Summary
여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.
Abstract
조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.
Introduction
조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)1, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)2 . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,2를 생성 하는. 식별 하 고 이러한 창시자 분리 중요 한 분자 경로 식별 조 혈 분화에 관련 된 있으며이 조상 세포를 제대로 하지 못할 때 발생 하는 백혈병 등 많은 조 혈 질환 차별화.
지난 몇 년간 zebrafish (Danio rerio) 모델 시스템 배아 및 성인 조 혈 연구에 대 한 주요 연구 도구 되고있다. Zebrafish 순종 유전자 분석 하 고 비슷한 맥 관 구조와 인 간에 게 조 혈 시스템 phylogenetically 낮은 척추 모델 종. Zebrafish 태아 전 utero, 개발 하 고 48 시간 게시물 내 수정 (hpf) 생성 HSPCs3,,45,6,,78. Zebrafish는 또한 높은 다 산, 여 성과 단일 클러치에 100 달걀에 누워 큰 샘플 크기와 실험적인 복제 허용. Zebrafish 태아는 광학 투명, 조 혈 시스템의 미세한 시각화에 대 한 허용 합니다. HSCs runx1같은 표시 zebrafish의 여러 형광 유전자 변형 라인: EGFP 물고기9, cd41: EGFP 물고기10및 kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 더블 양성 동물, HSC 출현과 확장 vivo에서3,4,7,8,의 라이브, 실시간 시각화를 위한 허용 9. Zebrafish의 빠른 생성 시간 및 개발 utero 전 을 주도하 고 있다 mutagenesis 연구11,12,13,,1415 에 약물의 사용 16,17,18,,1920 인간의 혈액 질환에 대 한 치료 약속을 잡고 화합물에 대 한 검사. 전반적으로, 조 혈 시스템, 존재의 유전자 변형, 선과 빠른 재생 시간을 쉽게 개발의 보존이 했다는 제 브라는 저렴, 신속 하 고, 유연 하 고 이상적인 조 혈 연구에 대 한 모델을.
포유류 조 혈 시스템에서 분리 하 고 테스트 HSCs의 수많은 방법이 개발 되었습니다. 수사 경과 염료25,26에 HSCs의 능력을 악용 뿐만 아니라 마크 HSCs21,22,,2324, 세포 표면 수용 체의 결합을 이용할 수 있다. 후에 그들은 분류는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 그들의 물리적 분리 수 있습니다. 셀은 HSC 임을 증명 해 내 생 HSPCs, 상 상속 HSCs, 이식 장기, 다중 계보 재구성 모든 혈액 세포 유형 성숙 관찰 하 고 파괴 하는 호스트 동물 필요 합니다. 조 혈 모 세포 및 면역 이식에 대 한 일치를 촉진 하는 타고 난된 마우스 긴장에 대하여 수많은 세포 표면 항 체는이 분석 실험 쥐에서 잘 작동 합니다. 그러나, 몇 가지 zebrafish 조 혈 모 세포 표면 항 체 생성 된27, 식별 및 격리 HSCs의 방해 되었습니다. Zebrafish HSCs를 분리 하 고 하는 가장 일반적인 방법은 유전자 변형 동물, 그것에 의하여 셀 특정 발기인 순서 운전 형광 단백질의 표정은. 연구 시각 있고이 기술을3,4,,89를 이용 하 여 현미경으로 등 쪽 대동맥의 복 부 벽에 HSCs를 열거. 다른 실험실 zebrafish28,29 의 클론 변종 생성 하 고 일치 하는 MHC 동물30성공적인 이주를 수행 했습니다. 그러나, 이러한 기술은 비용 많은 실험실에 금지, 기술적으로 어려운 이며 시간이 소요. 이러한 문제를 해결 하기 위해 실험실 여러 생체 외에서 분석 실험을 존재, 확산 속도, 그리고 HSPCs31,,3233의 분화 능력에 대 한 테스트 생성 34,,3536. 이 분석 실험 쇼 확산 및 HSPCs 시험관에31,32,33,,3435,36의 구조의 차별화 조 혈 결함36, 그리고 발견 하 고 cytokines33,,3435테스트는 효율적인 방법. 그들은 또한 유전자 HSPC 생물학31,32에 대 한 책임을 식별 하기 위해 활용 되었습니다. 이 연구에서 우리 걸릴이 분석 한 단계 더 나아가, 발전 zebrafish 태아에 있는 HSPCs의 정량 수 있도록. 이 분석 실험 또한 돌연변이 동물에 HSPCs의 수를 quantitate에 이용 될 수 있다 고 동물 조 혈 파괴 약물 치료. 본질적으로,이 분석 실험은 빠르고, 현재 몇 가지 기술 과제, 되며 quantitate HSPC 숫자, 그들의 확산을 시험 하 고 차별화에 블록을 조사 하는 저렴 한 방법.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.
1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아
- 와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는지 확인 하십시오.
참고: 테스트 각 조건에 대해 적어도 10 배아 필요할 것 이다. 이 세척 절차는 최대 200 배아를 수용할 수 있습니다. - 전송 피 펫과 배아 차 여과기에 놓고 5 분 (내부 배아)와 차 여과기를 제거 하 고 세척 역 5 분;에 대 한 # 2에 대 한 세척 역 # 1에에서 계란을 잠수함 마지막 5 분 동안 세척 역 # 3를 반복 합니다.
- 마지막 세척 후 깨끗 한 10 cm 배양 접시에 거꾸로 그것을 선회 하 고 부드럽게 배아를 rinsing 하 여 차 여과기에서 린스 배아에서 살 균 e 3와 차 여과기 및 전송 피 펫.
2. Dechorionate 배아
- 전송 피 펫와 함께 제거와 페 트리 접시에서 가능한 많은 e 3를 삭제 하 고 추가 dechorionation 프로 테아 제 (10mg/mL)의 500 μ 배아. 5 분 부드럽게 누릅니다 완전히 제거 하는 chorions를 페 트리 접시의 측면에 대 한 실 온에서 품 어.
- 혈 청 학적인 피 펫으로 메 마른 E3 효소 희석의 20 mL를 추가 합니다. 정착, 배아를 허용 하 고 전송 피 펫으로 E3를 제거 합니다. 3 번 dechorionation 효소의 모든 흔적을 제거 하려면이 세 단계를 반복 합니다.
3. 배아 샘플 준비
- P1000 피 펫을 사용 하 여 단일 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 10 배아를 놓습니다.
- 피 펫과 e 3를 제거 하 고 삭제.
주의: 플라스틱 주의 배아 수 쉽게 전치 하 고 다음 세척 단계 삭제.
4. 배아를 분리에 대 한 준비
- 층 류 두건에 샘플을 전송 하 고 1 mL을 추가 하 여 태아를 씻어 살 균 E3. 배아 튜브의 하단에 정착 하 고 상쾌한 P1000 피 펫과 제거를 허용 합니다. 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다.
- 마지막 세척 후 e 3를 제거 하 고 삭제 합니다. E3 점액 코팅 (및 포자, 효 모, 또는 박테리아에 갇혀 있을 수 있습니다) 배아 zebrafish를 둘러싼 제거 하에 10 m m dithiothreitol (DTT)의 1 mL를 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브 가로로 층 류 두건은 25 분에 실 온에서 품 어.
5. 배아 분리
- 샘플 3 번 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 살 균 DPBS의 1 mL로 씻는 다. 마지막 세척 후 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 DPBS의 500 μ를 추가 하 고 추가 5 mg/mL (26 U/mL) 분리 효소의 5 μ.
주의:이 효소 필요 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그래서는 DPBS 이러한 이온을 포함 하는 것을 확인 하십시오. - 층 류 두건에서 60 분 장소 샘플에 대 한 180 rpm에서 수평 궤도 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어와 샘플은 완전히 해리까지 한 P1000와 배아를 triturate.
주의: 주기적으로 그들은 해리 될 때 결정 하는 배아를 확인 합니다. 배아 솔루션 있어야 어느 정도의 조직. 그것은 완전히 동질적인 해서는 안됩니다. 수-다이제스트 ( 보충 그림 1참조) HSPCs 파괴 됩니다.
6입니다. 천연된 배아의 준비
- 5 mL 폴리스 티 렌의 최고 저수지에 피 펫 10 해리 배아 라운드 35 μ m 셀 스 트레이너 캡 하단 튜브.
- 피 펫와 린스 (Ca2 + 나 가진 Mg2 +) 살 균 PBS와 전송 솔루션 5 mL를 포함 하는 폴리스 티 렌 관을 배양 튜브 단계 6.1에서에서 셀 필터링. 액체의 4 mL 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 존재 하는 때까지 반복 합니다.
참고: PBS, DPBS, 또는 다른 isotonic 버퍼 솔루션 사용할 수 있습니다이 단계에서 그들은 포함 되지 않은 Ca2 + 또는 Mg2 + 로 - 4 ° C와 5 분 무 균된 셀 샘플을 펠 렛 300g x 튜브 원심 피 펫, 제거와 상쾌한 라운드 하단 튜브에서 삭제. 튜브의 하단에 수송과 세포를 방해 하지 않는 주의 하십시오. PBS의 100 μ 셀 resuspend
7입니다. 스 준비
- 완전 한 스 (표 1) 재고 솔루션 x 1을 생성 하 고 메 마른 라운드-하단 14 mL 튜브 3 mL 주사기와 바늘 16 G 2.5 mL을 추가. 한 튜브를 사용 하 여 테스트 하는 각 조건에 대 한.
-
Cytokines, 작은 분자, 또는 다른 에이전트 각 샘플에 조사를 추가 합니다.
- 골수성 차별화에 대 한 1% 잉어 혈 청 및 0.3 mg/mL 재조합 zebrafish granulocyte 콜로 니 자극 인자 (Gcsf)34 스 매체를 추가 합니다. 참조 Svoboda 외. 37 잉어 혈 청 및 재조합 cytokines 생성 하는 방법에 전체 설명
- Erythroid 차별 화를 위한 스 보통 1% 잉어 혈 청 및 0.1 mg/mL 재조합 zebrafish erythropoietin (Epo)38 을 추가 합니다.
- Multilineage 창시자 검사, Epo, Gcsf를 추가 합니다.
주의: Cytokines 및 첨가제 해야 하지 총 총 볼륨의 10% 이상으로 매체 개별 식민지 분별 충분히 점성 되지 않습니다.
8입니다. 스 천연된 배아의 추가
- 피 펫을 사용 하 여, 재조합 cytokines와 잉어 혈 청을 준비 스의 표면에 해리 10 태아의 100 μ를 추가 합니다. 캡 뚜껑 하 고 완벽 하 게 균질 샘플을 부드럽게 소용돌이. 각 튜브는 이제 10 배아의 천연된 조직이 있어야 합니다.
- 3 mL 주사기와 바늘 16 G, 2 별도 35 mm 페 트리 접시에 샘플의 aliquot 1 mL을 사용 하 여. 샘플 페 트리 접시에 걸쳐 완전히 분산 된 다는 것을 확인 하십시오. 각 샘플에 대해 반복 합니다.
- 15 cm 배양 접시에 스에 셀 35 m m 접시를 놓습니다. 각 15 cm 접시 한 35mm 페 트리 접시를 샘플 축이다 살 균 물 5 mL를 추가 합니다. 7-10 일 동안 32 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
9. HSPC 파생 된 콜로 니 형성 단위 (CFUs)의 시각화
- 7 일 잠복기 후 시각화 및 열거형에 대 한 40-100 X에는 거꾸로 한 현미경에 샘플을 배치 합니다. 이 시점에서 개별 식민지 절연 한 피 펫을 하 고 얼룩 및 유전자 분석 대상이 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산의 종류를 제어할 수 있습니다: Epo erythroid 차별 화를 위한 필요는 및 Gcsf는 골수성 차별화 필요. 혈 청 잉어는 태아 둔감 한 혈 청의 사용 포유류 조직 문화; 그것은 일반적인 성장 요인의 소스입니다. 그림 1, Epo, Gcsf, 및 잉어 세럼 추가 되었다, erythroid, 골수성, 및 혼합 erythromyeloid 식민지의 열거를 허용. 이 식민지는 그들의 모양 및 색상; 분별 수 있습니다. erythroid 식민지, 작은, 소형, 고 hemoglobinization 때문에 붉은 색. 골수성 식민지 큰 고 그들에 게 뻗 치고 외관을 주는 그들의 가장자리에 더 많은 운동 세포.
성공적인 치료 배아 zebrafish의 도금 HSPC 지지 요인 것 이다 산출 CFUs 외피의 7-10 일 후 됩니다. 중요 한 것은, CFUs의 수량 배아 도금 (그림 1B)의 수와 직접 상관 한다. (이 실험의 시작 부분에 10 또는 20 배아와 시작에 연결) mL 당 4 또는 8 배아를 도금은 각각 약 1200 또는 2400 CFUs를 생성 합니다. 우리의 프로토콜 제안 10 배아를 사용 하 여 그것이 어렵고 시간이 걸리는 큰 실험을 수행할 때 2400 CFUs 계산 합니다. 전체 배아 소화의 방법론 때문 기타 파편에 스, 하지만 쉽게 현미경 아래 높은 확대와 함께 실제 식민지에서 분별 수 있습니다. 다른 세포질 파편도 있을 수, 있지만 현재 유일한 CFUs HSPC 지원 cytokines의 추가 때문 HSPC 파생 됩니다. CFUs 작고 쉽게 볼 인 경우 10 일 증가 성장을 촉진 하는 문화까지 incubated 수 있습니다. 그러나, 증가 부 화 더 CFUs; 항복 하지 않을 CFUs 존재 하지 않는 경우이 태아의 소화에 cytokine 활동의 손실을 나타냅니다 (HSPCs;의 후속 파괴 하 고 보충 그림 1참조), 또는 샘플의 부적 절 한 도금. 그것은 항상이 실험 기술에 약간의 변화가 HSPC 열거형에 잘못 된 차이점을 양보 하지 보장 하기 위해 수행 됩니다 때마다 적절 한 컨트롤을 실행 하는 것이 중요. 예를 들어 HSPCs에 morphant 배아의 수를 분석 하는 실험을 수행 하는 경우 정상적인 형제와 함께 샘플 함께 준비 되어야 한다. HSPCs의 개발에는 약의 효과 비교 하는 실험 수행 치료 형제와 예제를 준비 하 고 함께 분석 한다.
그림 1: 48 hpf zebrafish 태아에서 CFUs 열거 HSPC 파생. (A) CFUs 조 혈의 생성에 대 한 HSPC 지원 cytokines와 스에 배아 도금의 도식 개요. 48 hpf zebrafish 태아 해리 되었고 erythropoietin (Epo), granulocyte 콜로 니 자극 인자 (Gcsf), 및 erythromyeloid 차별화 수 잉어 세럼 1% 완전 한 스에 도금. (B) (시작 실험 10 또는 20 배아, 각각) mL 당 4 또는 8 배아의 농도에서 도금 샘플에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 열거입니다. 열거형에는 거꾸로 한 현미경 X 100에서 이루어졌다. 바 CFUs의 평균 숫자 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 표시 합니다. (C) 식민지 형태학 스에 배아 도금의 대표 식민지의 형태학이 나타냅니다 식민지;를 구성 하는 세포의 종류 이미지는 대표적인 erythroid 및 골수성 식민지. CFUs 400 X에서 촬영입니다. 스케일 바 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 분리 효소와 함께 태아의 소화. (A) 소화 전에 10 태아의 이미지 (왼쪽; 소화), 적절 한 소화 후 (중간; 소화), 초과 소화 후 (오른쪽; 소화 이상). (B) (A)에서 소화 하 고 이상 소화 관의 이미지 (7.3 X) Zoomed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공부 하는 효과적인 방법입니다. 이 프로토콜은 그 연구를 구축 하지만 배아 zebrafish를 활용 하 여. 배아 zebrafish에 이러한 분석을 적용 빠른 데이터 수집, 적은 물리적 공간, (마약), 스크린에 대 한 더 적은 약물의 사용의 사용과 테스트 mRNA overexpression 또는 특정 유전 통로의 morpholino (MO) 최저 허용 합니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 조만 초기 척추 개발 하는 동안 발생 하는 단계의 연구 수 있습니다.
이 분석 결과의 유연성으로 인해 그것은 쉽게 많은 다양 한 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 한 수정은 발달 타이밍;의 변조 활용 하는 배아의 나이 수정 시간이 지남에 HSPC 세대의 정량 수 있습니다. 이 또한 별개의 하위 집합 HSPCs erythromyeloid 창시자6, 등 36 전에 발생 하는 연구를 허용할 수 있다 발생 하는 대 선의 fide HSCs3,,45,8, hpf, 이후에. 아무도 아직 분리 하 고, 발전 태아에 더 제한 된 zebrafish HSPC 하위 집합을 식별 할 수 있다 하지만 이러한 분석 실험 허용이 실험. 그것은 필수적 그 동물의 발달 단계를 변경할 때 셀은 스에 추가 금액은 또한 최적화; 너무 동물 동안 너무 없는 식민지를 얻을 것입니다 많은 HSPC 식민지의 셀 접시를 만들 것입니다. 다른 cytokines를 추가 하는 것은 또 다른 수정 특정 실험에 적용할 수 있습니다. Epo를 추가 하면 erythroid 식민지의 정량 Gcsf 골수성 식민지의 열거를 허용 됩니다 있습니다. 이러한 cytokines의 둘 다 추가 멀티 혈통 CFU 생성을 허용할 것 이다. 중요 한 것은,이 분석 실험의 putative cytokines 및 HSPC 증식 및 분화에 미치는 영향 테스트 허용 합니다. 이 분석 실험 또한 대규모 마약 테스트; 수정할 수 있습니다. 배아 있는지 화학 물질 혈액 생산에 긍정적 이거나 부정적인 영향을 미칠 개발 하는 동안 다른 시간 지점에서 화합물의 다른 농도에 노출 수 있습니다. 이러한 실험을 수정할 수 있습니다 마지막 방법은 그 배아 주입 수 있습니다 특정 mRNA 또는 overexpress는 MOs 또는 최저의 특정 유전자 1 셀 단계에서 각각 이다. 24-48 h에 대 한 개발, 후이 배아 경우 이득 또는 손실-의-기능 특정 유전자의 HSPC 형성, 확산, 및 분화에 필수적인 역할을 확인 하기 위해 이러한 분석을 받게 수 있습니다. 그것은 또한 중요는 제 브라의 다른 유전자 변형 종자를 이용 하 여 속도 및 수집 하 고 데이터 해석의 용이성에 도움이 됩니다. 예를 들어, 하나 erythroid 개발에 관심이 있다, 만약 그것은 gata1에 이러한 실험을 수행 하기 위해 쉽게: DsRed 배아40, DsRed 운전 erythroid 특정 유전자 변형 Gata1 녹음 방송 요인의 발기인을가지고 형광입니다. 이 방법에서는, erythroid 식민지를 분석할 때, 형광 현미경 검사 법을 활용할 수 있습니다. 마찬가지로, 이러한 연구는 여러 transgenes 한 번에 여러 셀 계보에 대 한 보고를 가진 동물에 수행할 수 있습니다. 이 기술은 multilineage HSPCs;을 식별 하는 데 유용할 것 이다 erythroid 및 골수성 식민지 형태학에 의해 쉽게 구별할 수 있지만, 그것은 같은 식민지에서 여러 계보 특정 transgene 식의 존재를 시각화 하지 않고 bipotential 창시자를 포함 하는 식민지를 식별 하기 어려운 .
이 분석 실험은 많은 장점을, 비록 때마다 이러한 실험 수행 됩니다; 적절 한 컨트롤을 설정 하려면 필수적입니다. 기술에서 사소한 변화 결과 연구 결과의 해석을 변경할 수 있습니다. 예를 들어 당신의 기술은 정확한; 하지 않으면 다른 일에 실험을 수행할 때 HSPCs의 다른 숫자를 얻을 수 있다 이 가능성을 처리 하나 항상 적절 한 컨트롤을 포함 해야 합니다. 개발에는 MO의 영향을 테스트 후 배아 (uninjected 또는 제어 모 주사) 같은 클러치에서 제어 실험을 수행 하는 경우 또한 실험 샘플 함께 처리 한다. 실험은 특정 약물의 효과 테스트 하도록 설계 된, 경우 치료 샘플 컨트롤 포함 되어야 합니다. 마지막으로, 개발에는 특정 한 cytokine의 효과 테스트 하는 경우 같은 클러치에서 동물 해야 또한 수 처리 그리고 cytokine 문화에 추가 하지 않고 동시에 검사 합니다.
이 생체 외에서 분석 결과 간단 하 게 수행 하는 동안 결과 해석 하기 쉬운 절차 동안 몇 가지 잠재적인 문제가 발생할 수 있습니다. 없는 식민지 문화에서 7 일 후 볼 수 있습니다, 몇 가지 문제가 발생 했을 수 있다. 첫째, 순수 하 고 적절 한 농도;는 cytokines는 다는 것 있는지 확인 cytokines 제작 되었습니다 방법에 따라 농도 변경 하 고 그들의 활동을 최적화 하려면 필요할 수 있습니다. 일반적으로 발생 하는 또 다른 문제는-소화 배아, 파괴 하는 HSPCs; 소화 단계에서 처리 하 고 아무 식민지는 반복적으로 볼 경우 타이밍을 변경. 마지막으로, 스와 잉어 혈 청의 추가의 혼합 수 문제, 그래서 모든 재료를 추가 하 고 제대로 혼합 있는지 확인 하십시오. 기술적인 문제 뿐 아니라 식민지; 특정 상황에서 개발을 더 이상 할 수 있습니다 실현 하는 것이 중요 하다 종종 작은 식민지 문화에 추가 3 일 후 훨씬 더 볼 수 있습니다. 지난 10 일이 스 바로 건조를 시작으로 권장 하지 않습니다. 또 다른 일반적인 문제는 때때로 식민지 하는 경향이; 35mm 페 트리 접시의 가장자리 주위 수집 가장자리의 주위에 특히 철저 하 게, 판 검사 하는 것은 필수적 이다. 또한, 그것은 두껍고, 점성 물자;에서 이러한 식민지 개발 하는 것을 기억 하는 것이 중요 아래로 약간 다른 관찰에 초점 조정 현미경, 초점 비행기-식민지 앉아있을 것입니다 하지 플라스틱 접시의 바닥에.
분석 실험 체 외에 이러한 많은 장점, 하지만 그들은 또한 몇 가지 제한 사항이 있다. 가장 큰 문제는 이러한 분석 수 없습니다 증명 결정적으로 시 조는 HSC-조사 동물의 장기 재구성에 의해 입증 될 수 있는 것 이다. 또한, 모든 cytokines 정의 고 zebrafish 아직, 조사 될 수 있는 HSPCs의 종류를 제한 하에서 조사 되었습니다. 예를 들어, 아니 zebrafish 림프-지원 cytokines 확인 되었습니다 아직, 이러한 분석에서 B와 T 세포 생산을 방지. 또한, 특정 cytokines의 특정 형식 (또는 금액)의 추가 특정 조 혈 통로 아래로 차별화를 기울일 수 경우 multipotent HSPCs를 경작 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 또 다른 잠재적인 경고는 HSPCs 샘플, 실제로 존재 하지만 어떤 이유 인지 구분은 (또는 그렇지 않으면 하지 가능한)이 분석이 결과 분별 효과적으로 수 없습니다. 대부분 체 외에서 분석, 것과 같이 추가 실험 항상 수행 되어야 한다 결과 확인 하기 위해. 이러한 문제 없다면이 클론 분석 실험에서 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
이 분석 실험 조 혈 결함의 신속 하 고 효율적인 심사를 수 있기 때문에, 중요 한 있습니다. 연구원 수 MOs와 특정 유전자 경로 허물고 고 판 소화 동물 유전자 역할을 한 조에 보고. 또한, 돌연변이 물고기 (이전에 생성 된 또는 mutagenesis 화면에 새로 생성 된) 신속 하 고 쉽게 평가 될 수 있다. 이 분석 실험 또한 허용 효율적인 약물 검사 분석 또한 약물 개발 또는 생존에 부정적인 영향을 관찰 하는 수 있는 동안 HSPC 생물학의 변조 식별 하 라이브, 전체 유기 체에. 이러한 분석 또한 다른 timepoints에서 개발 zebrafish에 HSPCs의 정량을 수 있습니다. 여러 연구 HSC 번호 성인7,27,,3041 에 배아 zebrafish3,,442, 을 quantitate 시도 43, 아니 연구 zebrafish에 혈통 제한 HSPCs의 다른 양의 quantitated 있다. 또한, 이러한 분석 검토 하 고 분자 경로 혈액 세포 형성 및 차별화, 수수께끼의 유지 하는 과정에서 중요 한 조절 활용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
건강의 국가 학회에 의해 제공 된 자금 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S.에), 생명 공학에서 연구 및 교육을 위한 캘리포니아 주립 대학 프로그램 (CSUPERB: D.L.S. 척추 조 혈 틈새의 분자 제어) 캘리포니아 주립 대학 치 코 (A.C.B.) 하에서 대학원 사무실에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
