Summary
Protocollen voor Europese aal rijping en sperma cryopreservatie hebben verbeterd in de afgelopen jaar. Dit artikel beschrijft het beste protocol beschikbaar met behulp van humaan choriongonadotrofine (hCG) voor inducerende rijping en methanol als cryoprotectant.
Abstract
De laatste jaren hebben verschillende onderzoeksgroepen gewerkt aan de ontwikkeling en verbetering van nieuwe protocollen voor het hanteren van de Europese aal en rijping. Als van nog, wekelijkse injecties van humaan choriongonadotrofine (hCG) gebleken rijp mannetjes na slechts 5-6 weken van de behandeling, produceren grote hoeveelheden hoogwaardige sperma gedurende enkele weken. Daarnaast zijn sperma cryopreservatie protocollen met verschillende extenders, cryoprotectant koeling en keer ontdooien eerder beschreven voor Europese aal. Hier, laten we dat Tanaka´s extender oplossing direct gebruikt worden kan voor bevruchting of voor cryopreservatie, waardoor het gebruik van verschillende soorten oplossingen en verdunningen niet nodig. Bovendien, het gebruik van methanol als een cryoprotectant maakt dit protocol makkelijk te gebruiken zoals methanol lage toxiciteit heeft en het sperma niet wordt geactiveerd. Het sperma niet hoeft te worden cryopreserved onmiddellijk na toevoeging van de cryoprotectant, en kan het lang na wordt ontdooid worden gebruikt. Bovendien is de beweeglijkheid van de zaadcellen na het ontdooien, hoewel het is lager dan dat van vers sperma nog steeds hoog. Het doel van dit werk is om te laten zien van de beste beschikbare protocol voor Europese aal behandeling, rijping en sperma cryopreservatie.
Introduction
In de afgelopen 25 jaar, het aantal Europese aal (Anguilla anguilla) aankomen op de Europese kust met 90% 1,2,3gestaag gedaald. Er zijn verschillende factoren die deze drastische daling verklaren, met inbegrip van vervuiling, infecties, vernietiging van de habitat en overbevissing. Dit alles heeft een diepgaand effect op deze soort, wat leidt tot de opneming van de Europese aal op de Internationale Unie voor behoud van Nature (IUCN) lijst als een kritisch bedreigde 4. De ontwikkeling van technieken en protocollen voor de voortplanting in gevangenschap zijn dus noodzakelijk.
De rijping van de Europese aal in gevangenschap wordt bereikt door hormonale behandeling 5,6,7 , maar de productie van de gameten bij beide geslachten is moeilijk om te synchroniseren van 8. Hoewel de ontwikkeling van nieuwe androgeen implantaten is gebleken voor het versnellen van de oögenese in aal 9,is10, de timing van definitieve rijping in vrouwtjes nog steeds zeer variabele en moeilijk te controleren van 11. Daarom op korte termijn opslag van sperma 12,13,14 en cryopreservatie technieken zijn nodig voor het beheer van de reproductie, gameet synchronisatie geen onnodige 8maken.
Cryopreservatie van Europese aal sperma heeft ontwikkeld sinds 2003 15,16. Verschillende onderzoekers ontworpen succesvolle protocollen met dimethylsulfoxide (DMSO) of methanol als cryoprotectant 16,17,18,19,20. Hoewel beide protocollen met succes hebben ingezet, is de levensvatbaarheid van de verkregen cellen van gedooid sperma cryopreserved met DMSO lager dan met methanol 20,21. Bovendien paling zaadcellen in contact komt met DMSO is geactiveerd en vereist meer vervelend sperma manipulatie 19, methanol is daarom een geschikter cryoprotectant voor Europese aal sperma dan DMSO.
Hier, zal het protocol voor optimale behandeling en hormonale behandeling van de Europese aal hieronder worden beschreven. Naast dit, zal de beste Europese aal sperma cryopreservatie protocol gebruik van methanol als een cryoprotectant en een protocol voor de beoordeling van de kwaliteit van het sperma in deze soort ook worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor het werken met de Europese aal in dit protocol omschreven werden goedgekeurd door het Comité voor ethiek van dier experimenten op de Universitat Politècnica de València, na de Spaanse wet- en regelgeving, controle van de experimenten en procedures op levende dieren.
1. vis onderhoud
- Breng de Europese aal aan een onderzoeksinstituut en leg ze in een 200 L aquaria met een recirculatiesysteem. Thermostaten en koelers gebruiken om een temperatuur constant 20 ° C te houden.
- Houd de vis in donkere omstandigheden te voorkomen stress22 en met geen voedsel tijdens het experiment.
- Houden de vissen in zoet water gedurende de eerste 3 dagen. Vervolgens wijzigen van 1/3 van het water en vullen met zeewater om de andere dag tot het bereiken van een zoutgehalte van 37.0 ± 0,3 g/L.
2. hormonale behandeling
Opmerking: De hormonale behandeling bestaat uit wekelijkse injecties van humaan choriongonadotrofine (hCG) gedurende de hele looptijd (negen weken) van het experiment.
- Het hCG-hormoon vooraf bij een concentratie van 1 IU/µL bereid door verdunning van het hormoon in zoutoplossing (0,9% NaCl).
Opmerking: Het hormoon kan worden behouden verdund op deze concentratie voor meer dan een week bij-18 ° C. - Voorbereiden om te anesthetize de vis, een flexibele emmer van 40 L met 5 L water systeem.
- Verdun in een maatkolf van 250 mL, 300 mg benzocaïne in 100 mL 70% ethanol.
- Giet het verdunde benzocaïne in de emmer (eindconcentratie 0,36 mM) en meng goed. Dit is voor een definitieve benzocaïne concentratie van 60 mg/L.
- Pipetteer van de vis, individueel, in het water met benzocaïne en wacht een paar seconden ingedrukt totdat de benzocaïne van kracht en de vis is goed verdoofd.
Opmerking: Om te bevestigen dat de vis is verdoofd, plaats de vis in een liggende positie en controleer dat het blijft nog steeds in die positie.
- Beheren van het hormoon, wegen de vis en bereiden het hCG-hormoon bij een dosis van 1,5 IU/g vis, in een plastic buis van 1,5 mL.
- Vul een spuit van 1 mL met het hCG-hormoon uit de kunststof buis.
- Plaats de narcose vis in liggende positie en met de bijstand of de spuit, het hormoon zorgvuldig in het intraperitoneaal injecteren.
- De vis terug te keren naar de aquaria en controleren totdat volledig hersteld.
Opmerking: De hormonale administratie heeft wekelijks gedurende het gehele experiment plaatsvinden. Normaal start Europese aal spermating na 6-7 weken van de hormonale behandeling.
3. sperma bemonstering
- Voor het verkrijgen van de beste kwaliteit monsters, pak u sperma 24u na de hormonale administratie6,23.
- Anesthetize de vis met benzocaïne zoals beschreven in de stap 2.2.
- Plaats de narcose vis in liggende positie, het genitale gebied met een straal van gedestilleerd water schoon en droog zorgvuldig met papier, ontlasting om verontreiniging te vermijden voorkomt in de schaamstreek of de toevallige sperma activering door contact met zeewater uit de aquaria.
- Het plaatsen van de vingers aan beide laterale zijden van de vis, massage zorgvuldig te drukken lateraal van de borstvinnen aan de schaamstreek te dwingen het sperma uit.
- Herhaal de massage totdat geen meer sperma uit de genitale opening komt.
- Het sperma in 15 mL plastic buizen met behulp van een vacuümpomp verzamelen.
- Verdun de uitgepakte sperma 1:10 in gewijzigde Tanaka´s extender oplossing24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, in gedestilleerd water) bij 4 ° c.
Opmerking: Het sperma in de extender oplossing moeten bij 4 ° c worden gehandhaafd.
4. de evaluatie van de kwaliteit van het sperma
- Bereiden van kunstmatige zeewater13 (in mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4 CaCl2 9,9, Na2SO4 28,2, KCl 9.4, in gedestilleerd water) met 2% bovien serumalbumine (BSA) (w:v), breng de pH op 8.2, osmolaliteit tot 1100 mOsm/kg en onderhouden het bij 4 ° c om te voorkomen dat bacteriële groei.
- Open de software voor computerondersteunde sperma analyse (CASA) en selecteer de module die vis sperma.
- Klik op Eigenschappen om te openen de systeeminstellingen van de software. Er, de opname-opties instellen op 60 beelden per seconde. Selecteer negatieve fase optica, Makler kamer en 10 X schaal.
- De waarden van de analyse, Selecteer op vis soorten als gebied van de deeltjes groter dan 2 µm2 en kleiner dan 20 µm2.
- Op de snelheid parameters, ingesteld op traag wanneer cellen tussen de 10 en 45 µm/s verplaatsen, ingesteld op medium tijdens het verplaatsen tussen 45 en 100 µm/s en op snelle wanneer het bewegen sneller dan 100 µm/s.
Opmerking: Spermatozoa aanslaggevoelig langzamer dan 10 µm/s werden beschouwd als immotile. - Selecteer de progressieve waarden als 80% van de rechtheid (STR) en de eigenschappen opslaan.
- Klik op Capture veld (een venster met de live beelden van de camera wordt geopend).
Opmerking: Het computerondersteunde sperma-analyse-systeem wordt gevormd door een Microscoop, een camera en de software van de analyse van een afbeelding.
- Op de tellende vergaderzaal, zet 4 µL van kunstmatige zeewater en Voeg 0,5 µL van sperma oplossing (sperma verdund in extender oplossing).
- Focus van het beeld met de Microscoop bij 10 X vergroting in de negatieve fase. 15 s na activering, klik op Capture - van video in de computer-assisted sperma analysesoftware.
- Elke sample in drievoudige en selecteer monsters analyseren met een hoger dan 70% voor cryopreservatie beweeglijkheid.
Opmerking: Het is zeer belangrijk te kiezen voor het welslagen van dit protocol cryopreservatie alleen hoge kwaliteit sperma.
5. zaadcellen bevriezing methode
- Bereiden van tevoren vloeibare stikstof (ongeveer 2,5 L) in een 34 x 34 cm x 30 cm en 5 cm dik piepschuim vak.
Opmerking: Wordt een peil van vloeibare stikstof van 4-5 cm hoogte te allen tijde.- Het bouwen van een drijvende structuur om vooraf het bevriezen van de zaadcellen. Gebruik 2 stuks van polystyreen (20 x 5 cm), binden ze met 2 plastic buizen en de structuur te plaatsen op de vloeibare stikstof. Deze structuur moet te zweven over de vloeibare stikstof op een geschatte hoogte van 3 cm over het oppervlak (Figuur 1).
Figuur 1 . Schematische tekening van de drijvende structuur gebruikt voor vooraf bevriezing over vloeibare stikstof. De structuur bestaat uit twee stukken van lage dichtheid Styrofoam 20 cm x 4 cm x 5 cm die verband houden met plastic buizen van 14 cm. De rietjes zijn geplaatst over de plastic buizen op 3 cm over de vloeibare stikstof. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Bereid de cryopreservatie-oplossing door het mengen van sperma, extender oplossing en methanol in verhouding van 1:8:1 in 1,5 mL kunststof buizen en roer voorzichtig.
- Met behulp van een precisiepipet, voeg 480 µL van de cryopreservatie oplossing in de 500 µL rietjes en markeer deze eventueel door het sluiten van één eind met modellering van klei.
- Zet het stro op de drijvende inrichting op een hoogte van 3 cm over de vloeibare stikstof voor 3 min. Plaats vervolgens het stro in de vloeibare stikstof.
- Na 10-15 minuten, breng de rietjes in een opslagtank van de vloeibare stikstof met lange pincet en houd ze ondergedompeld in vloeibare stikstof te allen tijde. Hier, kunnen het sperma voor onbepaalde tijd worden opgeslagen.
6. ontdooien methode
- Bereiden van een piepschuim doos met vloeibare stikstof, zoals beschreven in stap 5.1 en bereiden een waterbad een bekerglas van 3 L met leidingwater bij 40 ºC.
- Breng de rietjes met ingevroren sperma uit de opslagtank in het piepschuim vak met vloeibare stikstof met lange pincet.
- Zet elke stro in een waterbad bij 40 ºC voor 13 s.
- Giet het sperma in een 1,5 mL plastic buis door het snijden van de gesloten uiteinden van het stro met een schaar.
- Analyseren met behulp van computer-assisted sperma analysesysteem zoals beschreven in de stap 4.1 de beweeglijkheid van de zaadcellen.
- Houd 100 µL van zaadcellen voor het analyseren van de levensvatbaarheid van spermacellen met een stroom-cytometer.
7. Stroom Cytometry
- Gebruik een fluorescerende kit met propidium jodide (PI), dat is een rode fluorescerende stof die vlekken van de kernen van dode cellen, en een omheind gebied membraan-permeant nucleaire TL, dat groen kleurt de kernen van levende cellen.
- Bereid de groen fluorescente kleurstofoplossing door het van de stockoplossing (1 mM) 1:10 in Tanaka´s medium verdunnen om een werkoplossing van 100 µM.
- De PI-oplossing niet worden verdund. De stockoplossing wordt bij 2.4 mM.
- Voor elk monster, neem 50 µL van verse of ontdooide sperma en Voeg 0,5 µL van groen fluorescent kleuring van de werkoplossing (eindconcentratie 1 µM) en 2 µL van PI oplossing (eindconcentratie 100 µM).
- Incubeer de monsters met de kleurstoffen (PI en groene fluorescerende vlekken) in het donker gedurende 5 minuten.
- Verdun de monsters in 500 µL van Tanaka´s extender oplossing en analyseren met de stroom cytometer.
- Inschakelen van de stroom cytometer en maken van een nieuw protocol met ten minste 2 percelen: SS log vs FS log en FL1 vs FL3.
Opmerking: Beide, groen fluorescent kleuring en propidium jodide kan worden opgewekt met zichtbaar-golflengte licht. Wanneer gebonden aan DNA, de maximale fluorescentie-uitstoot van deze kleurstoffen zijn 516 nm en 617 nm, respectievelijk.- Aanpassen van de spanningen van de verschillende lasers: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Instellen van de overname-instellingen accord op maximale gebeurtenissen = 5000 of 15 s (de uiteindelijke concentratie van het monster moet ongeveer 1 miljoen cellen/ml). Lees het monster met behulp van een LOW -flow.
- Selecteer de leesmodus één buis vaste positiemodus.
- Zet het monster in het juiste aantal de carrousel
- Lees het monster (op F9 te drukken) en sla de gegevens naar een excel-bestand (urgent F7) voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperma van 18 paling met een beweeglijkheid van de zaadcellen van 70% of hoger, werd geselecteerd voor deze studie. De resultaten toonden een vermindering in alle kwaliteitsparameters na ontdooien met die van verse zaadcellen (tabel 1 en Figuur 2 vergeleken). De resultaten van de motiliteit (bedoel ± S.E.M., n = 18) toonde een hogere totale beweeglijkheid en een progressieve mobiliteit in vers sperma dan de totale beweeglijkheid en progressieve mobiliteit gevonden in het spermastaaltje na dooi.
Hetzelfde patroon werd gevonden in de analyse van de snelle zaadcellen, waar monsters bevroren-ontdooid een lagere ratio van snel cellen dan verse monsters presenteerde. Daarnaast werden ook de spermacel snelheden gemeten verlaagd in de na ontdooien monsters.
Ook resultaten toonden dat levensvatbaarheid van de cellen na ontdooien gepresenteerd een afname van de levende zaadcellen van 23 ± 3,1% (bedoel ± S.E.M., n = 18) uit verse aan bevroren-ontdooid monsters (tabel 1 en Figuur 2).
Figuur 2 . Beweeglijkheid, kromlijnige snelheid en levensvatbaarheid van celgegevens van vers sperma en gedooid sperma (na cryopreservatie). Het sperma was cryopreserved gedurende 24 uur voordat het wordt ontdooid. De waarden die gepresenteerd zijn middelen ± S.E.M. van sperma van 18 monsters. Sterretjes geven significante verschillen tussen de ontdooide en verse monsters (t-toets; p < 0,05). De beweeglijkheid van de parameter aangegeven het percentage van de totale motile spermacellen, kromlijnige snelheid aangegeven de gemiddelde snelheid van de spermacellen langs een kromlijnige traject en levensvatbaarheid van de cellen aangegeven het percentage van de levend spermacellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Snelle + middellange cellen1 (%) | 70.7 ± 2.8 | 27.5 ± 2.1* |
| Kromlijnige snelheid (VCL; µm/s) | 118.8 ± 2.8 | 101.5 ± 1.8* |
| Snelheid van de rechte lijn (VSL; µm/s) | 53.3 ± 1.9 | 45.6 ± 1.3* |
| Gemiddelde pad snelheid (VAP; µm/s) | 73.3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| Verslaan van grensoverschrijdende frequentie (Hz) | 27.9 ± 0,3 | 27.1 ± 0,6 |
| Levensvatbaarheid van de cellen (% van levende cellen) | 97,7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Cellen tonen kromlijnige snelheid boven 40 µm/s. | ||
Tabel 1. Samenvatting van de resultaten van de verschillende parameters geanalyseerd met sperma computerondersteunde analysesysteem van verse en ontdooide monsters. Ontdooide monsters waren eerder cryopreserved gedurende 24 uur. Alle waarden voorgesteld als bedoel ± S.E.M. (n = 18). Sterretjes geven significante verschillen tussen de ontdooide en verse monsters (t-toets; p < 0,05). De parameters die geanalyseerd zijn: motile spermacellen gedefinieerd als het percentage van totaal aantal motile cellen; progressieve mobiliteit gedefinieerd als percentage van de spermacellen die vooruit in een in wezen rechte lijn zwemmen; snelle en middelgrote cellen gedefinieerd als het percentage spermacellen met een gemiddelde kromlijnige snelheid boven 40 µm/s; kromlijnige snelheid gedefinieerd als de gemiddelde snelheid van een zaadcel door haar kromlijnige traject; rechte lijn snelheid gedefinieerd als de gemiddelde snelheid van een zaadcel gemeten vanaf de eerste gedetecteerde positie naar de laatste positie in een rechte lijn; gemiddelde pad snelheid gedefinieerd als de gemiddelde snelheid van een zaadcel langs haar ruimtelijke gemiddelde traject; verslaan van cross frequentie gedefinieerd als de gemiddelde koers waartegen het kromlijnige sperma hoofd traject zijn gemiddelde pad traject kruist; de levensvatbaarheid van de cellen gedefinieerd als percentage van de levend spermacellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het volledige proces voor Europese aal rijping, handling en sperma cryopreservatie. De hier beschreven voorwaarden van veehouderij zijn optimaal voor snelle rijping en productie van grote volumes kwalitatief hoogwaardige sperma in dit soort 6,7,25. Het succes van dit protocol cryopreservatie en het mogelijke gebruik voor bevruchting na het ontdooien, afhangen sterk af van de kwaliteit van vers sperma 26. De selectie van hoge kwaliteit sperma is daarom van groot belang. Merk op dat de evaluatie van de kwaliteit van de subjectieve sperma is afhankelijk van de vaardigheden, de perceptie en de opleiding van de onderzoeker die de monsters 5,27,28 evalueert en kan leiden tot zeer uiteenlopende kwaliteit schattingen afhankelijk de onderzoeker 29. Het gebruik van computerondersteunde sperma analyse is daarom sterk aanbevolen om te selecteren van de beste kwaliteit monsters voor cryopreservatie.
De resultaten van de na ontdooien zaadkwaliteit gepresenteerd hier andere een daling in de parameters van beweeglijkheid, snelheid en overleving van de cel. Dit is in overeenstemming met de beschikbare bibliografie, ook al bestaan er grote verschillen tussen de soorten 26,30. Bijvoorbeeld, in een studie met Atlantische zalm (Salmo salar), was verse zaadcellen met een motiliteit van 70-95% bevroren met behulp van verschillende cryoprotectant (DMSO en methanol). De beweeglijkheid van de zaadcellen na het ontdooien was aanzienlijk lager dan in vers monsters, met motiliteit waarden in het beste protocol van 8,2%, maar bevruchting tarief met gedooid sperma was zo hoog als 42,8%, die 95% van de controle (vers sperma) 31vertegenwoordigd. In een andere studie met het sperma van Atlantische heilbot (Hippoglossus hippoglossus), werd geen significante vermindering in de beweeglijkheid van de zaadcellen gevonden na cryopreservatie en bemesting met gedooid sperma bedroeg meer dan 95% 32.
In Europese aal, eerdere studies bleek ook een vermindering in de beweeglijkheid van de zaadcellen na cryopreservatie onafhankelijk van de cryoprotectant 16,18 gebruikt. Daarnaast cryopreserved sperma van Europese aal van vergelijkbare kwaliteit heeft met succes gebruikt voor bevruchting 8. In deze studie gebruikt Asturiano et al. DMSO als de cryoprotectant. Het gebruik van DMSO heeft een aantal nadelen manipulatie aangezien deze cryoprotectant het sperma activeert en moet derhalve onmiddellijk worden ingevroren op toevoeging van DMSO. Ook, inseminatie met ingevroren sperma moet plaatsvinden onmiddellijk na het ontdooien. De daling van de pH van sperma kan gedeeltelijk oplossen dit probleem 19, maar het protocol is gevoeliger dan het protocol hier gepresenteerd met methanol als cryoprotectant.
Verschillende studies hebben aangetoond positieve resultaten gebruik van methanol als de cryoprotectant. Bijvoorbeeld, in een studie uitgevoerd met Japanse paling of aal (Anguilla japonica) met behulp van een vergelijkbaar protocol bij degene die hier gepresenteerd met 10% methanol als cryoprotectant, bevruchte de auteurs met succes eieren met verse en cryopreserved sperma. In deze studie behaalde zij bevruchting tarieven van 17% met geen significante verschillen tussen verse en cryopreserved sperma 33.
Het protocol hier gepresenteerd is gebleken dat behoud van voldoende kwaliteit van het sperma na het ontdooien, en soortgelijke sperma kenmerken tonen na het ontdooien dan protocollen met verschillende extenders en cryoprotectant, maar met de voordelen van gemakkelijke bediening pre en na cryopreservatie. Het is zeer belangrijk dat u nauwkeurig volgt de koeling en ontdooien tijden die hier worden beschreven, alsmede met hoge kwaliteit sperma. In toekomstige studies, zullen bevruchting proeven worden getest met behulp van dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze publicatie werd gefinancierd door de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie geen 642893 (IMPRESS), het Bureau van de kosten (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE), en de Research Centre of Excellence - krachtens de subsidieovereenkomst Marie Sklodowska-Curie-programma 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
