Summary
Protocolos de criopreservación de maduración y esperma de anguila europea han sido mejorados en los últimos años. Este artículo describe el protocolo mejor disponible con gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir la maduración y metanol como crioprotector.
Abstract
Durante los últimos años, varios grupos de investigación han estado trabajando en el desarrollo y mejora de nuevos protocolos para el manejo de la anguila europea y la maduración. Como de sin embargo, inyecciones semanales de gonadotropina coriónica humana (hCG) han demostrado lo machos después de sólo 5-6 semanas de tratamiento, produciendo altos volúmenes de esperma de alta calidad durante varias semanas. Además, protocolos de criopreservación de espermatozoides utilizando diferentes diluyentes, crioprotectores y enfriamiento y descongelamiento veces se han descrito previamente para la anguila europea. Aquí, mostramos que Tanaka´s solución de extender puede ser utilizado directamente para la fertilización o para la criopreservación, haciendo innecesario el uso de diferentes tipos de soluciones y diluciones. Además, el uso de metanol como crioprotector hace este Protocolo fácil de usar como metanol tiene baja toxicidad y no activa el esperma. El esperma no necesita ser congelados inmediatamente después de la adición del crioprotector, y puede ser utilizado durante mucho tiempo después de ser descongelado. Por otra parte, la motilidad del esperma sigue siendo alta después de descongelar, aunque es menor que la del semen fresco. El objetivo de este trabajo es mostrar el mejor protocolo disponible para la anguila europea, manipulación, maduración y criopreservación de esperma.
Introduction
En los últimos 25 años, el número de anguila europea (Anguilla anguilla) al llegar a la Costa Europea ha disminuido constantemente en 90% 1,2,3. Hay varios factores que explican esta caída drástica como contaminación, infecciones, sobrepesca y fragmentación del hábitat. Todo esto ha tenido un profundo efecto sobre esta especie, conduce a la inclusión de la anguila europea en la Unión Internacional para la lista de conservación de la naturaleza (UICN) en peligro de extinción crítico 4. En consecuencia, el desarrollo de técnicas y protocolos para la reproducción en cautiverio es necesario.
La maduración de la anguila europea en cautividad se consigue por tratamiento hormonal 5,6,7 pero la producción de gametos en ambos sexos es difícil sincronizar 8. Aunque el desarrollo de nuevos implantes de andrógenos ha demostrado acelerar la Oogénesis en anguilas 9,10, el tiempo de maduración final en las mujeres es altamente variable y difícil de controlar 11. Por lo tanto, almacenamiento a corto plazo de esperma 12,13,14 y criopreservación de las técnicas son necesarias para la gestión de la reproducción, haciendo innecesario de sincronización de gametos 8.
Criopreservación de espermatozoides de la anguila europea ha sido desarrollada desde 2003 15,16. Varios investigadores diseñaron protocolos exitosos utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) o metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Aunque ambos protocolos se han utilizado con éxito, la viabilidad de las células obtenidas de semen descongelado congelados con DMSO es menor que con metanol 20,21. Por otra parte, eel esperma se activa al contacto con el DMSO y requiere de manipulación de espermatozoides más tedioso 19, por lo tanto, el metanol es más adecuado crioprotector para que la esperma de anguila europea de DMSO.
Aquí, el protocolo para el manejo óptimo y tratamiento hormonal de la anguila europea se describirán a continuación. Además, el protocolo de criopreservación de esperma de anguila europea mejor usando metanol como crioprotector y un protocolo para la evaluación de la calidad del esperma en esta especie también se describe.
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Protocol
Todos los procedimientos para trabajar con anguila europea se describe en este protocolo fueron aprobados por el Comité de ética de la experimentación Animal en la Universitat Politècnica de València, siguiendo las leyes españolas y las regulaciones que controlan los experimentos y procedimientos en animales vivos.
1. pescado mantenimiento
- Las anguilas europeas a un centro de investigación y poner en un acuario de 200 L con un sistema de recirculación. Utilice termostatos y refrigeradores para mantener una temperatura constante de 20 ° C.
- Mantener los peces en condiciones de oscuridad para evitar estrés22 y con ninguna comida durante el experimento.
- Mantener los peces en agua dulce durante los 3 primeros días. Luego 1/3 del agua y rellenar con agua de mar cada tercer día hasta llegar a una salinidad de 37.0 ± 0,3 g/L.
2. hormonal tratamiento
Nota: El tratamiento hormonal consiste en inyecciones semanales de gonadotropina coriónica humana (hCG) a lo largo de toda la duración (nueve semanas) del experimento.
- Preparar la hormona hCG con antelación a una concentración de 1 IU/μl diluyendo la hormona en solución salina (0,9% NaCl).
Nota: La hormona se puede preservar diluido a la concentración de más de una semana a-18 ° C. - Para anestesiar el pescado, preparar un cubo flexible de 40 L con 5 L de agua del sistema.
- En un matraz de 250 mL, diluir a 300 mg de benzocaína en 100 mL de etanol al 70%.
- Vierta la benzocaína diluida en el cubo (concentración final 0,36 mM) y mezclar bien. Se trata de una concentración de benzocaína final de 60 mg/L.
- Transferencia de los peces, individualmente, en el agua con benzocaína y espere unos segundos hasta que la benzocaína en vigor y los peces es correctamente anestesiado.
Nota: Para confirmar que el pescado está anestesiado, coloque el pescado en una posición supina y comprobar que se mantiene en esa posición.
- Administrar la hormona, pesar el pescado y preparar la hormona hCG en dosis de 1,5 UI/g de pescado, en un tubo de plástico de 1,5 mL.
- Llene una jeringa de 1 mL con la hormona hCG desde el tubo de plástico.
- Coloque el pescado anestesiado en posición supina y con la ayuda o la jeringa, inyecte la hormona cuidadosamente en la zona intraperitoneal.
- Volver los peces a los acuarios y vigilar hasta que se recuperó completamente.
Nota: La administración hormonal debe realizarse semanalmente durante todo el experimento. Anguila europea iniciar normalmente, spermating después de 6-7 semanas de tratamiento hormonal.
3. espermatozoides muestreo
- Para obtener las mejores muestras de calidad, extracto espermatozoide 24 h después de la administración hormonal6,23.
- Anestesiar el pez con benzocaína como se describe en el paso 2.2.
- Coloque el pescado anestesiado en posición supina, limpie el área genital con un chorro de agua destilada y secar cuidadosamente con papel, para evitar la contaminación de las heces presente en el área genital o activación de espermatozoides accidental por contacto con agua salada de los acuarios.
- Colocar los dedos en ambos lados laterales de los peces, masaje con cuidado presionando lateralmente de las aletas pectorales a la zona genital para forzar el esperma hacia fuera.
- Repita el masaje hasta que no hay más esperma salga por la abertura genital.
- Recoger los espermatozoides en tubos de plástico de 15 mL con una bomba de vacío.
- Diluir el esperma extraído 1:10 en modificado Tanaka´s extensor de solución24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, agua destilada) a 4 º c.
Nota: Los espermatozoides en la solución de extender deben mantenerse a 4 º c.
4. evaluación de la calidad de espermatozoides
- Preparar agua de mar artificial13 (en mM: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, en agua destilada) con 2% albúmina de suero bovino (BSA) (p), ajustar el pH a 8.2, osmolalidad a 1100 mOsm/kg y mantener él a 4 º c para evitar el crecimiento bacteriano.
- Abra el software para el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador (CASA) y seleccione el módulo de esperma de peces.
- Haga clic en propiedades para abrir la configuración del software del sistema. Allí, definir las opciones de captura 60 imágenes por segundo. Seleccionar fase negativa óptica, cámara de Makler y escala X 10.
- En los valores de análisis, seleccione peces como especie y área de partículas mayores de 2 μm2 y menor que 20 μm2.
- Sobre los parámetros de velocidad, ajuste a lento cuando las células moverse entre 10 y 45 μm/s, al medio cuando se mueve entre 45 y 100 μm/s y a rápido cuando se mueve más rápido que 100 μm/s.
Nota: Espermatozoides con velocidad menor que 10 μm/s se consideran fijos. - Seleccionar los valores progresistas como el 80% de rectitud (STR) y guardar las propiedades.
- Haga clic en Capturar el campo (se abrirá una ventana con las imágenes en vivo de la cámara).
Nota: El sistema de análisis de semen asistida por ordenador está formado por un microscopio, una cámara y un software de análisis de imagen.
- En la cámara de cuenta, ponga 4 μL de agua de mar artificial y añadir 0,5 μl de solución de semen (esperma diluida en solución diluyente).
- Enfocar la imagen con el microscopio con aumentos de 10 en la fase negativa. 15 s después de la activación, haga clic en captura - video en el software de análisis de espermatozoides asistido por ordenador.
- Analizar todas las muestras en triplicado y seleccionadas muestras con una motilidad superior al 70% para la criopreservación.
Nota: Es muy importante seleccionar únicamente esperma de alta calidad para el éxito de este protocolo de criopreservación.
5. método de congelación de espermatozoides
- Preparar de antemano líquido nitrógeno (aproximadamente 2,5 L) en un 34 x 34 cm x 30 cm y 5 cm Grosor espuma de poliestireno caja.
Nota: Mantener un nivel de nitrógeno líquido de 4-5 cm de altura en todo momento.- Construir una estructura flotante para congelar previamente el semen. 2 piezas de poliestireno (20 x 5 cm), enlazar con 2 tubos de plástico y coloque la estructura sobre el nitrógeno líquido. Esta estructura debe flotar sobre el nitrógeno líquido a una altura aproximada de 3 cm sobre la superficie (figura 1).
Figura 1 . Esquema de la estructura flotante utilizada para la congelación por nitrógeno líquido. La estructura consta de dos piezas de baja densidad de espuma de poliestireno de 20 cm x 4 cm x 5 cm conectado con tubos de plástico de 14 cm. La paja se coloca sobre los tubos de plástico en 3 cm sobre el nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Preparar la solución de criopreservación mediante la mezcla de esperma, solución de extender y metanol en proporción de 1:8:1 en plástico de 1,5 mL los tubos y agitar suavemente.
- Con la ayuda de una pipeta, añadir 480 μl de la solución de criopreservación en la paja de los 500 μl y si es necesario, marcarlas por el cierre de uno de los extremos con plastilina.
- Poner la paja en el dispositivo flotante a una altura de 3 cm por encima del nitrógeno líquido durante 3 minutos. Luego, colocar la paja en el nitrógeno líquido.
- Después de 10-15 min, transferir las pajillas en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido con unas pinzas largas y mantenerlos sumergidos en nitrógeno líquido en todo momento. Aquí, los espermatozoides pueden ser almacenados indefinidamente.
6. método de descongelación
- Prepare una caja de espuma de poliestireno con nitrógeno líquido como se describe en el paso 5.1 y preparar un baño de agua con un vaso de precipitados de 3 L de agua a 40 º c.
- Transferir las pajillas con semen congelado desde el tanque de almacenamiento en la caja de la espuma de poliestireno con nitrógeno líquido con unas pinzas largas.
- Poner cada paja en un baño de agua a 40 º c 13 s.
- Vierta el semen en un tubo de plástico de 1,5 mL cortando los extremos cerrados de la paja con una tijera.
- Analizar la motilidad espermática mediante sistema de análisis de semen asistido por computadora como se explica en el paso 4.1.
- Mantener 100 μl de semen para analizar la viabilidad de los espermatozoides con un citómetro de flujo.
7. flujo Cytometry
- Utilice un kit fluorescente con yoduro de propidio (PI), que es un compuesto fluorescente rojo que tiñe los núcleos de las células muertas y un compuesto fluorescente nuclear membrana-permeant, que verde tiñe los núcleos de las células vivas.
- Preparar la solución de tinción fluorescente verde mediante la dilución de la solución madre (1 mM) 1:10 en medio de Tanaka´s a una solución de trabajo de 100 μm.
- No diluir la solución de PI. La solución está en 2,4 mM.
- Para cada muestra, tomar 50 μl de semen fresco o descongelado y agregar 0,5 μl de verde fluorescente, coloración de la solución de trabajo (concentración final 1 μm) y 2 μl de solución de PI (concentración final 100 μm).
- Incubar las muestras que contienen los tintes (PI y tinción fluorescente verde) en la oscuridad durante 5 minutos.
- Diluir las muestras en 500 μl de solución de extensor de Tanaka´s y analizar con el citómetro de flujo.
- Encienda el citómetro de flujo y crear un nuevo protocolo que contenga por lo menos 2 parcelas: SS registro registro vs FS y FL1 vs FL3.
Nota: Ambos, verde fluorescente yoduro de propidio la coloración y a puede ser excitado con luz de longitud de onda visible. Cuando se une a ADN, la emisión de fluorescencia máxima de estos tintes son 516 nm y 617 nm, respectivamente.- Ajustar las tensiones de los diferentes láseres: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Configurar el acuerdo de ajustes de adquisición máxima eventos = s 5000 o 15 (la concentración final de la muestra debe ser aproximadamente 1 millón de células/mL). Lea la muestra usando un flujo de baja .
- Seleccione el modo de lectura solo tubo fijada modo de posición.
- Coloca la muestra en el número correcto del carrusel
- Leer la muestra (presionando F9) y guardar los datos recogidos en un archivo de excel (pulsando F7) para su posterior análisis.
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Representative Results
Semen de 18 morenas con una motilidad del esperma de 70% o más, fue seleccionado para este estudio. Los resultados mostraron una reducción en todos los parámetros de calidad después de deshelar en comparación con los de esperma fresca (tabla 1 y figura 2). Los resultados de motilidad (promedio ± SEM, n = 18) demostró una mayor motilidad total y una motilidad progresiva en esperma fresca que la motilidad total y motilidad progresiva encontrada en las muestras de esperma después del deshielo.
El mismo patrón fue encontrado en el análisis rápidos de células de esperma, donde muestras congelado presentan una proporción menor de las células de rápido que las muestras frescas. Además, las velocidades del espermatozoide mide también fueron reducidas en las muestras después de la descongelación.
También, los resultados mostraron que viabilidad celular después de deshelar presentaron una reducción en las células de esperma vivo de 23 ± 3,1% (promedio ± SEM, n = 18) de muestras frescas para congelado (tabla 1 y figura 2).
Figura 2 . Motilidad, velocidad curvilínea y datos de viabilidad de células de semen fresco y semen descongelado (después de la crioconservación). El esperma fue criopreservado durante 24 h antes de ser descongelados. Los valores presentados son medios ± SEM de los espermatozoides de 18 muestras. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras descongeladas y frescas (t-test; p < 0.05). La motilidad del parámetro indica el porcentaje de espermatozoides móviles totales, curvilíneas de velocidad indica la velocidad media de los espermatozoides a lo largo de una trayectoria curvilínea, y viabilidad de las células indica el porcentaje de espermatozoides vivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Las células rápido + medio1 (%) | 70,7 ± 2.8 | 27.5 ± 2.1* |
| Velocidad curvilínea (VCL, μm/s) | 118,8 ± 2.8 | 1.8* ± 101.5 |
| Velocidad de línea recta (VSL, μm/s) | 53.3 ± 1,9 | 1.3* 45,6 ± |
| Velocidad de recorrido promedio (VAP, μm/s) | 73,3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| Vencer a Cruz frecuencia (Hz) | 27,9 ± 0.3 | 27,1 ± 0.6 |
| Viabilidad celular (% de células vivas) | 97,7 ± 0.3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Células que muestran velocidad curvilínea sobre 40 μm/s. | ||
Tabla 1. Resumen de los resultados de los diferentes parámetros analizados con sistema de análisis de espermatozoides asistido por ordenador de muestras frescas y descongeladas de. Las muestras descongeladas previamente cryopreserved para 24 h. Todos los valores presentados como promedio ± SEM (n = 18). Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras descongeladas y frescas (t-test; p < 0.05). Los parámetros analizados fueron: espermatozoides móviles que se define como el porcentaje de células mótiles totales; motilidad progresiva definida como el porcentaje de espermatozoides que nadan hacia adelante en una línea esencialmente recta; células rápidas y medio definidas como el porcentaje de espermatozoides con un promedio de la velocidad curvilínea sobre 40 μm/s; velocidad curvilínea definida como velocidad media de un espermatozoide a través de su trayectoria curvilínea; velocidad de la línea recta definida como velocidad media de un espermatozoide mide desde la primera posición detectada a su última posición en línea recta; velocidad de recorrido promedio definida como velocidad media de un espermatozoide a lo largo de su trayectoria promedio espacial; superando la frecuencia cruzada define como la tasa promedio en el cual la trayectoria principal de esperma curvilínea cruza su trayectoria trayectoria promedio; viabilidad celular definida como el porcentaje de espermatozoides vivos.
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Discussion
Este protocolo describe el proceso completo para la criopreservación de maduración, la manipulación y el esperma de anguila europea. Las condiciones de cría descritas aquí son óptimas para la producción de altos volúmenes de esperma de alta calidad en esta especie 6,7,25y maduración rápida. El éxito de este protocolo de criopreservación y su potencial uso para la fertilización después de descongelar dependen mucho de la calidad de esperma fresco 26. Por lo tanto, la selección de espermatozoides de alta calidad es de gran importancia. Tenga en cuenta que la evaluación de la calidad subjetiva del esperma depende de las habilidades, la percepción y la formación del investigador que evalúa las muestras 5,27,28 y puede conducir a valoraciones de muy diversa calidad dependiendo el investigador 29. Por lo tanto, recomienda el uso de análisis de semen asistida por ordenador es para seleccionar las mejores muestras de calidad para la criopreservación.
Resultados de la calidad de espermatozoides post-descongelado presentado aquí, mostró una reducción en los parámetros de motilidad, velocidad y supervivencia de la célula. Esto es consistente con la bibliografía disponible, a pesar de que existe gran variación entre especies 26,30. Por ejemplo, en un estudio con salmón del Atlántico (Salmo salar), estaba congelada fresca esperma con una motilidad de 70-95% utilizando diferentes crioprotectores (DMSO y metanol). La movilidad de los espermatozoides tras la descongelación fue significativamente menor que en muestras frescas, con valores de motilidad en el mejor protocolo de 8,2%, y tasa de fertilización con semen descongelado fue tan alta como el 42,8%, lo que representó el 95% del control (espermatozoides frescos) 31. En un estudio diferente con el esperma de fletán del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus), ninguna reducción significativa en la motilidad espermática fue encontrada después de la criopreservación y tasa de fertilización con semen descongelado fue superior al 95% 32.
En anguila europea, estudios anteriores mostraron también una reducción en la motilidad espermática después de criopreservación independientemente el crioprotector utilizado 16,18. Además, espermatozoides criopreservados de anguila europea de calidad similar se ha utilizado con éxito para fertilización 8. En ese estudio, el Asturiano et al usaron DMSO como el crioprotector. El uso de DMSO tiene algunas desventajas de la manipulación ya que este crioprotector activa los espermatozoides y por lo tanto debe ser congelada inmediatamente a la adición de DMSO. También, inseminación con semen descongelado debe ser realizado inmediatamente después de descongelarla. La disminución del pH del esperma puede resolver parcialmente este problema 19, pero el protocolo es más delicado que el protocolo presentado aquí con metanol como crioprotector.
Varios estudios han demostrado resultados positivos utilizando metanol como el crioprotector. Por ejemplo, en un estudio realizado con anguila japonesa (Anguilla japonica) utilizando un protocolo muy similar a la que aquí se presenta, con metanol al 10% como crioprotector, los autores con éxito huevos fertilizan con espermatozoides frescos y criopreservados. En este estudio, obtuvieron las tasas de fertilización del 17% sin diferencias significativas entre espermatozoides frescos y criopreservados 33.
El protocolo presentado aquí ha demostrado preservar la calidad del esperma suficiente después de descongelar y muestran características similares de esperma después de la descongelación que protocolos utilizando diferentes diluyentes y crioprotectores, pero con las ventajas de la fácil manipulación y la criopreservación. Es muy importante seguir con precisión el enfriamiento y descongelamiento veces descritos aquí como usando esperma de alta calidad. En futuros estudios, ensayos de fertilización se probarán mediante este protocolo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Esta publicación fue financiada por la investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación del programa bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie No 642893 (IMPRESS), la oficina de costo (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) y el centro de investigación de excelencia- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
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