Summary
Viral transkriptionell fabriker är diskreta strukturer som är berikad med cellulära RNA-polymeras II att öka viral gentranskription under reaktivering. Här beskrivs en metod för att hitta platser att aktivt transkribera viral kromatin i 3D kärn-rymden genom en kombination av immunofluorescens färgning och i situ RNA hybridisering.
Abstract
Det är väl känt att rumsliga och tidsmässiga regleringen av gener är en integrerad del av reglerar korrekt genuttryck. Därför är det ovärderligt att förstå var och när transkription sker inom kärnkraft utrymme och att visualisera förhållandet mellan episomes smittade inom samma cellens kärna. Här, både immunofluorescens (IFA) och RNA-fisk har varit combinedto identifiera aktivt transkribera Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) episomes. Genom färgning KSHV latens-associerade nukleär antigen (LANA), är det möjligt att lokalisera där viral episomes finns inom kärnan. Dessutom, genom att designa RNA-fisk sonder att rikta regionen intron i en viral genen, som uttrycks endast under produktiv infektion, kan begynnande RNA avskrifter finnas. Med denna kombination av molekylär sonder, är det möjligt att visualisera montering av stor viral transkription fabriker och analysera den rumsliga regleringen av viral genuttryck under KSHV reaktivering. Genom att inkludera anti-RNA-polymeras II antikroppen färgning, kan en också visualisera kopplingen mellan RNA-polymeras II (RNAPII) aggregering och KSHV transkription under reaktivering.
Introduction
Det har blivit allt tydligare att spatiotemporal organisationen av kärnan spelar en viktig roll i modulerande finstämda genuttryck i Eukaryoter. De flesta vävnad specifika gener är fördelade över många kromosomer och måste regleras synkront för att reagera på specifika stimuli på ett samordnat sätt1. Celler konstruera aktiva kromatin hubbar (ACH) som ett sätt att sammanföra gener och deras cis-reglerande komponenter till specifika nukleära utrymme1.
Det har också visats i olika studier att även om kärnan verkar mycket tät och trögflytande, biologiskt aktiva molekyler kan passera kärnan ganska snabbt via diffusion2. Till följd av detta tillfälliga boende hoppa de flesta DNA-bindande proteiner' ' från bindande webbplats bindande webbplats, känna sig runt kärnkraft utrymmet, vilket möjliggör en mycket anpassningsbar och mångsidig nucleus2.
Trots detta dynamiska beteende av biomolekyler i kärnan, kärn organ utan membran som (men inte begränsat till) det nucleolus, Cajal organ och promyeloisk leukemi kärn organ (PML-NB) fortfarande existerar. Det är genom en mängd olika mekanismer såsom DNA tandemupprepningar (nucleolus), rRNA (nucleolus) och strukturella proteiner såsom coilin (Cajal förkroppsligar) eller PML proteiner (PML-NB) som håller dessa konstruktioner grupp3,4,5 . Dessa strukturer och andra församlingar såsom transkription fabriker fungera som ställningar som inte bara öka den lokala koncentrationen av nödvändiga komponenter, men också reglerar sammansättningen av proteiner och nukleinsyror inom dem att slutligen skapa en central plats för effektiv cellulära funktioner6.
Visualisera när och var nukleära kontostrukturer formuläret ger en mängd information för forskare som studerar epigenetik. Ur virologi reaktivering av latent infekterade virus, till exempel KSHV, betydligt förändrar landskapet av kärnan och distribution av nukleära enzymer att skifta transkription främst från cellulära gener till virala gener, slutligen till producera fullt fungerande viral avkomma7,8. Hur KSHV manipulera den cellulära gen uttryck maskinen att underlätta viral genuttryck? Sådan information kan också belysa temporal cellulära gen regleringsmekanismer.
Liksom alla andra herpesviruses har KSHV två livscykler som kallas lytisk replikering och latens. KSHV bor främst i latens scenen, där de flesta av dess viral genen uttryck är tystade, förutom latens associerade gener9,10. Under latens KSHV producerar tillhörande latens nukleär antigen (LANA), som konstitutivt binder virala arvsmassan och tjuder viral kromatin till kromosom11. På grund av LANAS intim relation med den virala arvsmassan är det möjligt att använda IFA och DAPI att fläcken och lokalisera var de virala episomes var i förhållande till värd kromatinet.
För att studera KSHV reaktivering på nivån enda episome och föreningen med andra virala episomes i en infekterad cell, har en strategi för att lokalisera aktivt transkribera viral kromatin i situ fastställts. Följaktligen LANA och RNAPII IFA med intron RNA-fisk kombinerades, genom att generera RNA-fisk prober som binder till regionen intron (exakta probe sekvenser kan hittas i Izumiya Labbets senaste publikation8) KSHV K-Rta-den viktiga virala protein som är nödvändig och tillräcklig för KSHV reaktivering-det var möjligt att identifiera där transkription faktiskt äger rum8,11,12,13,14,15 . Denna intron RNA-FISH teknik gör det möjligt för forskare att visualisera där mRNA är transkriberas omedelbart innan det skarvas och exporteras till cytoplasman16,17.
KSHV kan återaktiveras genom olika kemiska stimuli inklusive phorbol estrar såsom 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) och Histon histondeacetylas-hämmare såsom natrium butyrate, dessutom KSHV kan förmås att återaktivera av överuttryck av den virala transkriptionsfaktor, K-Rta19. Forskare har framgångsrikt ökat effektiviteten i KSHV reaktivering genom att synkronisera cellens cykler innan inducerande reaktivering18. Således, för dessa särskilt undersökningar, celler synkroniserades med en dubbel tymidin block (protokollet beskrivs nedan) och inkuberas med TPA och doxycyklin (Dox) för en kort tid. Doxycycline användes eftersom den cellinje som utnyttjas i dessa experiment har en doxycyklin-inducerbara K-Rta kassett, som klonats från cDNA och inkluderar inte regionen intron i K-Rta. Även om det är möjligt att återaktivera KSHV använder endast inducerad K-Rta uttryck, det har bevisats av andra forskare att K-Rta uttryck enbart på grund av en mängd olika biokemiska faktorer visar sig vara en svag reaktivering stimuli20. Genom att kombinera alla dessa, och genom att begränsa de drogen inkubationer till en kort tidsperiod, uppnåddes en robust men inte alltför konstgjorda KSHV reaktivering för avbildning.
Efter märkning LANA, RNAPII, K-Rta introner, och DNA som beskrivs i detta papper, 3D fluorescens imaging utfördes med widefield deconvolution Mikroskop. Efter bearbetning med bildbehandlingsprogram, kan den rumsliga fördelningen av aktiv viral episomes utvärderas ordentligt. Med denna teknik, kan de centrala frågorna angående den grundläggande karaktären av bildandet av aktiva kromatin hubbar och andra nukleära strukturer studeras. Att ha identiska viral episomes i en enda cell som bearbetar samma rättsliga element kan representera en unik forskningsverktyg för att fördjupa förståelsen av spatiotemporal gen regleringsmekanismer.
En begränsning av imaging flera cell exemplar fast vid olika tidpunkter för att karakterisera en inneboende molekylär dynamik är att subtila eller småskaliga förändringar i fluorescens fördelningen oupptäckta eller anses obetydlig. Detta gäller såvida i sällsynta fall, varje cell observeras visar samma subtil förändring. Således, full spatiotemporal förhållandet mellan aktiv viral transkription och andra nukleära strukturer inte kritiskt utvärderas med hjälp av fasta imaging. För att lösa dessa tekniska utmaningar, är det bästa sättet att följa platsen för viktiga cellulära enzymer över tid och bild levande celler som har präglat viral episomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FÖRSIKTIGHET: Cellinjer som används i den här proceduren innehåller infektiösa virus, var försiktig och gå bara vidare i nivå 2 BSL anläggning eller högre.
1. cell förberedelser och underhåll
- Kultur TREx-K-RTA BCBL-1 celler (eller en annan KSHV infekterade PEL cellinjer) i RPMI1640 medium kompletteras med 15% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin streptomycin glutamin lösning.
- Odla cellerna vid 37 ° C med 5% koldioxid (CO2), se till att kontinuerligt växa och dela celler av ett förhållande av 1:4 var 2 – 4 dagar.
- Övervaka cellkulturer med ett ljusmikroskop varje dag för att bekräfta bra celltillväxt och morfologi, annars rekommenderas att starta om cellkulturen eller justera villkoren cell kultur.
2. tymidin synkronisering och lytisk induktion
- I en 10 cm petriskål, plattan TREx-K-Rta BCBL-1 celler i nylagade media (1 x 106 celler/2 mL av media)
- Lägga till 200 mM tymidin (slutlig koncentration: 2 mM) i skålen, mixa och inkubera 18 h.
- Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 500 x g. Tvätta cellerna med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Centrifugera igen och resuspendera cellerna i nylagade media. Upprepa för sammanlagt 3 tvättar. Återsuspendera i nylagade media.
- Att cellerna att avsluta S-fas för 8 h.
- Lägg till tymidin (slutlig koncentration: 2 mM), blanda och inkubera i 16 h.
- Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 500 x g. Tvätta cellerna med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Centrifugera igen och resuspendera cellerna i nylagade media. Upprepa för sammanlagt 3 tvättar. Återsuspendera i nylagade media.
- För att inducera viral reaktivering, lägga till 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, slutlig koncentration 20 ng/mL) och doxycyklin (DOX, slutlig koncentration 100 ng/mL) i cellkulturen, blanda och inkubera i 4 h. För cell linjer utan en K-Rta inducerbara kassett, stimulera reaktivering använder TPA (slutlig koncentration 20 ng/mL och natrium butyrate (1 mM)).
- Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 500 x g. Tvätta cellerna med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Centrifugera igen och resuspendera cellerna i komplett kultur media. Upprepa för sammanlagt 3 tvättar. Återsuspendera i komplett kultur media.
- Att cellerna att växa under 24 h.
3. fixering och permeabilisering
Not: Innan, se till fastställande lösning (3,7% formaldehyd i DEPC-behandlad PBS), dietyleter pyrocarbonate-behandlade fosfatbuffrad saltlösning (DEPC-PBS), glycin DEPC PBS (slutlig koncentration av glycin: 100 mM) och permeabilizating lösning (50% aceton, 50% metanol) är beredda. Vanligtvis kommer varje bild kräver minst 0,5 miljoner celler, multiplicera vid behov och innehåller extra celler för tillbaka upp speciellt om cellerna inte är friska.
- Samla in cellerna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Centrifugera cellerna för 2 min vid 200 x g. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL steril DEPC PBS. Återsuspendera i 1,2 mL DEPC PBS.
- Placera lämpligt antal coverslips (bestäms av inställningen för experimentell) i bottnar i en 6-bra platta.
- Pipettera 200 µL av cellen DEPC PBS blandningen på varje täckglas, se till att minst 0,5 miljoner celler på varje bild. Tillåta cellerna att nöja sig med 2 min, och aspirera överskott DEPC PBS lämnar endast ett tunt lager av celler. Det är normalt för celler tas bort i denna process.
Försiktighet: PFA är giftiga, bära lämpligt skydd. - Tillsätt försiktigt 1 mL fastställande lösning (3,7% formaldehyd i DEPC PBS) till varje täckglas. Att cellerna att fixa i 10 min.
- Tvätta coverslips 3 gånger med DEPC PBS.
- Tillsätt försiktigt 1 mL av glycin DEPC PBS (slutlig koncentration av glycin: 100 mM) till varje täckglas. Att cellerna att släcka för 5 min.
- Tillsätt 1,5 mL DEPC PBS och antingen plats på en shaker för 5 min eller skaka ordentligt men försiktigt i handen för 1 min. Aspirera överskott DEPC PBS. Var noga med att inte störa cellerna. Upprepa detta steg för totalt 3 tvättar.
- Tillsätt försiktigt 1 mL permeabilizing lösning (50% aceton, 50% metanol) till varje täckglas. Tillåta cellerna till permeabilize i 15 min.
Obs: Vid denna punkt, coverslips kan förvaras i frys-20 ° C längre än en vecka. Undvika frysning eller minimera tiden i frysen som bildkvaliteten kan försämras snabbt. Se till att när i frysen som cellerna förblir våta och täckt i metanol/aceton och för att säkerställa att de korrekt rehydrera med DEPC PBS efter borttagning från frysen. - Tillsätt 1,5 mL DEPC PBS och antingen plats på en shaker för 5 min eller skaka ordentligt men försiktigt i handen för 1 min. Aspirera överskott DEPC PBS, var noga med att inte störa cellerna. Upprepa detta steg för totalt 3 tvättar.
4. IFA och RNA-fisk
Obs: Angående RNA fisk sonden märkning och förberedelse: för the K-Rta intron som är 959 baspar, 31 olika sonder var genereras som var 20 baspar varje, som innehåller en GC av ca 50%. Arbets- och lager lösningar av sonderna var aliquoted till 100 µM och 2,5 µM koncentrationer, respektive.
- Etiketten objektglas med nödvändiga experimentella uppgifter eller någon form av distinguishable etikett.
- Lina nederkant aven en förslutningsbar plastbehållare med en fuktig pappershandduk.
-
Bered den primär antikropp (1,5 µL av LANA antikropp, 0,75 µL av RNA Pol II antikroppen, 3 µL av baker's jäst tRNA, DEPC PBS upp till 30 µL), och multiplicera recept för varje närvarande täckglas. Plats 30 µL primär antikropp lösning på varje märkt objektglas.
- Titrera den primär antikroppen av intresse först och använda det optimala beloppet. Var noga med att använda renade IgG, serum (ascitesvätska) kan innehålla stora mängder RNase.
- Placera täckglaset (celler inför lösningen) på de märkta objektglas och flytta bilderna till behållaren med fuktig pappershandduk. Var noga med att inte införa bubblor. Täcka utsidan av behållaren med plastfolie. Flytta behållaren i en inkubator inställd på 37 ° C i 1 h.
- Förbereda en fisk tvättbuffert (2 x saltlösning natriumcitrat buffert (SSC) (final), 10% formamid, 90% DEPC dH2O).
- Förbered 2 x hybridisering buffert (4 x SSC, 20% dextran sulfat).
- Förbereda sekundär antikropp och fisk intron sonden buffert (20 µL av 2 x hybridisering buffert (final 1 x Hyb buffert), 4 µL av bagerijäst tRNA (sista 10%), 4 µL av formamid (sista 10%), intron K-Rta sonden (Slutlig 125 nM), 0,8 µg sekundära antikroppar, DEPC dH2 O upp till 40 µL). Multiplicera recept för varje bild som behövs.
- Efter inkubation, tvätta cellerna 3 gånger med DEPC PBS i en 6 väl platta för 5 min varje.
- Tvätta med tvättbuffert fisk 3 gånger för 5 min varje. Hålla täckglas i fisk-tvättbuffert tills avsluta förbereda blandning av andra antikropp och intron sonden (steg 4.7).
- Rent glas-bilder som används för primär antikropp inkubation för hybridisering.
- Plats 40 µL av sekundär antikropp och fisk intron probe innehållande lösning till varje glas-bilden.
- Placera coverslips med celler på bilderna med cell vänd ovanpå bufferten, vara noga med att inte införa bubblor.
- Placera glasen i en plastbehållare med en fuktig pappershandduk på botten. Linda plast behållaren i första plastfolie och aluminiumfolie.
- Inkubera behållaren med bilderna vid 37 ° C för 16-24 h.
- Efter inkubation, försiktigt dra täckglaset från kant av glas bilden, sätta tillbaka på 6 plattor uppåt och tvätta cellerna med fisk-tvättbuffert 3 gånger i en 6 väl platta för 5 min varje.
- Tvätta cellerna 2 gånger med 2 x SSC.
- Lägg till DAPI (1:1, 000) till 2 x SSC och låt sitta i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna 2 gånger med 2 x SSC.
- Rengör glas-bilder som används för hybridisering och tillsätt 10 µL monteringslösning på glasskivor.
- Lägg coverslips nedåtvänt på montering lösningen. Var noga med att inte införa bubblor.
- Med ett laboratorium vävnad, och ta försiktigt bort överflödigt montering lösningen, att vara noga med att inte squash cellerna.
- Använda nagellack, applicera ett gott lager runt kanten på coverslips och låt torka.
- Fortsätt att utföra fluorescensmikroskopi.
5. 3D fluorescensmikroskopi
Obs: Medan protokoll varierar med typ av fluorescens Mikroskop system används följande steg kommer att se till förvärvet av optimal bilddata för kvantitativ analys.
- Förbehandla fasta prover och montera i anti fade media att fördröja fluorescens fotoblekning under imaging.
- Använd en hög kvalitetsmål (till exempel en 60 X 1,42 N.A Oljeimmer objektiv), som kan fånga en hel cell (eller cellkärna) i den fält-of-view.
- Ställ in exponeringsparametrar (t.ex., excitation makt, exponeringstid) för varje fluorescens färgkanal, med positiv och negativ kontroll prover. Förvärva fluorescens bilder.
Obs: Positiva kontrollprover som innehåller endast en fluorescerande etikett bör också användas för att bestämma nivån på ”överhörning” mellan färgkanaler. För imaging fast cell prov minskas fluorescens excitation makt (med något längre exponeringstider) för att minimera fotoblekning. - När protokollet imaging har fastställts, bibehålla samma exponeringsparametrar konsekvent för alla prover i en studie — så att bilddata kan vara noggrant analyseras och jämförs.
- Utföra efter förvärvet bildbehandling och 3D rekonstruktion. Identifiera de K-Rta avskrifter av RNA-fisk signal (röd), LANA molekyler genom immunofluorescens (grön) och nukleära kromatin (i tillämpliga fall) färgas med DAPI (blå).
Obs: Regioner i cellkärnan, där K-Rta och LANA är samtidig klustrade, tros därmed associeras med viral transkription fabriker och replikering komplexa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En något förkortad protokoll framfördes där BCBL-1 celler användes och endast LANA och K-Rta RNA var målat (figur 1). Detta experiment tillåter oss att undersöka var aktivt transkribera viral episomes är och heterogenitet svar på KSHV reaktivering stimuli i en population av celler. I den cell som anges av pilen i figur 1, är den distinkta K-Rta fluorescensen i regioner som nära matchar fördelningen av viral episomes (markerad med LANA) bevis för aktiva transkription äger rum nära KSHV genomen. I samma prov, kan celler som betecknas med pilspetsen i figur 1 observeras, som uppvisar mycket svagare och diffus K-Rta fluorescens som inte överlappar avsevärt med LANA. Detta illustrerar allmänna konstaterandet att det finns betydande variationer i graden av svar på reaktivering stimuli inom en population av celler.
Figur 1: Visualisera aktiva transkription av viral episomes. IFA och RNA-fisk utfördes på BCBL-1 celler. BCBL-1 cellerna var inte synkroniseras men behandlas med TPA och natrium butyrate för 4 h. med LANA immunfärgning, virala genomer var visualiserat i grönt, medan RNA-fisk utfördes inriktning K-Rta introner till ligger aktiva transkription i rött. Cellulära kromatin var färgade inlägg fixering och permeabilisering med DAPI. K-Rta intron och LANA fläckar slogs ihop. Full pilen pekar till en cell som har fullt återaktiveras och bildar VTFs. Medan pilspetsen pekar mot en cell som endast börjar återaktivera, som föreslagits av den svaga K-Rta-signalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Nästa undersöktes effekten av tymidin synkronisering genom att visualisera uttrycket av virala protein K-Rta (figur 2). Efter en dubbel tymidin block utfördes för att synkronisera TREX BCBL-1 celler på G1/S fas övergången, det protokoll som tidigare beskrivits utfördes (utan LANA och RNAPII färgning). Genom att undersöka K-Rta färgningen, är det helt uppenbart att synkroniserade celler mer besvarade de reaktivering stimuli än befolkningen i osynkroniserade. Från tidigare studier som utförts i Izumiya labbet (inga data anges), har den verifierats att RNAPII också colocalizes oftare med K-Rta efter cellcykeln synkroniseringen.
Figur 2: Tymidin effektivitet. RNA-fisk utfördes på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Celler (indikeras av den ”2 x Thy” titel) synkroniserades med en dubbel Tymidinanalog-block. Båda osynkroniserade och synkroniserade cellpopulationer behandlades med TPA och DOX för 4 h. K-Rta introner var hybridiseras till RNA fisk sonder. Celler som är enhetligt klarröda överuttryck inte av K-Rta, istället är de döda, verifieras med DAPI färgning (visas inte). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som en allmän anmärkning är det mycket viktigt att färga celler med DAPI när du utför detta protokoll. Apototic celler kan lätt kännas igen av nukleära fragmentering och blebbing. Tanke på tunga induktion stimuli och allmänna cell kultur praxis, är det vanligt att vissa döda celler ses. Det är viktigt att alltid fläcken med DAPI som en primär metod att urskilja mellan levande och döda celler. Ibland antikroppar eller RNA sonderna kommer att fastna i apoptotiska celler och producera signaler, det är därför viktigt att utesluta dessa celler från analyser. DAPI färgning kan tjäna flera ytterligare funktioner, till exempel i figur 3, är det tydligt att det objekt som anges av pilen är egentligen tre separata celler i stället för en.
Det är viktigt att notera att bilderna som visas i figur 3 och figur 4 var deconvolved vilket skapar en mer punktuell mönster. Genom att undersöka RNAPII fläcken, skillnaden mellan cellerna som anges av pilen och andra omgivande celler kan ses. Det är anmärkningsvärt att nämna att RNAPII signalen är mycket starkare än normalt på grund av deconvolution.
Använda 3D mikroskopi tillsammans med denna teknik tillåter oss att förhöra rumsliga sambandet mellan RNAPII, LANA och K-Rta. Till exempel i figur 4, kan ringliknande RNAPII strukturer ses med KSHV genomen prickade i periferin. LANA colocalizes i allmänhet, vanligen med RNAPII i celler utveckla transkription fabriker. Dock inte alla LANA punkter colocalize med RNAPII, studier inklusive 4th dimension (time) skulle vara nödvändigt att förtydliga denna fenotyp. Det är viktigt att tillägga att några LANA prickar som inte colocalize med K-Rta signaler representerar episomal heterogenitet i svaret till reaktivering stimuli även inom en enskild cell (figur 4).
Figur 3: Kombinerade IFA och intron RNA-fisk. IFA och RNA-fisk utfördes på TREX K-Rta BCBL-1 celler. Virala genomer lokaliserades med immunfärgning av LANA (grön), aktiva transkription var visualiserat med RNA-fisk i regionen intron i K-Rta mRNA (gul), RNAPII (röd) församlingar var märkt med IFA och cellerna var äntligen målat med DAPI till bild DNA (blå). TREx K-RTA BCBL-1 celler synkroniserades med en dubbel tymidin block, sedan celler var återaktiverade via inkubation med TPA och DOX för 4 h och 24 h senare cellerna var fast, permeabilized, och vidare beredda för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 3D-visualisering av Viral transkription fabriker. Intron RNA-fisk använder K-Rta intron sonder (ljusblå), immunfärgning av RNAPII (röd) och LANA (grön) och DAPI DNA färgning (mörkblå). Deconvolved 3D-rendering av en Z-stack tagit på mikroskopet, behandlas och byggda på kommersiella bildprogram (se tabellen för material). TREx K-Rta BCBL-1 celler dubbel tymidin synkroniseras och sedan behandlas med TPA och DOX för 4 h. cellerna bearbetades 28 h efter reaktivering stimulerades. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns vissa aspekter av det protokoll som kan ändras för att rymma ovanliga omständigheter. Valet av fixering och permeabilisering buffertar kan också ändras. För fixering buffertar, paraformaldehyd är också effektivt och etanol kan användas för permeabilisering.
Snabbkylning formaldehyd med glycin PBS rekommenderas eftersom det förhindrar formaldehyd inaktivera antikropparna i avsaknad av bovint serumalbumin (BSA), men om coverslips tvättas grundligt tillräckligt, det glycin PBS steget kanna bli hoppat. I protokollet, Undvik att använda bovint serum albumin som en blockerande lösning. Pilotstudierna genomfördes i Izumiya labbet visade svagare RNA-fisk signaler, förmodligen på grund av RNA nedbrytning. Om blockering för primära antikroppen behövs, är det rekommenderat att använda RNase gratis BSA. Från tidigare erfarenhet märktes det att om antikroppen är specifik, införande av BSA inte är nödvändigt i reaktionen. Emellertid, det rekommenderas att alltid inkludera ett överskjutande belopp av jäst tRNA i alla inkubation kliver till förhindra RNA nedbrytning. Man har märkt att använda tRNA som blockerar agent ökade speciella RNA-fisk signalerna.
Cellcykeln synkronisering har genomförts för att producera en mer effektiv och synkron KSHV reaktivering. För synkronisering av cellcykeln kanske hydroxyurea eller serum svält alternativa metoder. Det har bekräftats att hydroxyurea är lika effektivt som att använda ett tymidin block, även om inkubation med hydroxyurea ensam reaktiverar KSHV svagt.
Hur kan denna teknik användas till andra studier? I Izumiya Labbets senaste publikation visade det sig att colocalization att aktivt transkribera KSHV episomes och RNA pol II, ett viktigt enzym för RNA transkriptionen. Det är dock känt att det finns ett antal aktivatorer, samtidig kvinnoförtryckarna och cellulära transkriptionell faktorer inblandade i KSHV genreglering. Kvantitativ RT-PCR använts historiskt på en befolkning (blandning av både återaktivera och latent) av odlade celler, kvantifiera viral avskrifter och bedöma effekterna på viral genuttrycket. Använder den strategi som beskrivs ovan, kan analyser vara minskat ner till enstaka episomal nivå att undersöka viral transkription. Spatiotemporal regleringen av andra cellulära och virala enzymer kan således undersökas för att få inblick i deras förening med KSHV reaktivering. Men är det också anmärkningsvärt att nämna att eftersom RNA intron regionens övergående natur är beroende av deras nedbrytning som RNA fisk prober hybridiserar och vanligtvis lokalisera där aktiva transkriptionen sker, om intronerna inte bryts omedelbart, kan fisk sonder presentera signaler som inte alltid finns nära aktiva transkription.
För tillfället är det svårt att studera förhållandet mellan bildandet av cellulära transkription fabriker och efterföljande genuttryck på grund av deras genomisk storlekar och komplexitet av konfiguration av cellulära initiativtagare. I detta avseende kan KSHV episomes vara ett idealiskt verktyg till följd av deras relativt små genomet storlek, definierade reaktivering mekanismer med tydlig RNA Pol II aggregerad formationer. Genom att använda KSHVS bökbart viral mini kromosom, kan herpesvirology bidra till fältet cellulära epigenetik forskning från en unik vinkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna till denna uppsats har inga ekonomiska band eller konkurrerande intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health grant (R01-DE025985) och en American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Detta arbete stöddes också av bidrag från US Department of Agriculture (2015-67015-23268 och 2014-67015-21787) och nya initiativ forskningsanslag från University of California, Davis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
