PBS skridt kan hoppet. I protokollen, undgå at bruge bovint serumalbumin som en blokerende løsning. Pilotundersøgelser gennemført i Izumiya laboratoriet viste svagere RNA-fisk signaler, formentlig på grund af RNA nedbrydning. Hvis blokering af det primære antistof er nødvendigt, anbefales det at bruge RNase gratis BSA. Fra tidligere erfaringer, blev det bemærket, at hvis antistoffet er specifikke, inddragelse af BSA ikke er nødvendigt i reaktionen. Det anbefales dog altid medtage en overskydende beløb af gær tRNA i alle inkubation skridt til at forhindre RNA nedbrydning. Det er blevet bemærket, at ved hjælp af tRNA som blokerer agent øget bestemt RNA-fisk signaler.

Cellecyklus synkroniseringen er blevet gennemført for at producere en mere effektiv og synkron KSHV reaktivering. For cellecyklus synkronisering, kan hydroxyurea eller serum sult være alternative tilgange. Det er blevet bekræftet, at hydroxyurea er så effektive som ved hjælp af en thymidine blok, selvom inkubering med hydroxyurea alene genaktiverer KSHV svagt.

Hvordan kan denne teknik anvendes til andre undersøgelser? I Izumiya lab's seneste publikation, var det vist at colocalization af aktivt omskriver KSHV episomes og RNA pol II, et vigtigt enzym for RNA transskription. Det vides dog, at der er en række fælles aktivatorer, co repressors og cellulære transcriptional faktorer involveret i KSHV RIBOREGULATION. Kvantitativ RT-PCR har historisk set været anvendt på en population (blanding af både genaktivering og latent aftryk) af dyrkede celler, kvantificere viral udskrifter, og vurdering af virkningerne på den virale genekspression. Ved hjælp af metoden ovenfor beskrevne kan analyser indsnævres til de enkelt episomal niveau at undersøge viral transskription. Spatiotemporelle regulering af andre cellulære og viral enzymer kan således undersøges for at få indblik i deres tilknytning til KSHV reaktivering. Det er også værd at nævne, at fordi RNA intron regionens forbigående natur er afhængige af deres nedbrydning, at RNA fisk sonder vil krydse sig og typisk lokalisere hvor aktive transskription finder sted, men hvis introns ikke nedbrudt straks, kan fisk sonder præsentere signaler, der ikke er altid i nærheden af aktive transskription.

I øjeblikket er det svært at studere forholdet mellem dannelsen af cellulære transskription fabrikker og efterfølgende genekspression af genomisk størrelser og kompleksiteten af konfiguration af cellulære initiativtagere. I denne henseende kan KSHV episomes være et ideelt værktøj som følge af deres relativt lille genom størrelse, definerede reaktivering mekanismer med klare RNA Pol II samlede formationer. Ved hjælp af KSHVS manipulerbare viral mini kromosom, kan herpesvirology bidrage til feltet cellulære Epigenetik forskning fra en unik vinkel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne til dette papir har ingen finansielle bånd eller konkurrerende interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health grant (R01-DE025985) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dette arbejde blev også støttet af tilskud fra den amerikanske Department of Agriculture (2015-67015-23268 og 2014-67015-21787) og ny forskning initiativ tilskud fra University of California, Davis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium 1650 GlutaMAX Gibco by Life Technologies 61870-036 Needs to be warmed to 37 °C
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Inc. FB-11
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco by Life Technologies 10378-016
Thymidine  Sigma Aldrich T9250
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution Gibco by Life Technologies 14190-144
TPA Sigma Aldrich P1585
Sodium Butyrate  Sigma Aldrich B5887
Formaldehyde Solution  Sigma Aldrich 252549 Corrosive, toxic, health hazard
Diethyl Pyrocarbonate Sigma Aldrich D-5758 Acute toxicity 
Glycine Sigma Aldrich 410225
Acetone Sigma Aldrich 179124 Flammable, toxic
Methanol Fisher Chemical  67-56-1 Flammable, toxic, health hazard
Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 EMD Milipore 05-623
Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae)  Sigma Aldrich 9014-25-9
Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) Thermo Fisher Scientific  15557044
Formamide  Sigma Aldrich 295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution EMD Milipore 1916C093
DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific  D1306
slowFade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Micro cover glass 22x22 Matsunami C022221
VoloCITY 3D imaging software
DeltaVision microscope
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).

Tags

Mikrobiologi sag 131 Viral transskription factory KSHV Kaposis sarkom-associerede Herpesvirus transskription RNA Polymerase II RNA-fisk aktive transskription
Funktionel billeddannelse af Viral transskription fabrikker ved hjælp af 3D Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. More

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56832, doi:10.3791/56832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter