Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

Published: January 18, 2018 doi: 10.3791/56832
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

Summary

מפעלים תעתיק ויראלי הם מבנים בדידים מועשר עם הסלולר RNA פולימראז II כדי להגדיל את שעתוק גנים ויראליים במהלך הפעלה מחדש. . הנה, מתוארת שיטה לאיתור אתרים של פעיל תעתיק כרומטין ויראלי במרחב תלת-ממדי גרעינית על ידי שילוב של immunofluorescence מכתים, בחיי עיר RNA הכלאה.

Abstract

ידוע כי יכולות ויסות גנים היא חלק בלתי נפרד המסדירים ביטוי נאות גנים, הוא... כתוצאה מכך, זה לא יסולא בפז. כדי להבין איפה ומתי שעתוק מתרחש בתוך הגרעין וכדי להמחיש את הקשר בין episomes נגועים בתוך גרעין התא אותו. כאן, היה immunofluorescence (IFA) ו- RNA-דג combinedto לזהות באופן פעיל תעתיק episomes הקשורים סרקומת קפוסי ההרפס (KSHV). על ידי צביעת KSHV השהיה-הקשורים גרעיני אנטיגן (לנה), זה ניתן לאתר היכן episomes ויראלי קיימים בתוך הגרעין. בנוסף, על-ידי עיצוב הגששים RNA-דג כדי להתמקד באזור אינטרון של גנים ויראליים, שבא לידי ביטוי רק במהלך זיהום פרודוקטיבי, המתהווה תעתיקים RNA יכול להיות ממוקם. באמצעות השילוב של הגששים מולקולרית, זה אפשרי לדמיין את ההרכבה של מפעלים גדולים שעתוק ויראלי ולנתח ויסות גנים ויראליים במהלך הפעלה מחדש KSHV מרחבית. על-ידי הכללת אנטי-RNA פולימראז II נוגדן מכתים, אחד יכול לדמיין גם את הקשר בין צבירת RNA פולימראז II (RNAPII) ו- KSHV שעתוק במהלך הפעלה מחדש.

Introduction

זה הפך ליותר ויותר ברורה כי ייתכן הארגון של הגרעין ממלא תפקיד חשוב ב להתכוונן ביטוי גנים משומנות ב פרוקריוטים. רוב רקמת גנים ספציפיים מופצים על פני הכרומוזומים רבים, צריך להיות מוסדר באופן סינכרוני כדי להגיב לגירויים ספציפיים בצורה מתואמת1. תאים לבנות כרומטין פעיל רכזות (ACH) כדרך וקירוב גנים ומרכיביהן cis-רגולציה הגרעין ספציפי1.

זה גם הוכח על ידי מחקרים שונים כי למרות הגרעין נראה צפוף מאוד צמיגה, מולקולות פעילים ביולוגית שבאפשרותם הגרעין די מהר באמצעות דיפוזיה2. בשל תכונה זו ארעיות, רוב ה-DNA מחייבת חלבונים 'לקפוץ' איגוד האתר מחייבת באתר, מרגיש דרכם סביב הגרעין, מה שמאפשר עבור גרעין מאוד גמישים ופסיביות2.

למרות התנהגות דינמית זו של מולקולות בתוך הגרעין, גרעיני גופות ללא ממברנות כגון (אך לא רק) גרעינון, קחאל גופות וגופים פרומיאלוציטית לוקמיה גרעינית (PML-NB) עדיין קיים. . זה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים כגון חזרה DNA טנדם (גרעינון), rRNA (גרעינון) חלבונים מבניים כגון coilin (גופים קחאל) או PML חלבונים (PML-NB) שמחזיקים אלה בונה יחד3,4,5 . מבנים אלה ושל קהילות אחרות כגון מפעלי שעתוק לשמש פיגומים לא רק להגדיל את הריכוז המקומי של הרכיבים הנדרשים, אך גם לווסת את ההרכב של חלבונים וחומצות גרעין בתוך אותם בסופו של דבר ליצור אתר מרכזי יעיל תאיים6.

להמחיש מתי ואיפה מבני הגרעין טופס מספק שפע של מידע לחוקרים הלומדים אפיגנטיקה. מנקודת מבט וירולוגיה, שהפעלה של לחשוף נגוע וירוסים, כגון KSHV, משנה באופן משמעותי את הנוף של גרעין והפצה של אנזימים גרעינית כדי להעביר שעתוק בעיקר מן הגנים הסלולר גנים ויראליים, בסופו של דבר אל לייצר באופן תקין רומא ויראלי7,8. איך KSHV לתפעל את מכונות ביטוי גנים הסלולר כדי להקל על ביטוי גנים ויראלי? מידע כזה יכול גם לשפוך אור על מנגנוני הרגולציה ג'ין הסלולר טמפורלית.

כמו כל herpesviruses אחרים, KSHV יש שני מחזורי החיים שנקרא שכפול lytic וזמן ההשהיה. KSHV מתגוררת בעיקר בשלב החביון, שרוב שלה ג'ין ויראלי ביטוי מושתק, אלא השהיה הקשורים גנים9,10. במהלך השהיה ש-KSHV מייצרת השהיה קשור אנטיגן גרעיני (לנה), אשר צורונים נקשר הגנום הנגיפי ואת היתדות כרומטין ויראלי כרומוזום אנושי11. בגלל לאנה יחסים אינטימיים עם הגנום הנגיפי, זה אפשרי להשתמש IFA דאפי כתם ולאתר איפה episomes ויראלי היו ביחס כרומטין המארח.

ללמוד הפעלה מחדש KSHV ברמת episome יחיד, את הקשר עם אחרים episomes ויראלי תא נגוע, הוקם אסטרטגיה לאתר פעיל תעתיק כרומטין ויראלי בחיי עיר . בהתאם לכך, לאנה, IFA RNAPII עם אינטרון RNA-דג משולב, על ידי יצירת RNA-דג הגששים לאגד לאזור אינטרון (בדיקה המדויק ניתן למצוא רצפים של המעבדה Izumiya הפרסום האחרונה8) של חלבון נגיפי מפתח KSHV K-Rta-זה חיוני ומספיק KSHV הפעלה מחדש-זה היה ניתן לזהות היכן שעתוק למעשה לוקח במקום8,11,12,13,14,15 . אינטרון זו טכניקת ה-RNA-דג מאפשר לחוקרים לדמיין איפה ה-mRNA הוא עיבד מיד לפני זה הוא משולבים וייצא אל הציטופלסמה16,17.

KSHV ניתן להפעיל מחדש על ידי גירויים כימיים שונים לרבות אסטרים phorbol כגון 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA), מעכבי deacetylase היסטון כגון נתרן butyrate, בנוסף KSHV יכולה להיגרם להפעיל מחדש על ידי ביטוי של פקטור שעתוק ויראלי, K-Rta19. בהצלחה להגביר את היעילות של KSHV הפעלה מחדש על-ידי סינכרון מחזורים של התא לפני גרימת הפעלה מחדש18. לפיכך, ללימודים אלה מסוים, תאים סונכרנו מודגרות עם TPA ו דוקסיציקלין (Dox) לזמן קצר ושימוש בלוק תימידין כפול (פרוטוקול המתואר להלן). Doxycyline שימש כי הקו תא מנוצל בניסויים אלה יש קלטת K-Rta inducible-דוקסיציקלין, אשר היה שוכפלה מ cDNA אינו כולל האזור אינטרון של K-Rta. למרות שניתן להפעיל מחדש רק באמצעות KSHV המושרה בביטוי K-Rta, הוכח על ידי חוקרים אחרים כי בשל מגוון גורמים ביוכימיים שונים בביטוי K-Rta לבד מוכיחה להיות גירויים הפעלה מחדש חלש20. על ידי שילוב של כל אלה, על-ידי הגבלת incubations את התרופה לתקופה קצרה של זמן, הפעלה מחדש KSHV חזקים אך לא יתר על המידה מלאכותית הושגה עבור הדמיה.

לאחר תיוג לאנה, RNAPII, K-Rta אינטרונים, דנ א כמו שמתואר הנייר הזה, הדמיה תלת-ממדית פלורסצנטיות התבצע בעזרת מיקרוסקופ deconvolution widefield. לאחר העיבוד עם תוכנות ליצירת תמונות, התפוצה המרחבית של episomes ויראלי פעיל שניתן יהיה להעריך כראוי. בעזרת טכניקה זו, השאלות המרכזית לגבי אופי מהותי של היווצרות של כרומטין פעיל רכזות ומבנים אחרים גרעיני יכול להילמד. שיש episomes נגיפי זהה בתא יחיד המעבדת אותם רכיבי רגולטוריות עשוי לייצג כלי מחקר ייחודי להעמיק את ההבנה של מנגנונים רגולטוריים ייתכן ג'ין.

מגבלה של הדמיה מרובים תא דגימות קבוע בנקודות זמן שונות כדי לאפיין תהליך מולקולרית מטבעו דינאמי הוא שינויים עדינים או בקנה מידה קטן התפלגות קרינה פלואורסצנטית מבלי שיבחינו או ייחשב חסר חשיבות. זה נכון, אלא אם כן במופע נדיר, כל תא נצפתה מציגה את השינוי אותו עדין. לכן, הקשר מלא זמן-מרחבי של שעתוק ויראלי פעיל ומבנים אחרים גרעינית לא ניתן באורח קשה להעריך באמצעות הדמיה קבוע. כדי לטפל אלה אתגרים טכניים, הגישה הטובה ביותר היא התמונה תאים חיים המסומנים episomes ויראלי, לעקוב אחר המיקום של אנזימים הסלולר מפתח לאורך זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התראה: שורות תאים המשמשים בהליך זה להכיל וירוסים זיהומיות, להיזהר והמשך רק במתקן BSL רמה 2 ומעלה.

1. תא הכנה ותחזוקה

  1. התרבות התאים TREx-K-RTA BCBL-1 (או KSHV עוד נגוע שורות תאים פל) בינוני RPMI1640 בתוספת 15% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין סטרפטומיצין גלוטמין פתרון.
  2. לגדל תאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2), מוודא לגדול ללא הרף כדי לפצל תאים לפי יחס של 1:4 כל 2-4 ימים.
  3. לפקח על תרביות תאים עם מיקרוסקופ אור כל יום כדי לאשר צמיחת תאים טובה, מורפולוגיה, אחרת שמומלץ להפעיל מחדש את התרבות התא או כדי להתאים את התנאים התרבות התא בהתאם.

2. תימידין סינכרון ומעגל Lytic

  1. ב 10 ס"מ פטרי, צלחת התאים TREx-K-Rta BCBL-1 בלהתמחויות מדיה (1 x 106 תאים/2 מ"ל של מדיה)
  2. להוסיף 200 מ"מ תימידין (הריכוז הסופי: 2 מ מ) למנה, לערבב, תקופת דגירה של 18 h.
  3. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת המוכנים באופן טרי. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת המוכנים באופן טרי.
  4. מאפשרים לתאים exit שלב S עבור 8 שעות.
  5. להוסיף תימידין (הריכוז הסופי: 2 מ מ), לערבב, תקופת דגירה של 16 h.
  6. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת המוכנים באופן טרי. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת המוכנים באופן טרי.
  7. לזירוז ויראלי הפעלה מחדש, להוסיף 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, הריכוז הסופי 20 ng/mL) ו דוקסיציקלין (DOX, ריכוז סופי 100 ננוגרם למ"ל) התרבות תאים, לערבב, דגירה במשך 4 שעות. עבור שורות תאים ללא קלטת inducible K-Rta, לעורר הפעלה מחדש באמצעות TPA (ריכוז סופי 20 ng/mL, נתרן butyrate (1 מ מ)).
  8. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת תרבות שלמה. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת תרבות שלמה.
  9. מאפשרים לתאים לגדול במשך 24 שעות ביממה.

3. קיבוע ו- Permeabilization

הערה: לפני שתמשיך, ודא תיקון פתרון (פורמלדהיד 3.7% ב- PBS שטופלו DEPC), diethyl שטופלו pyrocarbonate באגירה פוספט תמיסת מלח (DEPC-PBS), גליצין DEPC PBS (הריכוז הסופי של גליצין: 100 מ מ) permeabilizating הפתרון (50% אצטון, 50% מתנול) מוכנים. בדרך כלל, כל שקופית לדרוש לפחות 0.5 מיליון תאים, להכפיל במידת הצורך, כוללות תאים נוסף בחזרה למעלה, במיוחד אם התאים אינם בריאים.

  1. איסוף תאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  2. Centrifuge התאים למשך 2 דקות ב 200 x ג' שטיפת התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS DEPC סטרילי. Resuspend ב 1.2 מ של DEPC PBS.
  3. למקם את המספר המתאים של coverslips (שנקבע על ידי התקנה ניסיונית) שהסוליות של צלחת 6-. טוב.
  4. פיפטה 200 µL של התא DEPC PBS התערובת על כל coverslip, להבטיח כי לפחות 0.5 מיליון תאים בכל שקופית. לאפשר את התאים להתיישב למשך 2 דקות, תשאף עודף PBS DEPC עוזב רק שכבה דקה של תאים. זה נורמלי עבור תאים יוסרו בתהליך זה.
    התראה: PFA רעיל, לענוד הגנה הולמת.
  5. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של תיקון לפתרון כל תגית כיסוי (3.7% פורמלדהיד ב- DEPC PBS). לאפשר את התאים לתקן 10 דקות.
  6. רחץ coverslips 3 פעמים עם DEPC PBS.
  7. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של גליצין DEPC PBS (הריכוז הסופי של גליצין: 100 מ מ) להתחמק כל כיסוי. מאפשרים לתאים להרוות במשך 5 דקות.
  8. להוסיף 1.5 mL DEPC PBS ומקום גם על מטרף במשך 5 דקות או לנער בחוזקה אך בעדינות ביד 1 מינימלית לשאוב PBS עודף DEPC. יש להיזהר לא לשבש את התאים. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 מנקי.
  9. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של permeabilizing פתרון (אצטון 50%, 50% מתנול) להתחמק כל כיסוי. מאפשרים לתאים permeabilize למשך 15 דקות.
    הערה: בשלב זה, coverslips ניתן לאחסן במקפיא-20 ° C לא יותר משבוע. הימנע הקפאה או למזער את הזמן בילה בפריזר כמו איכות התמונה עלולות לפגום במהירות. ודא כי כאשר במקפיא שנותרו התאים רטוב ומכוסה ב מתנול/אצטון, וכדי להבטיח כי הם כראוי נתרענן עם DEPC PBS לאחר הסרת מהמקפיא.
  10. להוסיף 1.5 mL DEPC PBS ומקום גם על מטרף במשך 5 דקות או ללחוץ בחוזקה אך בעדינות ביד עבור מינימלית 1 מחוק לגמרי מגניב DEPC עודף, להיזהר שלא לשבש את התאים. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 מנקי.

4. IFA, RNA-דגים

הערה: לגבי תיוג RNA דגים בדיקה והכנת: עבור ה K-Rta אינטרון 959 בסיסי זוגות, 31 הגששים שונים היו שנוצר זה היו 20 בסיסי זוגות כל אחת, המכילה GC תוכן כ-50%. פתרונות עבודה מלאי הגששים היו aliquoted לתוך 100 מיקרומטר וריכוזי 2.5 מיקרומטר, בהתאמה.

  1. תווית שקופיות מיקרוסקופ עם המידע הנחוץ ניסויית או סוג של תווית ניתן להבחנה.
  2. הקו התחתון של מיכל פלסטיק sealable במגבת נייר לחה.
  3. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני (µL 1.5 של נוגדן לאנה, µL 0.75 של נוגדן RNA Pol II, µL 3 של בייקר שמרים tRNA, PBS DEPC עד 30 µL), להכפיל את המתכון לכל coverslip הנוכחי. מקום 30 µL של פתרון נוגדן ראשוני על גבי כל תוויות שקופיות מיקרוסקופ.
    1. Titrate הנוגדן הראשי עניין קודם ולהשתמש הכמות האופטימלית. הקפד להשתמש IgG מטוהרים, כמו סרום (נוזל מיימת) עשוי להכיל כמות גדולה של RNase.
  4. מניחים את coverslip (תאים מול הפתרון) על גבי שקופיות מיקרוסקופ שכותרתו ולהעביר את השקופיות לתוך המיכל עם מגבת נייר לחה. יש להיזהר לא להציג בועות. לכסות את החלק החיצוני של המכולה בניילון נצמד. להזיז את המיכל לתוך אינקובטור מוגדר כ- 37 מעלות לשעה.
  5. להכין מאגר שטיפת הדגים (2 x מלוחים סודיום ציטרט מאגר (האס) (גמר), 10% formamide, 90% DEPC dH2O).
  6. להכין 2 x הכלאה מאגר (4 x SSC, 20% לתוספי סולפט).
  7. להכין נוגדן משני ומאגר בדיקה דגים אינטרון (20 µL של 2 x הכלאה מאגר (סופי 1 x Hyb מאגר), 4 µL של בייקר של שמרים tRNA (האחרון 10%), 4 µL של formamide (10% הסופי), בדיקה אינטרון K-Rta (125 הסופי nM), 0.8 µg של נוגדנים משניים, DEPC dH2 O עד 40 µL). להכפיל את המתכון בכל השקופיות הדרוש.
  8. לאחר דגירה, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS DEPC בצלחת טוב 6 למשך 5 דקות.
  9. לשטוף עם דגים מאגר שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות. לשמור coverslip במאגר שטיפת הדגים עד סיום הכנת תערובת של שנית בדיקה נוגדן ואינטרון (שלב 4.7).
  10. שקופיות זכוכית נקי המשמש נוגדן ראשוני דגירה של הכלאה.
  11. במקום 40 µL של נוגדנים משניים, בדיקה אינטרון דגים המכיל פתרון על גבי כל שקופית מזכוכית.
  12. מניחים את coverslips עם התאים על השקופיות עם הצד תא כלפי מטה על המאגר, להיות להיזהר לא כדי להציג בועות.
  13. מניחים את השקופיות לתוך מיכל פלסטיק במגבת נייר לחה על התחתון. לעטוף את מיכל פלסטיק ניילון נצמד הראשון ולאחר מכן רדיד אלומיניום.
  14. דגירה המכולה עם השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
  15. לאחר דגירה, בזהירות להחליק את coverslip מהקצה של השקופית זכוכית, תחזיר את 6 לוחות טוב כלפי מעלה ו לשטוף תאים עם שטיפת הדגים מאגר 3 פעמים בצלחת טוב 6 למשך 5 דקות.
  16. לשטוף את התאים פי 2 עם 2 x SSC.
  17. בוזקים דאפי (1:1, 000) 2 x SSC מאפשרים לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  18. לשטוף את התאים פי 2 עם 2 x SSC.
  19. לנקות את השקופיות זכוכית המשמש הכלאה, ולהוסיף 10 µL של הרכבה פתרון על השקופיות זכוכית.
  20. במקום coverslips עם הפנים כלפי מטה על גבי הפתרון הרכבה. יש להיזהר לא להציג בועות.
  21. עם טישו מעבדה, להסיר בעדינות את הפתרון הרכבה עודף, נזהר שלא למעוך את התאים.
  22. באמצעות לק, להחיל על שכבה בשפע סביב קצה coverslips, אפשר להתייבש.
  23. המשך לבצע פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

5. 3D פלורסצנטיות מיקרוסקופ

הערה: בזמן, פרוטוקולים שונים עם הסוג של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מערכת המשמשת השלבים הבאים תסייע כדי להבטיח הרכישה של נתוני תמונה אופטימלית עבור ניתוח כמותי.

  1. Pretreat דגימות קבוע והר בתקשורת האנטי-עמעום לעכב זריחה photobleaching במהלך דימות.
  2. השתמש מטרה באיכות גבוהה (כגון 60 X 1.42 N.A שמן-טבילה עדשה), אשר ניתן ללכוד כל תא (או גרעין התא) השדה-of-view.
  3. הגדר פרמטרים חשיפה (כגון, עירור כוח, זמן החשיפה) עבור כל אחד מערוצי הצבע פלורסצנטיות, באמצעות דגימות חיובי-שלילי-שליטה. לרכוש תמונות זריחה.
    הערה: דגימות בקרה חיובית המכילים תווית פלורסנט אחת בלבד צריך לשמש גם כדי לקבוע את מידת "crosstalk" בין ערוצי הצבע. עבור דגימות תאים קבוע הדמיה, כוח עירור קרינה פלואורסצנטית יכול להיות מופחת (עם מעט יותר פעמים חשיפה) כדי למזער את photobleaching.
  4. ברגע פרוטוקול הדמיה הקימה, לתחזק באותם פרמטרים חשיפה קבועה עבור כל דוגמאות במחקר — כך יכול להיות מנותח, בהשוואה במדויק נתוני תמונה.
  5. לבצע עיבוד שלאחר רכישת תמונה ושחזור תלת-ממד. לזהות את התמלילים K-Rta על ידי אות ה-RNA-דג (אדום), לאנה מולקולות על ידי immunofluorescence (ירוק), הגרעין כרומטין (במקרים המתאימים) צבעונית עם דאפי (כחול).
    הערה: אזורים של גרעין התא, שבה K-Rta ולאנה הם שיתוף באשכולות, הם ולכן האמינו להיות מזוהה עם מפעלי שעתוק ויראלי ושכפול מורכבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול מעט המקוצרת בוצעה שבו תאים BCBL-1 שימשו, רק לאנה הרנ"א K-Rta היו מוכתמים (איור 1). הניסוי הזה מאפשר לנו לבחון היכן פעיל תעתיק episomes ויראלי והטרוגניות את התגובה לגירויים הפעלה מחדש KSHV בקרב אוכלוסיה של תאים. בתא שמציין החץ באיור1, ברורים K-Rta באזורים מתאימים במדויק את חלוקת episomes ויראלי (מסומן עם לנה) הוא ראיה שעתוק פעיל המתרחשים בקרבת KSHV הגנום. במדגם זהה, תאים כמו האחד המסומן באמצעות החץ באיור 1 יכול להיות שנצפו, אשר מוצג יותר ויותר ' מאטום לשקוף ' K-Rta פלורסצנטיות שאינו חופף באופן משמעותי עם לאנה. זה ממחיש את הממצא כללי כי בתוך אוכלוסייה של תאים יש וריאציה ניכר מידת התגובה לגירויים הפעלה מחדש.

Figure 1
איור 1: להמחיש שעתוק פעיל של נגיפי episomes. IFA ודגים RNA בוצעה על תאים BCBL-1. התאים BCBL-1 לא היו מסונכרנים אבל שטופלו butyrate TPA ו נתרן עבור 4 h לאנה באמצעות immunostaining, הגנום הנגיפי היו דמיינו בירוק, בעוד ה-RNA-דג בוצע פילוח K-Rta אינטרונים כדי ממוקם שעתוק פעיל באדום. כרומטין הסלולר היה מוכתם פוסט קיבוע ו- permeabilization עם דאפי. K-Rta אינטרון וכתמים לאנה מוזגו יחדיו. מצביע החץ מלא תא יש מלא מחדש ויוצרים הוא VTFs. בעוד ראש החץ המכוון לעבר תא רק מתחיל להפעיל מחדש, כפי שהוצע על ידי האות K-Rta חלש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הבא האפקטיביות של תימידין סינכרון נבדק על ידי להמחיש את הביטוי של חלבון נגיפי K-Rta (איור 2). אחרי בלוק תימידין זוגי בוצע כדי לסנכרן TREX BCBL-1 תאים על שלב המעבר G1/S, פרוטוקול שתואר קודם לכן בוצע (ללא RNAPII ולאנה מכתים). על ידי בחינת ההכתמה K-Rta, זה עולה בבירור כי תאים מסונכרן הגיבו יותר לגירויים הפעלה מחדש מאשר באוכלוסיה שאינו מסונכרן. ממחקרים קודמים שנערכו במעבדה Izumiya (נתונים לא מוצג), זה אומתה כי RNAPII גם colocalizes בתדירות גבוהה יותר עם K-Rta לאחר הסינכרון מחזור התא.

Figure 2
איור 2: יעילות תימידין. RNA-דג בוצעה על תאים TREX K-Rta BCBL-1. התאים (שמציין "2 x את" כותרת) סונכרנו עם בלוק תימידין כפול. שתי האוכלוסיות תא שאינו מסונכרן ומסונכרן טופלו TPA ו DOX עבור 4 h. K-Rta אינטרונים היו hybridized RNA דגים הגששים. תאים שהם אדום בהיר אחיד הן לא overexpressing K-Rta, במקום זאת הם מתים, חוקיותו עם דאפי מכתים (לא ראה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בתור הערה כללית, חשוב מאוד כתם תאים עם דאפי בעת ביצוע פרוטוקול זה. ניתן לזהות תאים Apototic בקלות על-ידי פיצול גרעיני blebbing. בהתחשב אינדוקציה כבד גירויים ושיטות תרבות תא כללית, מקובל עבור כמה תאים מתים שיראו. חשוב תמיד כתם עם דאפי כשיטה הראשית כדי להבחין בין תאים חיים וגם מתים. לפעמים נוגדנים או RNA הגששים נתפס בתאים אפופטוטיים להיפגע ולייצר אותות, ולכן חשוב לשלול תאים אלה ניתוחים. דאפי מכתים יכול לשמש מספר פונקציות נוספות, לדוגמה באיור 3, זה ברור כי האובייקט שמציין החץ הוא למעשה שלושה תאים נפרד במקום אחד.

חשוב לציין כי הדימויים המוצגים באיור 3 , איור 4 היו deconvolved ובכך ליצור תבנית יותר punctate. על ידי בחינת הכתם RNAPII, ההבדל בין התאים שמציין החץ, ניתן לראות את התאים המקיפים אחרים. ראוי להזכיר כי האות RNAPII בולט הרבה יותר מהרגיל עקב deconvolution.

באמצעות מיקרוסקופ תלת-ממד לצד טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור את היחסים המרחביים בין RNAPII, לאנה K-Rta. לדוגמה, באיור 4, ניתן לראות מבנים RNAPII טבעתי עם הגנום KSHV מנוקד בפריפריה. באופן כללי, לאנה colocalizes בדרך כלל עם RNAPII בתאים בפיתוח מפעלי שעתוק. עם זאת, לא כל הנקודות לאנה colocalize עם RNAPII, מחקרים כולל את 4 מימדth (זמן) יהיה צורך להבהיר את פנוטיפ. חשוב להוסיף כי הנקודות לאנה כמה זה לא colocalize עם K-Rta אותות מייצגים את הטרוגניות episomal בתגובה לגירויים הפעלה מחדש אפילו בתוך תא בודד (איור 4).

Figure 3
איור 3: בשילוב IFA ואינטרון RNA-דג- IFA ודגים RNA בוצעה על תאים TREX K-Rta BCBL-1. הגנום הנגיפי שהו עם immunostaining של לאנה (ירוק), פעיל שעתוק היה דמיינו RNA-דג של אזור אינטרון K-Rta mRNA (צהוב), קהילות RNAPII (אדום) הודבקו תוויות עם IFA, התאים סוף סוף היו מוכתמים באמצעות דאפי לתמונה דנ א (כחול). TREx K-RTA BCBL-1 תאים סונכרנו באמצעות בלוק תימידין כפול, ואז תאים הופעלו באמצעות דגירה עם TPA ו DOX במשך 4 שעות, 24 שעות לאחר מכן התאים תוקנו, permeabilized, והכינו עוד יותר עבור הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: 3D להדמיה של מפעלי שעתוק ויראלי. אינטרון RNA-דגים באמצעות K-Rta אינטרון רגשים (תכלת), immunostaining של RNAPII (אדום) לאנה (ירוק), ואת אן דאפי מכתים (כחול כהה). Deconvolved 3עיבוד במחסנית Z נלקח על המיקרוסקופ, מעובד, נבנה על תוכנת הדמיה המסחרי (ראה את הטבלה של חומרים). TREx K-Rta BCBL-1 תאים תימידין זוגי מסונכרנים, ואז שטופלו TPA ו DOX עבור תאים 4 h עובדו 28 h לאחר הפעלה מחדש היה מגורה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם כמה היבטים של פרוטוקול זה יכול להשתנות כדי להכיל את נסיבות יוצאות דופן. הבחירה של מאגרי קיבעון, permeabilization יכול גם להשתנות. למאגרי קיבעון, paraformaldehyde גם יעיל, אתנול יכול לשמש permeabilization.

להרוות את הפורמלדהיד עם גליצין ש-PBS מומלצת היא מונעת פורמלדהיד הפיכת הנוגדנים בהעדר אלבומין שור (BSA), אך אם coverslips נשטפים ביסודיות מספיק, ניתן לדלג לשלב PBS גליצין. בפרוטוקול, הימנע משימוש שור אלבומין כפתרון חסימה. לימודי טייס שנערך במעבדה Izumiya הראתה אותות RNA-דג חלש יותר, ככל הנראה בשל RNA השפלה. אם נדרש לבצע חסימה עבור נוגדן ראשוני, מומלץ להשתמש RNase BSA חינם. מ מניסיון העבר זה היה שם לב אם הנוגדן ספציפי, הכללת BSA אין צורך בהתגובה. עם זאת, מומלץ לכלול תמיד כמות עודפת של שמרים tRNA, דגירה כל הצעדים כדי למנוע השפלה RNA. כבר הבחין כי באמצעות tRNA כמו חסימת הסוכן מוגבר אותות ה-RNA-דגים מסוימים.

מחזור התא סינכרון יושם לייצר הפעלה מחדש KSHV יותר יעיל, סינכרונית. עבור סינכרון מחזור התא, הרעבה הידרוקסיוראה או סרום ייתכן גישות אלטרנטיביות. זה אומת שהידרוקסיוראה הזה הוא יעיל כמו באמצעות בלוק תימידין, למרות הדגירה עם הידרוקסיוראה לבד מקים KSHV חלש.

איך טכניקה זו ניתן להחיל על מחקרים אחרים? בפרסום האחרון של המעבדה Izumiya, זה הוצג את colocalization של פעיל תעתיק KSHV episomes ו- RNA pol II, אנזים חיוני עבור שעתוק RNA. עם זאת, ידוע כי ישנם מספר של שיתוף activators, שותף repressors וגורמים תעתיק הסלולר מעורב KSHV הכונה. מבחינה היסטורית כבר בשימוש RT-PCR כמותי על אוכלוסיה (תערובת של הפעלה מחדש והן כמוס) של תאים בתרבית, לכימות תעתיקים ויראלי ולאחר הערכת ההשפעות על ביטוי הגן ויראלי. באמצעות הגישה המתוארת לעיל, ניתוח יכול להיות צימצמנו את רמת episomal יחיד לבחון שעתוק ויראלי. לפיכך, ייתכן ויסות אנזימים אחרים התאית וויראליים יכול להיבדק כדי לזכות בתובנה שיוכן KSHV הפעלה מחדש. זה גם ראוי לציין להזכיר כי בגלל אופי חולף של האזור אינטרון RNA תלויה שפלותם הגששים דגים RNA hybridize, בדרך כלל לשפה שבה שעתוק פעיל מתקיים, אולם אם אינטרונים לא מושפל . מיד, דגים רגשים יכול להציג אותות שאינם ממוקמים תמיד ליד שעתוק פעיל.

כרגע, זה קשה ללמוד את הקשר בין הקמת מפעלים הסלולר שעתוק גנים הבאים עקב שלהם גדלים גנומית והמורכבות של קביעת התצורה של היזמים הסלולר. בהקשר זה, KSHV episomes יכול להיות כלי אידיאלי בשל גודלם גנום קטן יחסית, מנגנוני הפעלה מחדש מוגדרים תצורות צבירה ברורה של RNA Pol II. באמצעות כרומוזום מיני נגיפי manipulable של KSHV, herpesvirology יכול לתרום שדה המחקר אפיגנטיקה הסלולר מזווית ייחודית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברי המאמר אין קשרים פיננסיים או מתחרים קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט (R01-DE025985) על ידי אמריקאי סרטן החברה מחקר מלומד פרס (RSG-13-383-MPC). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים החקלאות האמריקאי (2015-67015-23268 ו- 2014-67015-21787), מחקר חדש יוזמה גראנט מאוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium 1650 GlutaMAX Gibco by Life Technologies 61870-036 Needs to be warmed to 37 °C
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Inc. FB-11
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco by Life Technologies 10378-016
Thymidine  Sigma Aldrich T9250
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution Gibco by Life Technologies 14190-144
TPA Sigma Aldrich P1585
Sodium Butyrate  Sigma Aldrich B5887
Formaldehyde Solution  Sigma Aldrich 252549 Corrosive, toxic, health hazard
Diethyl Pyrocarbonate Sigma Aldrich D-5758 Acute toxicity 
Glycine Sigma Aldrich 410225
Acetone Sigma Aldrich 179124 Flammable, toxic
Methanol Fisher Chemical  67-56-1 Flammable, toxic, health hazard
Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 EMD Milipore 05-623
Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae)  Sigma Aldrich 9014-25-9
Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) Thermo Fisher Scientific  15557044
Formamide  Sigma Aldrich 295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution EMD Milipore 1916C093
DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific  D1306
slowFade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Micro cover glass 22x22 Matsunami C022221
VoloCITY 3D imaging software
DeltaVision microscope
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 131 שעתוק ויראלי במפעל KSHV הקשורים סרקומת קפוסי ההרפס שעתוק RNA פולימראז II ה-RNA-דגים שעתוק פעיל
הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. … More

Chen, C. P., Chuang, F., Izumiya, Y. Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56832, doi:10.3791/56832 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter