Summary
İletişim kuralları Avrupa yılan balığı olgunlaşma ve sperm dondurma için son yıl içinde geliştirilmiştir. Bu makalede, en iyi Protokolü olgunlaşma ve cryoprotectant olarak metanol inducing için insan Korionik gonadotropin (hCG) kullanarak kullanılabilir.
Abstract
Son yıllarda birkaç araştırma grubu geliştirme ve iyileştirme Avrupa yılan balığı kullanım ve olgunlaşma için yeni iletişim kuralları üzerinde çalışıyoruz. Derecede-in henüz, insan Korionik gonadotropin (hCG) haftalık enjeksiyonlari tedavi sırasında birkaç hafta yüksek miktarlar yüksek kaliteli Sperm üreten, sadece 5-6 hafta sonra erkek maturate kanıtladılar. Buna ek olarak, sperm dondurma farklı Extender kullanarak iletişim kuralları, cryoprotectants ve soğutma ve kez çözme daha önce için Avrupa yılan balığı tarif edilmistir. İşte, Tanaka´s extender çözüm doğrudan veya dondurma, gübreleme için kullanılabilir çözümler ve dilutions farklı kullanımı gereksiz yapma göstermektedir. Gibi metanol düşük toksisite ve sperm etkinleştirmez Ayrıca, bir cryoprotectant olarak metanol kullanımı bu iletişim kuralı kullanımını kolaylaştırır. Sperm cryoprotectant eklenmesinden sonra hemen cryopreserved gerekmez ve uzun çözdürülen sonra kullanılabilir. Ayrıca, sperm motilitesi taze sperm daha düşük olmasına rağmen çözdürme sonra hala yüksektir. Bu çalışmanın amacı, Avrupa yılan balığı için en iyi kullanılabilir iletişim kuralı işleme, olgunlaşma ve sperm dondurma göstermektir.
Introduction
Son 25 yılda Avrupa sahilde gelen Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla) sayısı % 90 1,2,3tarafından giderek düştü. Kirliliği, enfeksiyonlar, aşırı avlanma ve habitat imha da dahil olmak üzere bu köklü damla açıklamak çeşitli faktörler vardır. Bunların hepsi Uluslararası Birliği için doğa koruma (IUCN) listesi olarak kritik tehlikedeki 4Tarih Avrupa yılan balığı eklenmesi için önde gelen bu tür üzerinde derin bir etkisi olmuştur. Sonuç olarak, geliştirme teknikleri ve protokolleri esaret üreme için gerekli.
Avrupa yılan balığı olgunlaşma tutsak hormonal tedavi 5,6,7 tarafından elde edilir ama her iki cinsiyette gamet üretim 8eşitlemek zordur. Yılan balıkları 9,oogenesis hızlandırmak için yeni androjen implantlar geliştirilmesi göstermiştir10, dişilerde son olgunlaşma zamanlaması hala son derece değişken ve 11kontrol etmek zor olsa bile. Bu nedenle, kısa süreli depolama sperm 12,13,14 ve dondurma teknikleri gamet eşitleme gereksiz 8yapma üreme yönetimi için gerekli.
Avrupa yılan balığı sperm dondurma 2003 15,16beri geliştirmiştir. Çeşitli araştırmacılar Dimetil sülfoksit (DMSO) veya metanol cryoprotectants 16,17,18,19,20kullanarak başarılı iletişim kuralları tasarlanmış. Her ne kadar her iki iletişim kurallarını başarıyla kullanmış, DMSO ile cryopreserved çözdürülen sperm elde edilen hücre canlılığı metanol 20,21ile daha düşüktür. Ayrıca, yılan balığı sperm DMSO ile temas harekete geçirmek ve daha sıkıcı sperm manipülasyon 19gerektirir, bu nedenle metanol DMSO daha Avrupa yılan balığı sperm için daha uygun bir cryoprotectant.
Burada, en uygun kullanım ve Avrupa yılan balığı hormonal tedavi için protokol aşağıda açıklanacaktır. Buna ek olarak, metanol bir cryoprotectant ve bir iletişim kuralı bu türler içinde sperm kalitesinin değerlendirilmesi için en iyi Avrupa yılan balığı sperm dondurma iletişim kuralı'nı da açıklanan olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için açıklanan Avrupa yılan balığı ile çalışmak için tüm yordamları hayvan deney Etik Komitesi, İspanyol yasa ve yönetmeliklere deneyler kontrol takip Universitat Politècnica de València tarafından kabul edildi ve canlı hayvan işlemler.
1. balık bakım
- Avrupa yılan balığı bir araştırma tesisine getir ve onları bir devridaim sistemi ile 200 L aquaria koyardım. Termostatlar ve soğutucular bir sabit 20 ° C sıcaklık sürdürmek için kullanır.
- Balık tutmak stres22 önlemek için karanlık koşullarda ve yiyecek olmayan deneme sırasında.
- Balık temiz suda ilk 3 gün boyunca tut. Sonra 1/3 su değiştirin ve her geçen gün bir tuzluluk 37,0 ± ulaşan kadar deniz suyu ile dolum 0.3 g/l
2. hormonal tedavi
Not: Hormonal tedavi deneme tüm süresi (9 aylık) insan Korionik gonadotropin (hCG) haftalık enjeksiyonlari oluşur.
- Tuzlu çözelti içinde hormon sulandrarak hCG hormonu 1 IU/µL bir konsantrasyon, önceden hazırlamak (% 0.9 NaCl).
Not: Bu konsantrasyon için yere a hafta-18 ° C'de, seyreltilmiş hormon korunabilir - Balık anestezi 5 L ile 40 L esnek kova sistemi su hazır olun.
- 250 mL şişeye 300 mg 100 ml % 70 etanol benzokain sulandırmak.
- Kova içinde seyreltilmiş benzokain dökün (son konsantrasyonu 0,36 mM) ve düzgün karıştırın. 60 mg/l son benzokain konsantrasyon için bu
- Balık, tek tek, suya benzokain ile aktarmak ve benzokain etkin olur ve balık düzgün anestezi kadar birkaç saniye bekleyin.
Not: balık anestezi onaylamak için balık sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve hala o konumda kalır kontrol edin.
- Hormon yönetmek için balık tartmak ve 1,5 IU/g balık, 1,5 mL plastik tüp bir doz, hCG hormonu hazırlamak.
- HCG hormonu plastik tüp ile 1 mL şırıngaya doldur.
- Sırtüstü pozisyonda ve yardım veya şırınga ile imzalat balık yerleştirin, mayi bölgesinde özenle hormon enjekte.
- Balık akvaryumlar için dönün ve onu tamamen iyileşti kadar izlemek.
Not: Haftalık deney boyunca yapılacak hormonal yönetim vardır. Normalde, Avrupa yılan balığı spermating hormonal tedavi 6-7 hafta sonra başlar.
3. sperm örnekleme
- En iyi kalite örneklerini almak için sperm 24 saat sonra hormonal yönetim6,23ayıklayın.
- Benzokain balıkla 2.2 adımda anlatıldığı gibi anestezi.
- İmzalat balık sırtüstü pozisyonda yerleştirin, bir su distile su ile genital bölge temiz ve dikkatli bir şekilde aquaria gelen deniz suyu ile temas dışkı kirlenmesini genital bölge veya kaza sonucu sperm harekete geçirmek bulunmasını önlemek için kağıt ile kuru.
- Parmakları balık her iki yan tarafta yerleştirerek, dikkatle yanal göğüs yüzgeçleri için genital bölge sperm dışarı zorlamak için tuşuna basarak masaj.
- Yok daha fazla sperm genital açılışa gelene masaj yineleyin.
- Sperm bir vakum pompası ile 15 mL plastik tüpler içine toplamak.
- Değiştirilmiş Tanaka´s extender çözüm24 (137 mM NaCl, 76.2 mM NaHCO3, distile su içinde) ayıklanan sperm 1:10 4 ºC sulandırmak.
Not: 4 ºC extender çözüm sperm saklanması gerekebilir.
4. sperm kalitesi değerlendirme
- Yapay deniz suyu13 hazırlamak (mm: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, distile su içinde) % 2 sığır serum albümin ile (BSA) (w:v), pH 8.2, osmolalite 1100 mOsm/kg için ayarlamak ve sürdürmek Bakteriyel büyüme önlemek için 4 ºC bunda.
- Bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) yazılımı açın ve balık sperm modülü seçin.
- Yazılım Sistem Kurulum açmak için Özellikler ' i tıklatın. Orada, saniyede 60 kare, yakalama seçeneklerini ayarlayın. Seçme negatif faz optik, Makler odası ve 10 X ölçeği.
- Sonra analiz değerleri üzerinde balık türleri ve parçacıklar alan 2 µm2 ' den daha büyük ve 20 µm2' den daha küçük seçin.
- Hücreleri 10 ila 45 µm/s arasında taşıdığınızda, 45 ila 100 µm/s arasında taşırken Orta olarak ayarlayın ve hızlı için 100 µm/s daha hızlı hareket ederken ayarla hız parametreleri üzerinde yavaş için ayarlayın.
Not: Sperm hızı 10 µm/s yavaş immotile kabul edildi. - Doğruluk (STR) % 80'i aşamalı değerleri seçin ve özelliklerini kaydedin.
- (Kameradan canlı görüntü içeren bir pencere açılacak) Yakalama alanı tıklatın.
Not: Bilgisayar destekli sperm analizi sistemi mikroskop, bir kamera ve görüntü analiz yazılımı tarafından oluşturulur.
- Sayım odası, yapay deniz suyu 4 µL koymak ve sperm çözüm (sperm extender çözümde seyreltilmiş) 0.5 µL ekleyin.
- 10 X büyütme negatif faz, mikroskop ile görüntü odak. 15 s harekete geçirmek sonra bilgisayar destekli sperm analiz yazılımı tıklatın - video yakalayabilir .
- Dondurma için % 70 daha yüksek bir hareketliliği ile her örnekte onaylatılacak ve seçkin örnekleri analiz.
Not: Sadece yüksek kaliteli sperm bu dondurma Protokolü başarısı için seçmek çok önemlidir.
5. sperm dondurma yöntemi
- Önceden sıvı azot (yaklaşık 2.5 L) bir 34 cm x 34 cm x 30 cm ve 5 cm kalın strafor kutu hazırlayın.
Not: bir sıvı azot 4-5 cm yüksekliği her zaman tutması.- Önceden sperm dondurmak için kayan bir yapı inşa. Polistiren (20 cm x 5 cm) 2 adet kullanma, 2 plastik tüpler ile bağlamak ve yapısı üzerinde sıvı azot yer. Bu yapı bir yaklaşık yüksekliği 3 cm (şekil 1) yüzey üzerinde sıvı nitrojen içinde float gerekiyor.
Resim 1 . Şematik sıvı azot içinde önceden dondurma için kullanılan kayan yapısının çizim. Düşük yoğunluklu köpük 20 cm x 4 cm x 5 iki adet yapı oluşur cm 14 cm plastik tüpler ile bağlı. Payet sıvı azot içinde 3 cm'de plastik tüpler üzerine yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Dondurma çözüm sperm, extender çözüm ve metanol oranı 1, karıştırarak hazırlayın: 8:1 1,5 mL plastik tüpler ve hafifçe karıştırın.
- Bir pipet yardımıyla dondurma çözüm 480 µL 500 µL payet ekleyin ve gerekiyorsa onları kil modelleme ile bir ucunu kapatarak işaretleyin.
- 3 min için sıvı azot içinde 3 cm yükseklikte aygıt kayan saman koymak. O zaman, saman sıvı azot yerleştirin.
- 10-15 dk sonra payet uzun forseps kullanarak bir sıvı azot depolama tankı aktarmak ve sıvı azot içinde her zaman sular altında tutun. Burada, sperm süresiz olarak depolanabilir.
6. çözme yöntemi
- Sıvı nitrojen içeren bir Styrofoam kutusu 5.1 adımda anlatıldığı gibi ve musluk suyu 40 ºC, 3 L kabı kullanarak bir su banyosu hazırlayın.
- Dondurulmuş sperm ile çöp depolama tankından uzun forseps kullanarak sıvı azot ile Styrofoam kutusu aktarın.
- 13 40 ºC, bir su banyosu içine her saman koymak s.
- Sperm saman kapalı uçlarını makasla keserek 1,5 mL plastik tüpün içine dökün.
- 4.1. adımda açıklandığı gibi bilgisayar destekli sperm analizi sistemi kullanarak sperm motilitesi analiz.
- Sperm canlılığı sperm bir Akış Sitometresi ile analiz etmek için 100 µL tutun.
7. Akış Sitometresi
- Ölü hücreleri çekirdekleri lekeleri kırmızı bir floresan bileşik ve yeşil yaşam hücre çekirdekleri lekeleri bir membran permeant nükleer floresan bileşik propidium iyodür (PI), içeren bir floresan setini kullanın.
- Yeşil flüoresan boyama çözüm bu hisse senedi çözüm (1 mM) 1:10 Tanaka´s ortamda 100 µM çalışan bir çözüm için sulandrarak hazırlayın.
- PI çözüm sulandırmak değil. 2.4 mM hisse senedi çözümdür.
- Her örnek için 50 µL taze veya çözdürülen sperm alın ve yeşil floresan çalışma çözüm (son konsantrasyonu 1 µM) Boyama 0.5 µL ekleyin ve 2 µL PI çözüm (son toplama 100 µM).
- 5 min için karanlıkta boyalar (PI ve yeşil flüoresan boyama) içeren örnekleri kuluçkaya.
- Tanaka´s extender çözeltinin 500 µL örneklerinde sulandırmak ve Akış Sitometresi ile analiz.
- Akış Sitometresi açmak ve en az 2 araziler içeren yeni bir iletişim kuralı oluşturun: SS günlük vs FS günlük ve FL1 vs FL3.
Not: her iki, yeşil flüoresan boyama ve propidium iyodür dalga boyu görünür ışık ile heyecanlı. DNA'yı bağlandığında, bu boyalar en fazla Floresans emisyon vardır 516 nm ve 617 nm, anılan sıraya göre.- Gerilimleri farklı lazer ayarlamak: SS 199; = FS = 199; FL1 377; = FL3 = 372
- Satın alma ayarları accord maksimum olaylara ayarlayın = 5000 ya da 15 s (örnek son konsantrasyonu yaklaşık 1 milyon hücre/ml olmalıdır). Düşük akış kullanarak örnek okuyun.
- Okuma modu tek tüp sabit pozisyon moduseçin.
- Atlıkarınca doğru sayıda örnek koymak
- (F9'a basarak) örnek okumak ve daha fazla analiz için (F7 tuşuna basarak) bir excel dosyası için toplanan verileri kaydetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spermi ile % 70 veya daha yüksek, sperm motilitesi 18 yılan balıkları bu çalışma için seçildi. Çözdürme için taze sperm (Tablo 1 ve Şekil 2) insanlardan karşılaştırıldığında sonra sonuçları tüm kalite parametreleri bir azalma gösterdi. Hareketliliği sonuçları (yani ± S.E.M., n = 18) daha yüksek toplam hareketliliği ve ilerici bir hareketliliği toplam hareketliliği ve ilerici hareket sonrası tezcan sperm örnekleri buldum daha taze sperm gösterdi.
Aynı desen nerede taze örnekler daha hızlı hücre oranı daha düşük dondurulmuş çözdürülen örnekler sunulan hızlı sperm hücrelerinin analizinde bulundu. Buna ek olarak, ölçülen sperm hücresi hızları da sonra çözülme örneklerinde azaltıldı.
Ayrıca, sonuçlar gösterdi o hücre canlılığı canlı sperm hücreleri bir azalma 23 ± % 3.1 sunulan çözdürme sonra (yani ± S.E.M., n = 18) taze dondurulmuş çözdürülen için örneklerinden (Tablo 1 ve Şekil 2).
Resim 2 . Hareketliliği, eğrisel hız ve hücre canlılığı veri taze sperm ve çözdürülen sperm (sonra dondurma). Sperm çözdürülen önce 24 saat cryopreserved. Sunulan değerler şunlardır: anlamına gelir ± S.E.M. sperm 18 örneklerinden. Yıldız çözdürülen ve taze örnekleri arasında önemli farklılıklar gösterir (t-Testi; p < 0,05). Parametre hareketliliği toplam hareketli sperm, sperm eğrisel bir yörünge boyunca ortalama hız hız gösterilir ve hücre canlılığı canlı sperm yüzdesi gösterilir eğrisel yüzdesi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hızlı + orta hücreleri1 (%) | 70.7 ± 2.8 | 27,5 ± 2.1* |
| Eğrisel hız (VCL; µm/s) | 118.8 ± 2.8 | 101.5 ± 1.8* |
| Çizgisel hız (VSL; µm/s) | 53,3 ± 1.9 | 45.6 ± 1.3* |
| Ortalama yol hız (VAP; µm/s) | 73.3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| Frekans (Hz) dayak | 27,9 ± 0,3 | 27.1 ± 0,6 |
| Hücre canlılığı (canlı hücrelerin %) | 97.7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Eğrisel hızı 40 µm/s yukarıda gösterilen hücreleri. | ||
Tablo 1. Özet farklı parametrelerden biri bilgisayar destekli sperm analizi sistemi üzerinden taze ve çözülmüş örnekleri ile analiz sonuçlarının. Çözülmüş örnekleri daha önce 24 saat cryopreserved. Demek olarak ± S.E.M. sunulan tüm değerleri (n = 18). Yıldız çözdürülen ve taze örnekleri arasında önemli farklılıklar gösterir (t-Testi; p < 0,05). Analiz Parametreler: Toplam hareketli hücreleri; yüzdesi olarak tanımlanan hareketli sperm elde ilerici motilite sperm yüzdesi olarak tanımlanan bu ileri aslında düz bir çizgide yüzmek; hızlı ve orta yukarıda 40 µm/s ortalama bir eğrisel hız ile sperm elde yüzdesi olarak tanımlanan hücreleri; Bir spermatozoon eğrisel yörüngesini üzerinden ortalama hız olarak tanımlanan eğrisel hız; Bir spermatozoon ortalama hız tanımlanan düz çizgi hız düz bir çizgide son konumuna ilk algılanan pozisyondan ölçülür; Bir spermatozoon kayma ortalama yörüngesini boyunca ortalama hız olarak tanımlanan ortalama yol hız; çapraz frekans yenerek, ortalama yolu yörüngesini eğrisel sperm kafa yörünge haçlar bedelinin ortalama tanımlanan; hücre canlılığı canlı sperm yüzdesi olarak tanımlanmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı için Avrupa yılan balığı olgunlaşma, işleme ve sperm dondurma tam işlemini açıklar. Burada açıklanan yetiştirme koşulları hızlı olgunlaşma ve yüksek kaliteli sperm bu tür 6,7,25yüksek hacimli üretim için en iyi durumda. Başarısı bu dondurma Protokolü ve potansiyel kullanımı çözdürme sonra gübreleme için taze sperm 26kalitesini büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, yüksek kaliteli sperm seçimi büyük önem taşıyor. Öznel sperm kalitesi değerlendirme becerileri, algı ve eğitim örnekleri 5,27,28 değerlendirir ve bağlı olarak çok farklı kalite tahminler yol açabilir araştırmacının bağlı olduğuna dikkat edin araştırmacı 29. Bu nedenle, bilgisayar destekli sperm analizi kullanımı dondurma için en iyi kalite örnekleri seçmek için önerilir.
Sonuçları sunulan sonrası çözülme sperm kalitesini burada hareketliliği, hız ve hücre survival parametrelerinde bir azalma gösterdi. Türler 26,30arası büyük değişim var olsa bile bu kullanılabilir bibliyografya ile tutarlıdır. Örneğin, Atlantik somon (Salmo salar) ile bir çalışmada, farklı cryoprotectants (DMSO ve metanol) kullanarak taze sperm hareketliliği 70-%95 ile donmuştu. Çözdürme sonra sperm motilitesi önemli ölçüde daha düşük % 8.2, iyi Protokolü hareketliliği değerleri ile taze örneklerinde henüz çözülmüş sperm kullanılarak fertilizasyon oranı yüksek denetim (taze sperm) %3195'i temsil %42.8. Atlantik pisi balığı (Hippoglossus hippoglossus) sperm ile farklı bir çalışmada sonra dondurma sperm motilitesi önemli hiçbir azalma tespit edildi ve döllenme oranı çözdürülen sperm kullanılarak yapıldı üzerinde % 95 32.
Sonra 16,18dondurma cryoprotectant bağımsız olarak kullanılan Avrupa yılan balığı, önceki çalışmalarda sperm motilitesi bir azalma gösterdi de. Ayrıca, benzer kalite Avrupa yılan balığı cryopreserved sperm fertilizasyon 8için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu çalışmada, Asturiano ve ark. DMSO cryoprotectant kullanılır. Bu cryoprotectant sperm etkinleştirir ve bu nedenle hemen DMSO eklenmesi dondurulmuş olması gerekiyor beri DMSO kullanımı bazı manipülasyon dezavantajları vardır. Ayrıca, tohumlama çözdürülen sperm ile hemen çözdürme sonra yürütülen gerekir. Sperm pH azalması kısmen bu sorun 19çözebilir ama protokol daha burada cryoprotectant olarak metanol ile sunulan Protokolü daha hassastır.
Çeşitli çalışmalar olumlu sonuçlar cryoprotectant metanol kullanarak göstermiştir. Örneğin, burada, cryoprotectant, olarak % 10 metanol ile sunulan bir çok benzer bir iletişim kuralı kullanılarak Japon yılan balığı (Anguilla japonica) ile yürütülen bir çalışmada yazarlar başarılı bir şekilde taze ve cryopreserved sperm kullanılarak yumurta döllenmiş. Bu çalışmada, %17 taze ve cryopreserved sperm 33arasında önemli bir fark yoktur ile fertilizasyon oranları elde ettiler.
Burada sunulan Protokolü çözdürme sonra yeterli sperm kalitesini korumak ve farklı Extender ve cryoprotectants kullanarak iletişim kuralları daha, ama kolay kullanım öncesi avantajları çözdürme sonra benzer sperm özellikleri göstermek için kanıtlamıştır ve sonrası dondurma. Soğutma ve burada açıklanan kez çözdürme yanı sıra yüksek kaliteli sperm kullanılarak doğru bir şekilde takip etmek çok önemlidir. Gelecek çalışmalarda, gübreleme denemeleri bu iletişim kuralını kullanan test edilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu yayın Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma tarafından finanse edildi ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 642893 (IMPRESS), maliyet Office (maliyet eylem SK 1205, AQUAGAMETE) ve mükemmellik Araştırma Merkezi- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
