Summary
Protokoller for europeisk modning og sperm kryonisk bevaring forbedret de siste årene. Denne artikkelen beskriver den beste protokollen tilgjengelig ved hjelp av humant choriongonadotropin (hCG) for å indusere modning og metanol som kryoprotektant.
Abstract
De siste årene, har flere forskningsgrupper jobbet med utvikling og forbedring av nye protokoller for europeisk håndtering og modning. Idet av ennå, ukentlige injeksjoner av humant choriongonadotropin (hCG) har vist seg for å modne menn etter bare 5-6 uker med behandling, produsere høye volumer av høy kvalitet sperm under flere uker. Dessuten har sperm kryonisk bevaring protokoller bruker forskjellige Extender, cryoprotectants og kjøling og tining ganger vært beskrevet tidligere for europeisk. Her viser vi at Tanaka´s Extender-løsningen kan brukes direkte for befruktning eller kryonisk bevaring, gjør unødvendig bruk av ulike typer løsninger og fortynninger. Videre gjør bruk av metanol som en kryoprotektant denne protokollen brukervennlig som metanol har lav toksisitet og aktiverer sperm. Sperm trenger ikke å være cryopreserved umiddelbart etter at kryoprotektant, og det kan bli brukt lenge etter blir tint. Videre er Spermiemotilitet fortsatt høy etter tining selv om det er lavere enn friske sperm. Formålet med dette arbeidet er å vise den beste tilgjengelige protokollen for europeisk håndtering, modning og sperm kryonisk bevaring.
Introduction
De siste 25 årene, har hvor mange European ål (a. anguilla) ankommer den europeiske kysten redusert jevnt med 90% 1,2,3. Det er flere faktorer som forklarer dette drastiske slippe inkludert forurensning, infeksjoner, overfiske og habitat ødeleggelse. Alt dette har hatt en dyp effekt på denne arten, fører til inkludering av ål på International Union for bevaring av naturen (IUCN) liste som kritisk truede 4. Følgelig utviklingen av teknikker og protokoller for reproduksjon i fangenskap er nødvendig.
Modningen av ål i fangenskap oppnås ved hormonell behandling 5,6,7 men produksjon av gameter i begge kjønn er vanskelig å synkronisere 8. Selv om utviklingen av nye androgen implantater har vist for å akselerere oogenesis i ål 9,er10, tidspunktet for siste modning hos kvinner fortsatt svært variabel og vanskelig å kontrollere 11. Derfor korte lagringstiden sperm 12,13,14 og kryonisk bevaring teknikker er nødvendig for reproduksjon ledelse, gjør Kjønnscelle synkronisering unødvendige 8.
Kryonisk bevaring av ål sæd er utviklet siden 2003 15,16. Flere forskere utviklet vellykket protokoller bruker dimethyl sulfoxide (DMSO) eller metanol som cryoprotectants, 16,,17,,18,,19,,20. Selv om begge protokollene har blitt brukt, er innhentet celle levedyktigheten til tinte sperm cryopreserved med DMSO lavere enn med metanol 20,21. Videre ål sperm aktiveres ved kontakt med DMSO og krever mer kjedelig sperm manipulasjon 19, derfor metanol er en mer passende kryoprotektant for europeisk sædcellene enn DMSO.
Her beskrives protokollen for optimal håndtering og hormonal behandling av europeisk nedenfor. I tillegg vil den beste ål sperm kryonisk bevaring protokollen med metanol som en kryoprotektant og en protokoll for vurdering av kvaliteten i denne arten også bli beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for å arbeide med ål beskrevet i denne protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimentering på Universitat Politècnica de València, etter spansk lover og forskrifter kontrollerer eksperimenter og prosedyrer på levende dyr.
1. fisk vedlikehold
- Få europeiske eels til forskning og sette dem i en 200 L akvarier med en resirkuleringssystemet. Bruk Termostater og kjølere for å opprettholde en konstant 20 ° C temperatur.
- Holde fisken i mørke forhold å unngå stress22 og uten mat under eksperimentet.
- Holde fisk i ferskvann i de første 3 dagene. Deretter endre 1/3 av vannet og fyll med sjøvann annenhver dag fram en saltholdighet i 37.0 ± 0,3 finans.
2. hormonell behandling
Merk: Hormonell behandling består av ukentlige injeksjoner av humant choriongonadotropin (hCG) gjennom hele varigheten (ni uker) av eksperimentet.
- Forberede hCG hormone på forhånd i en konsentrasjon av 1 IU/µL fortynne hormonet i saltvann (0,9% NaCl).
Merk: Hormonet kan bevares utvannet på denne konsentrasjonen for over en uke på-18 ° C. - For å bedøve fisken, forberede en 40 L fleksibel bøtte med 5 L system vann.
- I en 250 mL kolbe, fortynne 300 mg benzocaine i 100 mL 70% etanol.
- Hell den utvannet benzocaine i bøtte (siste konsentrasjon 0.36 mM) og bland riktig. Dette er for en siste benzocaine konsentrasjon av 60 mg/L.
- Overføre fisken, individuelt, i vannet med benzocaine og vent noen sekunder til benzocaine trer i kraft og fisken er riktig anesthetized.
Merk: For å bekrefte at fisken er anesthetized, legg fisken i supine posisjon og sjekke at det forblir i den posisjonen.
- Administrere hormonet, veie fisken og forberede hCG hormone på en dose av 1,5 IU/g av fisk, i en 1,5 mL plastrør.
- Fyll en 1 mL sprøyte med hCG hormone fra plast røret.
- Legg bedøvet fisken i supine posisjon og med hjelp eller sprøyten, injisere hormonet nøye i intraperitoneal området.
- Returnere fisken til akvarier og overvåke det før helt frisk.
Merk: Hormonelle administrasjonen har å bli gjennomført ukentlige hele eksperimentet. Europeisk ål starter normalt spermating etter 6-7 uker av hormonell behandling.
3. sperm prøvetaking
- For å få beste kvalitet prøvene, ekstra sperm 24 timer etter hormonelle administrasjon6,23.
- Bedøve fisken med benzocaine som beskrevet i trinn 2.2.
- Legg bedøvet fisken i supine posisjon, rene kjønnsorganene med en squirt destillert vann og tørk forsiktig med papir, å unngå avføring forurensing i genital området eller utilsiktet sperm aktivisering ved kontakt med sjøvann fra akvarier.
- Plassere fingrene på begge lateral fisken, massasje forsiktig trykker sidelengs fra brystfinner til kjønnsorganene tvinge sæd ut.
- Gjenta massasje til ingen mer sperm kommer ut fra genital åpningen.
- Samle sperm i 15 mL plast rør ved hjelp av en vakuumpumpe.
- Fortynne den utpakkede sperm 1:10 i modifisert Tanaka´s Extender-løsningen24 (137 mM NaCl, 76.2 mM NaHCO3, i destillert vann) på 4 ºC.
Merk: Sædceller i extender løsningen bør opprettholdes på 4 ºC.
4. sperm kvalitet evaluering
- Forberede kunstig sjøvann13 (i mM: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28,2, KCl 9.4, i destillert vann) med 2% bovin serum albumin (BSA) (w:v), justere pH til 8,2, osmolality til 1100 mOsm/kg og vedlikeholde den 4 ºC å unngå bakterievekst.
- Åpne programvaren for computer-assistert sperm analyse (CASA) og velge modulen fisk sperm.
- Klikk Egenskaper for åpne systemoppsettet av programvaren. Der, angi alternativene fangst på 60 bilder per sekund. Velg negativ fase optikk, Makler kammeret og 10 X skala.
- På analyse verdiene, velger du fisk som arter og partikler område større enn 2 µm2 og mindre enn 20 µm2.
- På hastighet parametere, satt til langsom når cellene flytte mellom 10 og 45 µm/s, satt til Middels når du flytter mellom 45 og 100 µm/s og satt til rask flytte raskere enn 100 µm/s.
Merk: Spermatozoa med hastighet tregere enn 10 µm/s ble ansett immotile. - Velg de progressive verdiene som 80% av rett linje (STR) og lagre egenskapene.
- Klikk på Ta feltet (et vindu med levende bilder fra kameraet vil bli åpnet).
Merk: Analysesystem computer-assistert sæd er dannet av et mikroskop, et kamera og en analyseprogramvare.
- På telling kammeret, sett 4 µL kunstig sjøvann og tilsett 0,5 µL av sæd løsning (sperm fortynnet i extender løsning).
- Fokus bildet med mikroskopet på 10 X forstørrelse i negativ fase. 15 s etter aktivisering, klikk på Capture - fra video i computer-assistert sperm analyseprogramvare.
- Analysere hver prøve i tre eksemplarer og velg med en motilitet høyere enn 70% for kryonisk bevaring.
Merk: Det er svært viktig å velge bare høy kvalitet sperm for suksessen til denne kryonisk bevaring protokollen.
5. sperm frysing metode
- Forberede på forhånd flytende nitrogen (ca 2,5 L) i en 34 cm x 34 cm x 30 cm og 5 cm tykk Styrofoam boksen.
Merk: Opprettholde et flytende nitrogen av 4-5 cm høyde til alle tider.- Bygge en flytende struktur for å fryse pre sperm. Bruk 2 stk av polystyren (20 cm x 5 cm), binde dem med 2 plast rør, og plassere strukturen på flytende nitrogen. Denne strukturen må flyte over flytende nitrogen i en omtrentlig høyde på 3 cm over overflaten (figur 1).
Figur 1 . Skjematisk tegning av flytende brukes for pre fryser over flytende nitrogen. Strukturen består av to deler av lav tetthet Styrofoam 20 cm x 4 cm x 5 cm knyttet plast rør 14 cm. Sugerørene plasseres over plast rør for 3 cm over flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Klargjør kryonisk bevaring løsningen ved å blande sperm, extender løsning og metanol i forholdet 1:8:1 i 1,5 mL plast rør og rør forsiktig.
- Med hjelp av en pipette, Legg 480 µL av kryonisk bevaring løsningen til 500 µL strå og eventuelt merke dem ved å lukke en ende med modellering leire.
- Sette halm på flytende enheten i en høyde på 3 cm over flytende nitrogen 3 min. Deretter plasser halm i flytende nitrogen.
- Etter 10-15 min, overføre strå i en flytende nitrogen lagertank bruker lang tang og holde dem senkes i flytende nitrogen til alle tider. Her, kan sperm lagres på ubestemt tid.
6. tining metode
- Forberede en Styrofoam boks med flytende nitrogen som beskrevet i trinn 5.1, og forberede et vannbad med en 3 liters kanne med vann på 40 grader.
- Overføre strå med frossen sæd fra lagertankens i boksen Styrofoam med flytende nitrogen bruker lang tang.
- Sett hver strå i et vannbad på 40 grader for 13 s.
- Hell sæd i en 1,5 mL plastrør ved å kutte lukket endene av halm med saks.
- Analysere Spermiemotilitet bruker computer-assistert sperm analysesystem som forklart i trinn 4.1.
- Hold 100 µL av sæd analysere levedyktigheten til spermatozoa med en flyt cytometer.
7. flowcytometri
- Bruke en fluorescerende kit som inneholder propidium iodide (PI), som er en rød fluorescerende stoff som flekker kjerner i døde celler, og en membran-permeant kjernefysiske fluorescerende stoff, at grønn flekker kjerner i levende celler.
- Klargjør grønne fluorescerende flekker løsningen ved å fortynne den fra lagerløsning (1 mM) 1:10 i Tanaka´s medium til en fungerende løsning på 100 µM.
- Ikke utvanne PI løsningen. Lager løsningen er på 2,4 mM.
- For hver prøve, ta 50 µL av friske eller tinte sæd og legge 0,5 µL av grønne fluorescerende flekker fungerende løsning (siste konsentrasjon 1 µM) og 2 µL av PI løsning (siste konsentrasjon 100 µM).
- Inkuber prøvene som inneholder fargestoffer (PI og grønne fluorescerende flekker) i mørket 5 min.
- Fortynne eksemplene i 500 µL Tanaka´s extender løsning og analysere med flyt-cytometer.
- Slå på strømmen cytometer og opprette en ny protokoll som inneholder minst 2 tomter: SS logge vs FS logg og FL1 vs FL3.
Merk: Begge grønn fluorescerende flekker og propidium iodide kan være glade med synlige bølgelengden lys. Når bundet til DNA, maksimal fluorescens utslipp av disse fargestoffer er 516 nm og 617 nm, henholdsvis.- Justere spenninger til forskjellige lasere: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Definere oppkjøpet innstillinger accord maksimal hendelser = 5000 eller 15 s (siste konsentrasjonen av prøven bør være rundt 1 million av celler/mL). Les prøven ved hjelp av en lav -flow.
- Velg Lesemodus enkeltrør fast posisjonsmodus.
- Sette prøven i riktig antall karusellen
- Les prøven (trykke F9), og lagre dataene samlet til en excel-fil (trykke F7) for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperm fra 18 ål med en Spermiemotilitet på 70% eller høyere, ble valgt for denne studien. Resultatene viste en reduksjon i alle kvalitet parameterene etter tining sammenlignet med de fra frisk sperm (tabell 1 og figur 2). Motilitet resultatene (mener ± S.E.M., n = 18) viste en høyere totale motilitet og en progressiv motilitet i frisk sperm enn totalt motilitet og progressiv motilitet i post tine sperm prøvene.
Det samme mønsteret ble funnet i analyse av rask sædceller, hvor frosset-tint prøver presentert lavere forholdet rask celler enn friske prøver. Dessuten redusert sperm celle hastigheter målt også i etter tiner prøvene.
Også resultatene viste at cellen levedyktighet etter tining presentert en reduksjon i levende sædceller på 23 ± 3,1% (mener ± S.E.M., n = 18) fra frisk til frosset-tint prøver (tabell 1 og figur 2).
Figur 2 . Motilitet, beregner hastighet og celledata levedyktighet av fersk sæd og tinte sperm (etter kryonisk bevaring). Sperm var cryopreserved for 24 timer før blir tint. Verdiene presentert er betyr ± S.E.M. av sæd fra 18 prøver. Stjernene indikerer betydelige forskjeller mellom tinte og frisk prøver (t-test, p < 0,05). Parameteren motilitet angitt prosentandelen av totale motile spermatozoa, beregner hastigheten angitt gjennomsnittlige hastigheten av spermatozoa langs en kurvelineæritet bane, og cellen levedyktighet angitt prosentandelen av levende spermatozoa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Rask og middels cellene1 (%) | 70.7 ± 2.8 | 27.5 ± 2.1* |
| Beregner hastigheten (VCL, µm/s) | 118.8 ± 2.8 | 101.5 ± 1.8* |
| Lineær hastighet (VSL; µm/s) | 53.3 ± 1,9 | 45.6 ± 1.3* |
| Gjennomsnittlig banen hastighet (VAP; µm/s) | 73.3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| Slo cross frekvens (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27.1 ± 0,6 |
| Cellen levedyktighet (% av levende celler) | 97.7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Celler viser beregner hastighet over 40 µm/s. | ||
Tabell 1. Oppsummering av resultatene av de forskjellige parameterne analysert med computer-assistert sperm analysesystem fra frisk og tinte prøvene. Tinte prøvene var tidligere cryopreserved 24 h. Alle verdier presentert som mener ± S.E.M. (n = 18). Stjernene indikerer betydelige forskjeller mellom tinte og frisk prøver (t-test, p < 0,05). Parameterne analysert var: motile spermatozoa definert som en prosent av totale motile celler. progressiv motilitet definert som prosent av spermatozoa som svømmer frem i en i hovedsak lineær; rask og mellomstore celler som er definert som prosent av spermatozoa med en gjennomsnittlig beregner hastighet over 40 µm/s; Beregner hastigheten definert som gjennomsnittlig hastighet av en spermatozoon gjennom sin kurvelineæritet bane; lineær hastighet definert som gjennomsnittlig hastighet av en spermatozoon målt fra første oppdaget posisjon til siste posisjon i en rett linje; gjennomsnittlig banen hastighet definert som gjennomsnittlig hastighet av en spermatozoon langs sin romlige gjennomsnittlig bane; slo tvers frekvens definert som den gjennomsnittlige frekvensen som beregner sædceller hode banen krysser sin gjennomsnittlig bane bane; cellen levedyktighet definert i prosent av levende spermatozoa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hele prosessen for europeisk modning, håndtering og sperm kryonisk bevaring. Reindriftens forholdene beskrevet her er optimal for rask modning og produksjon av store mengder høy kvalitet sperm i denne arten 6,7,25. Suksessen denne kryonisk bevaring protokollen og potensiell bruk for befruktning etter tining avhenger av kvaliteten på fersk sperm 26. Derfor er valg av høy kvalitet sperm av stor betydning. Merk at subjektive sperm kvalitet evaluering avhenger ferdigheter, persepsjon og opplæring av forskeren som evaluerer prøver 5,27,28 og kan føre til svært ulik kvalitet beregninger avhengig forsker 29. Derfor anbefales bruk av computer-assistert sperm analyse å velge de beste kvalitet prøvene for kryonisk bevaring.
Resultater av post tiner sperm kvalitet presentert her viste en reduksjon i parameterne til motilitet, hastighet og celle overlevelse. Dette stemmer overens med tilgjengelige bibliografien, selv om det finnes stor variasjon mellom arter 26,30. For eksempel i en studie med laks (Salmo salar), var frisk spermier med en motilitet på 70-95% frosset bruker forskjellige cryoprotectants (DMSO og metanol). Spermiemotilitet etter tining var betydelig lavere enn i frisk prøvene, med motilitet verdier i den beste protokollen 8.2%, men befruktning rate å bruke tinte sperm var så høy som 42,8%, som representerte 95% av de kontroll (friske sperm) 31. I en annen studie med sæd av Atlantic kveite (Hippoglossus hippoglossus), fant ingen betydelig reduksjon i Spermiemotilitet etter kryonisk bevaring og gjødsling rate å bruke tinte sperm var over 95% 32.
I ål, tidligere studier viste en reduksjon i Spermiemotilitet etter kryonisk bevaring uavhengig av kryoprotektant 16,18. I tillegg har cryopreserved sperm fra ål av tilsvarende kvalitet blitt brukt med hell for befruktning 8. I denne studien brukt Asturiano et al. DMSO som kryoprotektant. Bruk av DMSO har noen manipulasjon ulemper siden denne kryoprotektant aktiverer sæd og derfor må bli frosset umiddelbart etter tillegg av DMSO. Også må inseminasjon med tinte sperm gjennomføres umiddelbart etter tining. Reduksjon av sæd pH kan delvis løse denne problem 19, men protokollen er mer delikat enn protokollen presenteres her med metanol som kryoprotektant.
Flere studier har vist positive resultater med metanol som kryoprotektant. For eksempel i en studie utført med japansk ål (a. japonica) bruker en veldig lignende protokoll til den presenteres her, med 10% metanol som kryoprotektant, befruktet forfatterne vellykket egg bruke friske og cryopreserved sperm. I denne studien fikk de befruktning priser på 17% med ingen betydelige forskjeller mellom frisk og cryopreserved sperm 33.
Protokollen presenteres her har vist seg å bevare tilstrekkelig kvaliteten etter tining, og Vis lignende sædceller egenskaper etter tining enn protokoller bruker forskjellige Extender og cryoprotectants, men med fordelene med enkel håndtering pre og etter kryonisk bevaring. Det er veldig viktig å følge nøyaktig kjøling og tining ganger beskrevet her, samt bruk av høy kvalitet sperm. I fremtidige studier, skal befruktning forsøk testes bruker denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne publikasjonen ble finansiert av EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program under Marie Sklodowska-Curie grant avtalen ingen 642893 (IMPRESS), pris kontor (pris handling FA 1205, AQUAGAMETE) og Research senter for fremragende- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
