Summary
Protokoller for europæiske ål modning og sperm kryopræservering er blevet forbedret i de seneste år. I denne artikel beskrives den bedste protokol tilgængelige ved hjælp af humant choriongonadotropin (hCG) for inducerende modning og methanol som kryoprotektant.
Abstract
I de seneste år, har flere forskergrupper arbejdet på udvikling og forbedring af nye protokoller for den europæiske ål håndtering og modning. Som af endnu, ugentlige injektioner af humant choriongonadotropin (hCG) har vist sig for at maturate hanner efter bare 5-6 ugers behandling, producerer store mængder af høj kvalitet sperm i flere uger. Derudover har sperm kryopræservering protokoller ved hjælp af forskellige extendere, cryoprotectants og nedkøling og optøning gange været tidligere beskrevet for europæiske ål. Her, viser vi at Tanaka´s extender løsning kan anvendes direkte, for befrugtning eller til kryopræservering, gør unødvendige brugen af forskellige typer af løsninger og fortyndinger. Desuden gør brug af methanol som en kryoprotektant denne protokol nem at bruge som methanol har lav toksicitet og ikke aktivere sperm. Sæden behøver ikke at blive befrugtede umiddelbart efter tilsætning af kryoprotektant, og den kan bruges længe efter at blive optøet. Derudover er sædkvalitet stadig høj efter optøning selv om det er lavere end frisk sæd. Formålet med dette arbejde er at vise den bedste tilgængelige protokol for europæisk ål, håndtering, modning og sperm kryopræservering.
Introduction
I de sidste 25 år, er antallet af europæiske ål (Anguilla anguilla) ankommer til den europæiske kyst faldet støt med 90% 1,2,3. Der er flere faktorer, der forklarer dette drastiske fald herunder forurening, infektioner, overfiskeri og levesteder ødelæggelse. Alt dette har haft en dybtgående indvirkning på denne art, fører til inddragelse af den europæiske ål på den internationale Union for bevarelse af naturen (IUCN) liste som kritisk truede 4. Udviklingen af teknikker og protokoller til reproduktion i fangenskab er derfor nødvendig.
Modning af den europæiske ål i fangenskab er opnået ved hormonbehandling 5,6,7 , men produktionen af mælke hos begge køn er vanskeligt at synkronisere 8. Selv om udviklingen af nye androgen implantater har vist sig for at accelerere oogenesen i ål 9,er10, timingen af endelige modning hos kvinder stadig meget variable og svær at styre 11. Kortvarig oplagring af sperm 12,13,14 og kryopræservering teknikker er derfor nødvendige for reproduktion forvaltning, hvilket gør gamet synkronisering unødvendige 8.
Kryopræservering af europæiske ål sæd er blevet udviklet siden 2003 15,16. Flere forskere designet vellykket protokoller ved hjælp af enten dimethylsulfoxid (DMSO) eller methanol som cryoprotectants 16,17,18,19,20. Selv om begge protokoller er blevet anvendt, er opnåede cellernes levedygtighed af optøet sæd befrugtede med DMSO lavere end med methanol 20,21. Desuden ål sæd er aktiveret på kontakt med DMSO og kræver mere kedelig sperm manipulation 19, methanol er derfor en mere passende kryoprotektant for europæiske ål sperm end DMSO.
Her, vil være beskrevne protokol til optimal håndtering og hormonel behandling af den europæiske ål. Ud over dette, den bedste europæiske ål sperm kryopræservering protokol bruger methanol som en kryoprotektant og en protokol for vurdering af sædkvalitet i denne art bliver også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer til at arbejde med europæiske ål i denne protokol beskrevne blev godkendt af det udvalg af etik af dyr eksperimenter på Universitat Politècnica de Valencia, efter de spanske love og regler kontrollerende eksperimenter og procedurer på levende dyr.
1. fisk vedligeholdelse
- Bringe de europæiske ål til et forskningsanlæg og læg dem i en 200 L akvarier med et recirkulation system. Brug termostater og kølere til at opretholde en konstant 20 ° C temperatur.
- Holde fiskene i mørke omgivelser at undgå stress22 og med ingen mad under eksperimentet.
- Holde fiskene i frisk vand i løbet af de første 3 dage. Derefter ændre 1/3 af vandet og refill med havvand hver anden dag indtil nå en saltholdighed på 37.0 ± 0,3 g/L.
2. hormonel behandling
Bemærk: Den hormonel behandling består af ugentlige injektioner af humant choriongonadotropin (hCG) hele eksperimentet hele løbetid (ni uger).
- Forberede hCG hormonet i forvejen i en koncentration på 1 IU/µL ved fortynding af hormon i saltopløsning (0,9% NaCl).
Bemærk: Hormonet kan bevares fortyndet ved denne koncentration for over en uge på – 18 ° C. - For at anesthetize fisk, forberede en 40 L fleksible spand med 5 L system vand.
- I en 250 mL målekolbe fortyndes 300 mg af benzocain i 100 mL 70% ethanol.
- Hæld den fortyndede benzocain i spanden (slutkoncentration 0,36 mM) og bland ordentligt. Dette er for en endelige benzocain koncentration af 60 mg/L.
- Overføre fisk, individuelt, i vandet med benzocain og vent et par sekunder, indtil benzocain træder i kraft og fiskene er korrekt bedøvede.
Bemærk: For at bekræfte, at fisken er bedøvede, læg fisken i en liggende stilling og kontrollere, at den forbliver stadig i denne stilling.
- For at administrere hormonet, vejer fisken og forberede hCG hormonet i en dosis på 1,5 I.E. pr. g fisk i en 1,5 mL plastikrør.
- Fyld en 1 mL sprøjte med hCG hormon fra den plastikrør.
- Placer den bedøvede fisk i liggende stilling og med bistand eller sprøjten, injicere hormon omhyggeligt i området intraperitoneal.
- Returnere fisk i akvarier og overvåge det indtil fuldt tilbagebetalt.
Bemærk: Den hormonelle administration har gennemføres ugentligt gennem hele eksperimentet. Normalt, starte europæiske ål spermating efter 6-7 uger af hormonel behandling.
3. sperm prøveudtagning
- For at opnå de bedste kvalitet prøver, udtrække sperm 24 h efter hormonelle administration6,23.
- Bedøver fisk med benzocain, som beskrevet i trin 2.2.
- Placere den bedøvede fisk i liggende stilling, rense det genitale område med en sprøjte af destilleret vand og tør grundigt med papir, at undgå afføring kontaminering til stede i kønsdelene eller utilsigtet sperm aktivering ved kontakt med havvand fra akvarier.
- Placere fingrene på begge laterale sider af fisken, massage forsigtigt at trykke på lateralt fra brystfinner til det genitale område at tvinge sæd ud.
- Gentag massage, indtil nogen mere sæd kommer ud fra den genitale åbning.
- Indsamle sæden ind i 15 mL plastik rør ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Fortyndes de udpakkede sæd 1:10 i modificerede Tanaka´s extender løsning24 (137 mM NaCl, 76.2 mM NaHCO3, i destilleret vand) på 4 ºC.
Bemærk: Sæd i extender løsning bør fastholdes på 4 ºC.
4. sperm kvalitetsevaluering
- Forberede kunstigt havvand13 (i mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, i destilleret vand) med 2% bovint serumalbumin (BSA) (w:v), justere pH til 8.2, osmolalitet til 1100 mOsm/kg og vedligeholde det ved 4 ºC at undgå bakterievækst.
- Åbn softwaren til computer-assisteret sædanalyse (CASA) og vælg modulet fisk sperm.
- Klik på Egenskaber for at åbne Systemopsætning af softwaren. Der, indstille indstillingerne opsamling på 60 billeder pr. sekund. Vælg negative fase optik, Makler kammer og 10 X skala.
- Derefter på analyse værdier, vælge fisk som arter og partikler område større end 2 µm2 og mindre end 20 µm2.
- På parametrene hastighed sat til langsom når celler flytte mellem 10 og 45 µm/s, angivet til mellem , når du flytter mellem 45 og 100 µm/s og sat til hurtig når bevæger sig hurtigere end 100 µm/s.
Bemærk: Sædcellerne med velocity langsommere end 10 µm/s ansås immotile. - Vælg de progressive værdier som 80% af rethed (STR) og gemme egenskaberne.
- Klik på Fange felt (et vindue med live billeder fra kameraet vil blive åbnet).
Bemærk: Computer-assisteret sperm analysesystem er dannet af et mikroskop, et kamera og en billede analyse software.
- På den tælle kammer, læg 4 µL af kunstigt havvand og tilsæt 0,5 µL af sperm løsning (sperm fortyndet i extender løsning).
- Fokusere billedet med mikroskop ved 10 X forstørrelse i den negative fase. 15 s efter aktivering, klik på Capture - fra video i computer-assisteret sperm analyse software.
- Analysere hver stikprøve i tredobbelt og vælg prøver med en højere end 70% for kryopræservering motilitet.
Bemærk: Det er meget vigtigt at vælge kun høj kvalitet sæd til succes i denne kryopræservering protokol.
5. sperm indefrysning metode
- Forberede på forhånd flydende kvælstof (ca 2,5 L) i en 34 cm x 34 cm x 30 cm og 5 cm tyk Styrofoam boks.
Bemærk: Fastholde et flydende kvælstof i 4-5 cm højde på alle tidspunkter.- Opbygge en flydende struktur for at fryse præ sæden. Bruge 2 stykker polystyren (20 cm x 5 cm), binde dem med 2 plasticrør, og placere strukturen på de flydende kvælstof. Denne struktur skal flyde over den flydende kvælstof i en omtrentlige højde på 3 cm over overfladen (figur 1).
Figur 1 . Skematisk tegning af den flydende struktur, der bruges til pre nedfrysning over flydende nitrogen. Strukturen består af to stykker af lav befolkningstæthed Styrofoam 20 cm x 4 cm x 5 cm forbundet med plasticrør på 14 cm. Strå er placeret over plasticrør på 3 cm over de flydende kvælstof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Forberede kryopræservering løsning ved at blande sperm, extender løsning og methanol i forholdet 1:8:1 i 1,5 mL plastik rør og rør forsigtigt.
- Ved hjælp af en pipette, tilføje 480 µL af opløsningen kryopræservering i de 500 µL sugerør og eventuelt markere dem ved at lukke ene ende med modellering ler.
- Sætte strået på den flydende enhed i en højde på 3 cm over de flydende kvælstof til 3 min. Anbring halmen til den flydende kvælstof.
- Efter 10-15 min, overføre strå i en flydende kvælstof lagertank ved hjælp af lange pincet og holde dem neddykket i flydende nitrogen på alle tidspunkter. Her, kan sæden gemmes på ubestemt tid.
6. optøning metode
- Forberede en Styrofoam boks med flydende kvælstof, som beskrevet i trin 5.1, og forberede et vandbad ved hjælp af en 3 L bægerglas med vand fra hanen på 40 ºC.
- Overføre sugerør med frossen sæd fra lagertanken i boksen Styrofoam med flydende kvælstof ved hjælp af lange pincet.
- Sætte hvert strå i et vandbad på 40 ºC for 13 s.
- Hæld sædceller i en 1,5 mL plastikrør ved at skære de lukkede ender af strå med en saks.
- Analysere sædkvalitet ved hjælp af computer-assisteret sperm analysesystem, som forklaret i trin 4.1.
- Holde 100 µL af sæd til at analysere levedygtigheden af sædcellerne med et flow Flowcytometret.
7. flowcytometri
- Bruge en fluorescerende kit indeholdende propidium Iodid (PI), som er rødt fluorescerende stof der pletter kerner af døde celler og en membran-permeant nukleare fluorescerende stof, at grønne pletter kerner af levende celler.
- Forberede grøn fluorescerende Farvningsopløsningen ved at fortynde det fra stamopløsningen (1 mM) 1:10 i Tanaka´s medium til en brugsopløsning af 100 µM.
- Ikke fortyndes PI løsning. Stamopløsningen er på 2,4 mM.
- For hver prøve, tage 50 µL af friske eller optøet sæd og tilføje 0,5 µL af grøn fluorescerende farvning brugsopløsning (slutkoncentration 1 µM) og 2 µL af PI løsning (slutkoncentration 100 µM).
- Inkuber prøver indeholdende farvestoffer (PI og grønt fluorescerende farvning) i mørke i 5 min.
- Fortynd prøver i 500 µL af Tanaka´s extender løsning og analysere med flow-Flowcytometret.
- Tænd for strømmen forskellige og oprette en ny protokol, der indeholder mindst 2 parceller: SS log vs FS log og FL1 vs FL3.
Bemærk: Begge, grøn fluorescerende farvning og propidium Iodid kan være glade med synlige bølgelængde lys. Hvornår bundet til DNA, maksimale fluorescens emission af disse farvestoffer er 516 nm og 617 nm, henholdsvis.- Justere spændinger i de forskellige lasere: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Oprette erhvervelse indstillinger accord maksimale begivenheder = 5000 eller 15 s (slutkoncentration af prøven bør være omkring 1 millioner af celler/mL). Læse prøven ved hjælp af en lav -flow.
- Vælg læsetilstand enkelt rør fast holdning tilstand.
- Læg prøven i det rigtige antal karrusel
- Læse prøven (ved at trykke på F9) og gemmer de data, der indsamles til en excel-fil (trykke på F7) for yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sæd fra 18 ål med en sædkvalitet på 70% eller derover, blev udvalgt til denne undersøgelse. Resultaterne viste en reduktion i alle parametre efter optøning sammenlignet med dem fra frisk sæd (tabel 1 og figur 2). Motilitet resultater (betyde ± S.E.M., n = 18) viste en højere total motilitet og en progressiv motilitet i frisk sæd end den samlede motilitet og progressive motilitet fundet i prøverne, efter optøning sperm.
Samme mønster konstateredes i analysen af hurtig sædceller, hvor optøede prøver præsenteret et lavere forhold på hurtig celler end friske prøver. Derudover blev sædcelle hastigheder måles også reduceret i de efter optøningen prøver.
Resultaterne viste også, at cellernes levedygtighed efter optøning præsenterede en begrænsning i levende sædceller i 23 ± 3,1% (mener ± S.E.M., n = 18) fra frisk til optøede prøver (tabel 1 og figur 2).
Figur 2 . Motilitet, krum hastighed og celle levedygtighed data af frisk sæd og optøet sæd (efter kryopræservering). Sæden var befrugtede i 24 timer før at blive optøet. Værdier præsenteret er middel ± S.E.M. af sæd fra 18 prøver. Stjerner angiver betydelige forskelle mellem optøede og friske prøver (t-test, p < 0,05). Parameter motilitet angivet procentdelen af total motile sædceller, krum hastighed angivet den gennemsnitlige hastighed af sædcellerne langs en krum bane, og cellernes levedygtighed angivet procentdelen af levende sædceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Hurtig + medium celler1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 27,5 ± 2.1* |
| Krum hastighed (VCL; µm/s) | 118.8 ± 2,8 | 101.5 ± 1.8* |
| Lige linje hastighed (VSL; µm/s) | 53,3 ± 1,9 | 45,6 ± 1.3* |
| Gennemsnitlige sti hastighed (VAP; µm/s) | 73.3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| Slå Kors frekvens (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0,6 |
| Cellernes levedygtighed (% af levende celler) | 97,7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Celler viser krum hastighed over 40 µm/s. | ||
Tabel 1. Sammendrag af resultaterne af de forskellige parametre, der analyseres med computerstøttet sperm analysesystem fra ferske eller optøede prøver. Optøede prøver var tidligere befrugtede i 24 timer. Alle værdier præsenteret som betyder ± S.E.M. (n = 18). Stjerner angiver betydelige forskelle mellem optøede og friske prøver (t-test, p < 0,05). De analyserede parametre var: motile sædceller defineres som procentdelen af total motile celler; progressive motilitet defineret som procentdel af sædcellerne at svømme frem i en stort set lige linje; hurtig og mellemstore celler defineres som procentdelen af sædcellerne med en gennemsnitlig krum hastighed over 40 µm/s; krum hastighed defineret som gennemsnitlige hastighed af en sædcelle gennem dens krum bane; lige linje hastighed defineret som gennemsnitlige hastighed af en sædcelle måles fra den første registrerede position til den sidste position i en lige linje; gennemsnitlige sti hastighed defineret som gennemsnitlige hastighed af en sædcelle langs dens rumlige gennemsnit bane; slå kryds frekvens defineret som den gennemsnitlige hastighed hvormed krum sperm hoved bane krydser dens gennemsnitlige sti bane; cellernes levedygtighed defineret som procentdel af levende sædceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den komplet proces for europæisk ål modning, håndtering og sperm kryopræservering. Dyrehold betingelser beskrevet her er optimal til hurtig modning og produktion af store mængder af høj kvalitet sædceller i denne arter 6,7,25. Protokollens kryopræservering og dets potentielle anvendelse for befrugtning efter optøning succes afhænger i høj grad kvaliteten af frisk sperm 26. Derfor, udvælgelse af høj kvalitet sæd er af stor betydning. Bemærk, at subjektive sperm kvalitetsevaluering afhænger af færdigheder, perception og uddannelse af den forsker, der evaluerer prøver 5,27,28 og kan føre til meget forskellige kvalitet skøn afhængig forsker 29. Brugen af computer-assisteret sædanalyse er derfor stærkt anbefales at vælge de bedste kvalitet prøver for kryopræservering.
Resultaterne af den efter optøningen sædkvalitet præsenteret her viste en reduktion i parametrene for motilitet, hastighed og celle overlevelse. Dette er i overensstemmelse med de tilgængelige bibliografi, selvom der findes stor variation mellem arter 26,30. For eksempel i en undersøgelse med laks (Salmo salar), var frisk sæd med en motilitet af 70-95% frosset ved hjælp af forskellige cryoprotectants (DMSO og methanol). Sædkvalitet efter optøning var betydeligt lavere end i friske prøver med motilitet værdier i den bedste protokol på 8,2%, men befrugtning sats bruger optøet sæd var så højt som 42,8%, som udgjorde 95% af kontrol (frisk sæd) 31. I en anden undersøgelse med sæd fra helleflynder (Hippoglossus hippoglossus), ingen signifikant reduktion i sædkvalitet blev fundet efter kryopræservering og befrugtning sats bruger optøet sæd blev over 95% 32.
I europæisk ål viste tidligere undersøgelser også en reduktion i sperm motilitet, efter kryopræservering uafhængigt af kryoprotektant brugt 16,18. Derudover har befrugtede sæd fra europæiske ål af tilsvarende kvalitet været anvendt med held for befrugtning 8. I denne undersøgelse anvendes Asturiano et al. DMSO som kryoprotektant. Brugen af DMSO har nogle manipulation ulemper, da dette kryoprotektant aktiveres sperm og derfor skal fryses umiddelbart efter tilsætning af DMSO. Også skal med optøet sæd foretages umiddelbart efter optøning. Faldet i sæd pH kan delvist løse dette problem 19, men protokollen er mere delikat end præsenteret her med methanol som kryoprotektant-protokollen.
Flere undersøgelser har vist positive resultater ved hjælp af methanol som kryoprotektant. For eksempel i en undersøgelse gennemført med japanske ål (Anguilla japonica) ved hjælp af en meget lignende protokol til den præsenteres her, med 10% methanol som kryoprotektant, befrugtede forfatterne med held æg ved hjælp af friske og befrugtede sperm. I denne undersøgelse opnået de befrugtning satser på 17% med ingen væsentlige forskelle mellem frisk og befrugtede sperm 33.
Protokollen præsenteres her har vist sig at bevare tilstrækkelige sædkvalitet efter optøning, og Vis ensartede egenskaber hvad angår sæd efter optøning end protokoller ved hjælp af forskellige extendere og cryoprotectants, men med fordelene ved nem håndtering før og efter kryopræservering. Det er meget vigtigt at følge præcist nedkøling og optøning gange beskrevet her samt bruger høj kvalitet sæd. I fremtidige undersøgelser, vil befrugtning forsøg testes ved hjælp af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne publikation blev finansieret af den Europæiske Unions Horisont 2020 forskning og innovation-programmet under tilskudsaftalen Marie Sklodowska-Curie ingen 642893 (IMPRESS), COST-kontoret (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE), og Research Center of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
