Summary
Hier presenteren we een eenvoudige methode om te kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in embryonale zebrafish. HSPCs van gedissocieerde zebrafish zijn verguld in methylcellulose met ondersteunende factoren, differentiëren in volwassen bloed. Hierdoor kan de detectie van bloed gebreken en kunt drug screening om te gemakkelijk worden uitgevoerd.
Abstract
Haematopoiese is een essentiële cellulaire proces waarin onderscheid hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in de veelheid van andere cel lineages waaruit volwassen bloed. Isolatie en identificatie van deze HSPCs is moeilijk, omdat ze zijn gedefinieerde ex post facto; zij kunnen pas worden gedefinieerd nadat hun differentiatie in bepaalde cel geslachten. In de afgelopen decennia, is de zebravissen (Danio rerio) een model-organisme om te studeren van Haematopoiese geworden. Zebravis embryo's ontwikkelen ex utero, en door 48 h na bevruchting (hpf) hebben gegenereerd definitieve HSPCs. testen om te beoordelen HSPC differentiatie en proliferatie vermogens hebben ontwikkeld, gebruik makend van transplantatie en de daaropvolgende reconstructie van het hematopoietische systeem naast het visualiseren van gespecialiseerde transgene lijnen met confocale microscopie. Deze tests zijn echter kosten onbetaalbaar, technisch gezien moeilijk en tijdrovend voor veel laboratoria. Ontwikkeling van een in vitro model te beoordelen van de HSPCs zou rendabele, sneller, en huidige minder problemen in vergelijking met de eerder beschreven methoden, waardoor laboratoria te snel beoordelen mutagenese en drug schermen die invloed hebben op HSPC biologie. Deze roman in vitro assay voor het beoordelen van de HSPCs wordt uitgevoerd door de beplating los gezien hele zebrafish embryo's en toevoegen exogene factoren die alleen HSPC differentiatie en proliferatie te bevorderen. Embryo's worden losgekoppeld in afzonderlijke cellen en verguld met HSPC-ondersteunend kolonie stimulerende factoren die ervoor zorgen ze dat voor het genereren van de kolonie vormende eenheden (CFUs) die uit een enkele progenitor cel voortvloeien. Deze testen zou meer zorgvuldig onderzoek van de moleculaire pathways verantwoordelijk voor HSPC proliferatie, differentiatie, en verordening, waarmee onderzoekers te begrijpen van de onderbouwing van gewervelde Haematopoiese en de disregulatie tijdens ziekte.
Introduction
Haematopoiese is het proces van het maken van de veelheid van rijpe bloedcellen die nodig is voor de overleving van een organisme. Het is een belangrijke developmental proces waarbij de differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) in een verscheidenheid van verstandelijk beperkte celtypes waaruit volwassen bloed. Deze HSCs moeten zelf vernieuwen zodat het systeem nooit uitgeput is en ze van vroege embryonale ontwikkeling tot dood aanhouden moeten. In gewervelde dieren, constante differentiatie en proliferatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) zijn nodig voor voldoende vullen de meerderheid van de bloedcellen die post mitotische zijn en elke dag worden gerecycled. HSCs genereren volwassen bloedcellen door de eerste differentiëren in subsets van beperkte voorlopercellen; gemeenschappelijke lymfoïde progenitoren (CLPs)1, die uiteindelijk produceren T, B en NK-cellen, en gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs)2 die het genereren van Granulocyten, erytrocyten, macrofagen en megakaryocytes. Deze progenitoren zich inzetten voor het genereren van specifieke cel geslachten, en verder onderscheiden in meer verstandelijk beperkte voorlopercellen zoals myeloïde erythroid progenitoren (Europarlementariërs) die het genereren van erytrocyten en bloedplaatjes of granulocyt macrophage progenitoren (GGP's) die het genereren van basofielen, eosinofielen, neutrofielen en macrofagen2. Identificeren en het isoleren van deze progenitoren maakt de identificatie van belangrijke moleculaire pathways betrokken bij hematopoietische differentiatie en vele hematopoietische ziekten zoals leukemie ontstaan bij deze voorlopercellen niet goed onderscheiden.
In de afgelopen decennia, is het systeem van zebravissen (Danio rerio) model een belangrijke onderzoeksinstrument voor embryonale en volwassen hematopoietische studies geworden. Zebravis zijn vatbaar voor genetische analyse en de fylogenetisch laagste gewervelde model soorten die een vergelijkbare therapieën en hematopoietische systeem voor de mens hebben. Zebravis embryo's ontwikkelen ex utero, en binnen 48 uur bericht genereren bevruchting (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebravis zijn ook zeer vruchtbare, met vrouwtjes leggen over 100 eieren in een interne koppeling, waardoor voor grote steekproeven en experimentele replicatie. Zebravis embryo's zijn optisch transparant, waardoor voor microscopische visualisatie van het hematopoietische systeem. Enkele fluorescerende transgene coderegels zebrafish markering HSCs zoals runx1: EGFP vissen9, cd41: EGFP vissen10, en kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dubbel-positieve dieren, voorzien van live, real-time visualisatie van HSC ontstaan en de uitbreiding in vivo3,4,7,8, 9. Van de zebravis snelle generatie tijd en ontwikkeling ex utero heeft geleid tot het gebruik ervan in de mutagenese studies11,12,13,14,15 en drug screening16,17,18,19,20 voor verbindingen die houden van therapeutische belofte voor menselijk bloed stoornissen. Globaal, instandhouding van het hematopoietische systeem, de aanwezigheid en eenvoudige ontwikkeling van transgene lijnen en snelle regeneratietijd geboekt de zebravis een goedkoop, snel, flexibel en ideaal model voor hematopoietische studies.
Tal van methoden van isoleren en testen van HSCs zijn in zoogdieren hematopoietische systemen ontwikkeld. Onderzoekers kunnen gebruik maken van een combinatie van cel oppervlakte receptoren aan mark van HSCs21,22,23,24, evenals het benutten van het vermogen van HSCs om efflux kleurstof25,26. Nadat ze zijn aangeduid, kan fluorescentie-activated cell sorting (FACS) hun fysieke scheiding. Waaruit blijkt dat een cel een HSC is vereist het bestralen van een dier van de gastheer te vernietigen van endogene HSPCs, overplanten van vermeende HSCs, en op lange termijn, multi lineage reconstitutie van alle oudere bloed celtypes observeren. Deze testen werken goed in muizen, want er zijn talrijke celoppervlak antilichamen tegen hematopoietische cellen en muis ingeteelde stammen die vergemakkelijken immuun matching voor transplantatie. Echter, zijn paar zebrafish hematopoietische celoppervlak antilichamen gegenereerde27, belemmeren de identificatie en de isolatie van de HSCs. De meest gebruikelijke manier om te markeren en te isoleren van de zebravis HSCs is met transgene dieren, waarbij een reeks van cel-specifieke promotor is het besturen van een fluorescerende eiwit expressie. Studies hebben gevisualiseerd en HSCs in de ventrale muur van de dorsale aorta opgesomd met microscopie met behulp van deze techniek3,4,8,9. Andere laboratoria hebben gegenereerd klonale stammen van zebravis28,29 en succesvolle transplantaties in MHC-matched dieren30hebben uitgevoerd. Echter deze technieken worden kosten onbetaalbaar met veel laboratoria zijn technisch gezien moeilijk en tijdrovend zijn. Om deze kwesties te behandelen, hebben laboratoria gegenereerd verscheidene in vitro testen om te testen voor de aanwezigheid, de proliferatie-tarieven en de capaciteit van de differentiatie van HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Deze onderzoeken tonen de proliferatie en differentiatie van HSPCs in vitro31,32,33,34,35,,36, de redding van hematopoietische gebreken36, en een efficiënte methode voor het ontdekken en testen van cytokines33,34,35. Ze hebben ook gebruikt ter identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor31,32van de biologie van de HSPC. In deze studie nemen wij deze testen een stap verder, waardoor de kwantificatie van HSPCs in een zich ontwikkelende zebrafish embryo. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om het kwantificeren van het aantal HSPCs in mutant dieren en dieren behandeld met hematopoietische-ontwrichtende drugs. Kortom, deze tests zijn snel, huidige enkele technische uitdagingen, en goedkope manieren om te kwantificeren HSPC nummers, hun verspreiding te onderzoeken en onderzoeken van blokken in differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) advisory board aan de California State University, Chico, keurt alle methoden die hieronder worden beschreven.
1. bleekmiddel 48 hpf Zebrafish embryo 's
- Met 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastic verpakkingen maken 3 wassen stations: 1) met 1 mL 5% bleekwater in 1000 mL embryo medium (E3; Zie tabel 1), 2) steriele E3 en 3) met steriele E3. Zorg ervoor dat elke container 500 mL oplossing te dompelen de embryo's.
Opmerking: Voor elke voorwaarde getest, ten minste 10 embryo's nodig zullen zijn. Deze procedure wassen is geschikt voor maximaal 200 embryo's. - Pipetteer overdracht plaats van embryo's in een theezeefje en dompelen eieren in wash station #1 voor 5 min. de Theezeef (met embryo's binnen) verwijderen en plaatsen in de wash station #2 voor 5 min; Herhaal voor het wassen station #3 voor een laatste 5 min.
- Na de laatste wash, rinse embryo's uit Theezeef door draaien ondersteboven over een schone 10 cm petrischaal en voorzichtig spoelen embryo's off de Theezeef met steriele E3 en een overdracht pipet.
2. Dechorionate embryo 's
- Pipetteer overdracht verwijderen en weggooien zoveel E3 mogelijk van de petrischaal en voeg 500 μL van dechorionation protease (10 mg/mL) toe aan embryo's. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. zachtjes Tik op de kant van de petrischaal om chorions volledig te verwijderen.
- Voeg 20 mL steriele E3 om te verdunnen protease serologische Pipetteer. Toestaan dat embryo's te regelen en de E3 met een pipet overdracht verwijderen. Herhaal deze wassen stap 3 keer om alle sporen van het dechorionation protease te verwijderen.
3. voorbereiding van de monsters van de Embryo
- Plaats met een pipet P1000 10 embryo's in een enkele steriele 1,5 mL microcentrifuge buis.
- E3 verwijderen met een pipet en gooi deze weg.
Let op: Pipetteer met zorg als embryo's kunnen gemakkelijk worden verplaatst en verwijderd tijdens het wassen volgt.
4. voorbereiding van embryo's voor dissociatie
- Overdracht van monsters naar laminaire flow hood, en wassen van embryo's door toevoeging van 1 mL steriele E3. Toestaan dat embryo's te regelen naar onderkant van de buis en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet P1000. Herhaal dit voor een totaal van 3 wasbeurten.
- Na de laatste wasbeurt, verwijderen van E3 en gooi deze weg. Voeg 1 mL 10 mM dithiothreitol (DTT) in E3 te verwijderen van de slijm coating (en eventuele sporen, gist of bacteriën die kunnen worden onderschept in het) rondom de embryonale zebrafish. Microcentrifuge buis horizontaal leggen en incuberen bij kamertemperatuur laminaire flow Hood gedurende 25 minuten.
5. embryo dissociatie
- Wassen monster 3 keer met 1 mL steriele DPBS (met Ca2 + en Mg2 +). Na de laatste wasbeurt 500 μL van DPBS (met Ca2 + en Mg2 +) en voeg toe 5 μL van 5 mg/mL (26 U/mL) dissociatie protease.
Let op: Dit enzym moet Ca2 + en Mg2 +, dus zorg ervoor dat de DPBS bevat deze ionen. - Incubeer monsters bij 37 ° C op een horizontale roteerschudapparaat op 180 rpm voor 60 min. plaats monsters in de laminaire flow kap en triturate van embryo's met een P1000 tot monsters zijn volledig losgekoppeld.
Let op: Controleer embryo's periodiek om te bepalen wanneer ze worden losgekoppeld. De oplossing van het embryo moet één of andere hoeveelheid weefsel aanwezig is; het mag geen volledig homogeen. Het is mogelijk om overmatige digest, die de HSPCs vernietigen zal (Zie aanvullende figuur 1).
6. bereiding van gedissocieerde embryo 's
- Pipetteer de 10 losgekoppeld embryo's op het bovenste reservoir van een 5 mL-polystyreen ronde onderkant buis met een 35 μm cel zeef cap.
- Met een pipet, spoel de Petri-buis met steriel PBS (met geen Ca2 + of Mg2 +) en overdracht oplossing naar 5 mL polystyreen buis bevattende gefilterd cellen uit stap 6.1. Herhaal de 4 mL vloeistof in de polystyreen tube van 5 mL aanwezig is.
Opmerking: PBS, DPBS, of andere isotone gebufferde oplossingen kunnen worden gebruikt in dit stadium, zolang ze geen Ca2 + of Mg2 bevatten + - Centrifugeer buizen bij 4 ° C en 300 x g gedurende 5 minuten aan het gehomogeniseerde cel monster pellet. Met een pipet, verwijder en weggeworpen uit de ronde onderkant-buis. Zorg voor de cellen Ingehuld aan de onderkant van de buis niet te verstoren. Resuspendeer de cellen in 100 μl van PBS.
7. bereiding van Methylcellulose
- 1 x volledige methylcellulose (tabel 1) stockoplossing genereren en toevoegen van 2.5 mL steriel ronde onderkant 14 mL buizen met 3 mL spuiten en naalden 16 G. Gebruik één tube voor elke voorwaarde getest.
-
Het toevoegen van cytokines, kleine moleculen of andere agenten aan elk monster worden onderzocht.
- Toevoegen voor myeloïde differentiatie, 1% Carp serum en 0,3 mg/mL recombinante zebrafish granulocyt kolonie stimulerende factor (Gcsf),34 tot en met methylcellulose medium. Zie Svoboda et al. 37 voor volledige beschrijving op hoe te genereren van karper serum en recombinant cytokines.
- Toevoegen voor differentiatie van de erythroid, 1% Carp serum en 0,1 mg/mL zebrafish recombinante erytropoëtine (Epo)38 naar methylcellulose medium.
- Toevoegen om te onderzoeken multilineage progenitorcellen, EPB en Gcsf.
Let op: Cytokines en additieven moeten niet in totaal meer dan 10% van het totale volume, zoals het medium niet zal viskeuze genoeg te onderscheiden van afzonderlijke kolonies.
8. toevoeging van gedissocieerde embryo's Methylcellulose
- Met behulp van een precisiepipet, voeg 100 μl van de gedissocieerde 10 embryo's op het oppervlak van de bereid methylcellulose met recombinant cytokines en karper serum. GLB deksel en vortex zachtjes aan volledig Meng monster. Elke buis moet nu het gedissocieerde weefsel van 10 embryo's bevatten.
- Gebruik 3 mL spuiten en 16 G naalden, aliquoot 1 mL van het monster af in 2 aparte 35 mm petrischalen. Zorg ervoor dat het monster volledig is verspreid over de petrischaal. Herhaal voor elk monster.
- 35 mm petrischaaltjes met cellen in methylcellulose in een 15 cm petrischaal plaatsen. Toevoegen aan elke 15 cm schotel, een 35 mm Petri plaat met 5 mL steriel water aan de humidify van de monsters. Incubeer bij 32 ° C en 5% CO2 gedurende 7-10 dagen.
9. visualisatie van HSPC afkomstige kolonievormende eenheden (CFUs)
- Na 7 dagen aan het broeden, Leg monsters op een omgekeerde Microscoop op 40-100 X voor visualisatie en opsomming. Op dit punt, kunnen afzonderlijke kolonies worden geïsoleerd met een pipet en onderworpen aan vlekken en/of gene analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te beoordelen HSPC getallen in embryonale zebrafish, waren 48 hpf embryo's verteerd, verguld in methylcellulose met exogene hematopoietische-ondersteunend groeifactoren en gedurende 7 dagen (Figuur 1A) geïncubeerd. Na 7 dagen werden de kolonie vormende eenheden (CFUs) opgesomde (Figuur 1B) en verbeelde (Figuur 1C). Door het beheersen van de verschillende cytokines toegevoegd, één kunt bepalen welke soorten koloniën geproduceerd: Epo is noodzakelijk voor de differentiatie van de erythroid en Gcsf voor myeloïde differentiatie noodzakelijk is. Karper serum is analoog aan foetale runderserum gebruik in zoogdieren weefselkweek; het is een bron van algemene groeifactoren. In Figuur 1, werden Epo, Gcsf en karper serum toegevoegd, waardoor de opsomming van erythroid, myeloïde en gemengde erythromyeloid kolonies. Deze kolonies kunnen worden onderkend als gevolg van hun vorm en kleur; de erythroid kolonies zijn strakke, kleine, compacte, en hebben een rode kleur door hemoglobinization. De myeloïde kolonies zijn groter en hebben meer motile cellen op hun randen, waardoor ze een ruw uiterlijk.
Succesvolle plating van embryonale zebrafish behandeld met HSPC-ondersteunende factoren zal opleveren CFUs na 7-10 dagen incubatie. Nog belangrijker is, de hoeveelheid CFUs direct correleert met het aantal embryo's verguld (Figuur 1B). Plating 4 of 8 embryo's per mL (die correleert om te beginnen met 10 of 20 embryo's aan het begin van het experiment) levert ongeveer 1200 of 2400 CFUs, respectievelijk. Ons protocol stelt voor gebruikend 10 embryo's, want het is moeilijk en tijdrovend te tellen van 2.400 CFUs bij het uitvoeren van een grotere experiment. Als gevolg van de methodologie van het verteren van hele embryo's, diverse puin is aanwezig in de methylcellulose, maar kan gemakkelijk worden onderscheiden van werkelijke kolonies met hogere vergroting onder de Microscoop. Andere cellulaire puin ook aanwezig kan zijn, maar het enige CFUs aanwezig zullen afkomstige HSPC als gevolg van de toevoeging van HSPC-ondersteunend cytokinen. Als CFUs klein en niet gemakkelijk gezien zijn, kunnen de culturen worden geïncubeerd omhoog tot 10 dagen ter bevordering van de groei. Nochtans, verhoogde incubatie levert niet veel meer CFUs; Als CFUs niet aanwezig zijn, betekent dit een verlies van cytokine activiteit over vertering van embryo's (en latere vernietiging van HSPCs; Zie aanvullende figuur 1), of onjuiste beplating van monsters. Het is altijd belangrijk om de juiste besturingselementen uitvoeren elke keer dat dit experiment is uitgevoerd om ervoor te zorgen dat kleine variaties in de techniek doen levert niet veel valse verschillen in HSPC-opsomming. Bijvoorbeeld, als een experiment is uitgevoerd om te analyseren van het aantal HSPCs in morphant embryo's aanwezig, moet een monster met normale broers en zussen bereid zijn naast. Als een experiment uitgevoerd om het effect van een geneesmiddel op de ontwikkeling van de HSPCs een monster met onbehandelde broers en zussen moet worden voorbereid en geanalyseerd naast vergelijken.
Figuur 1: CFUs HSPC opsommen-afgeleid uit 48 hpf zebrafish embryo's. (A) schematisch overzicht van embryo plating op methylcellulose met HSPC-ondersteunend cytokines voor generatie van hematopoietische CFUs. 48 hpf zebrafish embryo's waren losgekoppeld en vergulde op 1% compleet methylcellulose met Erytropoëtine (Epo), granulocyt kolonie stimulerende factor (Gcsf) en karper serum, waardoor differentiatie van de erythromyeloid. (B) opsomming van kolonievormende eenheden (CFUs) van monsters uitplaten aan concentraties van 4 of 8 embryo's per mL (vanaf het experiment met 10 of 20 embryo's, respectievelijk). Inventarisatie werd uitgevoerd bij 100 X op een omgekeerde Microscoop. Staven geven gemiddelde aantal CFUs en foutbalken geven standaarddeviatie. (C) kolonie morfologie vertegenwoordiger van embryo plating op methylcellulose. De kolonie morfologie geeft de soorten cellen waaruit de kolonie; beelden zijn representatieve erythroid en myeloïde kolonies. CFUs op 400 X gefotografeerd. Schaal bars = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: vertering van embryo's met dissociatie protease. (A) beelden van 10 embryo's voor de spijsvertering (resterend; onverteerde), na voldoende spijsvertering (middelste; verteerd), en na overtollige spijsvertering (recht; meer dan verteerd). (B) Zoomed in beelden (7.3 X) van verteerd en meer dan verteerd buizen in (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zebravis modelsysteem is een efficiënte, effectieve en goedkope model voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde Haematopoiese geworden. Generatie van tests die zijn snel, goedkoop, en enkele technische moeilijkheden opleveren kan worden gebruikt voor het testen van kleine molecules, analyseren van mutant embryo's en het ophelderen van de moleculaire pathways belangrijk voor HSPC biologie. In vitro beplating van HSPCs van volwassen zebrafish is een effectieve methode om te studeren mutagenese, cytokines en hematopoietische gebreken. Dit protocol is gebaseerd op die studies, maar gebruik maakt van embryonale zebrafish. Deze testen toe te passen op embryonale zebrafish zorgt voor sneller verzamelen van de gegevens, het gebruik van minder fysieke ruimte, het gebruik van minder drugs (voor drug schermen), en vergunningen testen mRNA overexpressie en/of morfolino (MO) knockdown van specifieke genetische studierichtingen. Nog belangrijker is, het maakt het ook mogelijk de studie van de stadia van Haematopoiese die alleen tijdens de vroege ontwikkeling van de gewervelde optreden.
Als gevolg van de flexibiliteit van deze test, kan het gemakkelijk worden gewijzigd om te voldoen aan de vele uiteenlopende behoeften. Een wijziging van dit protocol is de modulatie van ontwikkelingsstoornissen timing; wijzigen van de leeftijd van embryo's gebruikt, kan de kwantificatie van HSPC generatie na verloop van tijd. Dit kan ook het toestaan van de studie van verschillende deelverzamelingen van HSPCs zoals erythromyeloid progenitoren6, die zich voordat 36 voordoen hpf, ten opzichte van bona fide HSCs3,4,5,8, die zich voordoen daarna. Niemand heeft nog kunnen isoleren en identificeren van beperktere zebrafish HSPC deelverzamelingen in het zich ontwikkelende embryo, maar deze gehaltebepalingen toestaan deze experimenten. Het is essentieel dat bij het wijzigen van de ontwikkelingsstadia van de dieren, de hoeveelheid cellen in de methylcellulose toegevoegd is ook geoptimaliseerd; te weinig dieren levert geen koloniën, terwijl ook veel ontstaat een overaftelbare plaat van HSPC kolonies. Het toevoegen van verschillende cytokines is een andere wijziging die kan worden aangepast aan specifieke experimenten. Toevoegt EOB, laten de kwantificatie van de kolonies van de erythroid, terwijl Gcsf inventarisatie van myeloïde kolonies zal toestaan. Beide van deze cytokines toevoegt, laten multi lineage CFU generatie. Nog belangrijker is, toestaan dat deze testen testen van vermeende cytokines en hun effect op de HSPC proliferatie en differentiatie. Deze testen kunnen ook worden gewijzigd voor het uitvoeren van grootschalige drug testen; embryo's kunnen worden blootgesteld aan verschillende concentraties van stoffen op verschillende tijdstippen tijdens de ontwikkeling om te zien of de chemische stoffen die een positief of negatief effect op bloed productie hebben. Een laatste manier dat deze experimenten kunnen worden gewijzigd, is dat embryo's kunnen worden geïnjecteerd in het stadium van de één-cel met specifieke mRNA of MOs, die zal overexpress of vechtpartij specifieke genen, respectievelijk. Na het ontwikkelen voor 24-48 h, kunnen deze embryo's worden onderworpen aan deze tests om te bepalen als winst-verlies-van-functie of van specifieke genen een essentiële rol in de HSPC formatie, proliferatie en differentiatie spelen. Het is ook belangrijk op te merken dat in de snelheid en het gemak van verzamelen en interpreteren van gegevens met behulp van verschillende transgene variëteiten van zebravis zal helpen. Bijvoorbeeld, als men is geïnteresseerd in de ontwikkeling van de erythroid, het is gemakkelijk voor het uitvoeren van deze experimenten in gata1: DsRed embryo's40, die de promotor van de erythroid-specifieke transgene Gata1 transcriptiefactor rijden DsRed fluorescentie. Op deze manier, wanneer het analyseren van de erythroid kolonies, kan fluorescentie microscopie worden gebruikt. Ook kunnen deze studies op dieren met meerdere transgenen aanwezig om te zoeken naar meerdere cel lineages tegelijk worden uitgevoerd. Deze techniek zou nuttig zijn voor het identificeren van multilineage HSPCs; Hoewel erythroid en myeloïde kolonies gemakkelijk te onderscheiden door morfologie zijn, is het moeilijk om te identificeren van de kolonies die bipotential progenitoren bevatten zonder het visualiseren van de aanwezigheid van meerdere geslacht-specifieke transgenic expressie in de dezelfde kolonie .
Hoewel deze testen vele voordelen hebben, is het essentieel om het opzetten van adequate controles, telkens wanneer deze proeven worden uitgevoerd; kleine variaties in techniek kon veranderen de resultaten en de interpretaties van de bevindingen. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om verschillende aantallen HSPCs wanneer u de experimenten op verschillende dagen uitvoeren als je techniek niet nauwkeurig is; om rekening te houden met deze mogelijkheid, dient men altijd een passende controlemaatregelen. Als een experiment is uitgevoerd om te testen van het effect van een MO op ontwikkeling, dan controle van de embryo's (of uninjected of geïnjecteerd met een besturingselement MO) die afkomstig van de zelfde koppeling zijn moet ook naast het experimentele monster worden verwerkt. Als het experiment is ontworpen voor het testen van het effect van een bepaald geneesmiddel, moeten vervolgens onbehandelde monsters worden opgenomen als een besturingselement. Tot slot, als het testen van de effecten van een bepaalde cytokine op ontwikkeling, dan dieren uit de dezelfde koppeling moeten ook worden verwerkt en onderzocht op hetzelfde moment zonder de cytokine toegevoegd aan de cultuur.
Terwijl deze in vitro -assay is eenvoudig uit te voeren en de resultaten gemakkelijk zijn te interpreteren, kunnen sommige potentiële problemen ontstaan tijdens de procedure. Als geen kolonies worden gezien na 7 dagen in de cultuur, zijn er diverse problemen die zich mogelijk hebben voorgedaan. Eerst, controleer om ervoor te zorgen dat de cytokines zuiver en bij adequate concentraties zijn; afhankelijk van hoe de cytokines geproduceerd wellicht te veranderen van de concentraties en het optimaliseren van hun activiteit. Een andere kwestie die vaak ontstaat is te verteren de embryo's, die vernietigt de HSPCs; Take care bij de stap van de spijsvertering, en de timing wijzigen als geen kolonies worden herhaaldelijk gezien. Tot slot, het mengen van methylcellulose en toevoeging van karper serum kon het probleem, dus zorg ervoor dat alle ingrediënten waren toegevoegd en gemengd correct. Naast technische problemen is het belangrijk om te beseffen dat de kolonies langer wellicht te ontwikkelen onder bepaalde omstandigheden; vaak kleine kolonies zijn veel meer zichtbaar na een extra 3 dagen in cultuur. Afgelopen 10 dagen gaan wordt niet aanbevolen, omdat de methylcellulose begint kort daarna drogen. Een andere gemeenschappelijke kwestie is dat soms kolonies hebben de neiging om te verzamelen rond de randen van de 35 mm petrischalen; scannen van de platen grondig, vooral rond de randen, is van essentieel belang. Ook is het belangrijk om te onthouden dat deze kolonies in een dikke, visceuze materiaal evolueren; Wanneer de focus op en neer te zien iets anders concentreren van de Microscoop, aanpast zal vliegtuigen-de kolonies niet zitten aan de onderkant van de plastic gerechten.
Deze in vitro -tests hebben tal van voordelen, maar ze hebben ook een paar beperkingen. Het grootste probleem is dat deze gehaltebepalingen definitief niet kunnen bewijzen dat een voorvader is een HSC-dat kan alleen worden bewezen door langdurige reconstitutie van bestraalde dieren. Bovendien zijn niet alle cytokines gedefinieerd en onderzocht in zebrafish nog, ter beperking van de soorten HSPCs die kunnen worden onderzocht. Bijvoorbeeld, geen zebrafish lymfoïde-ondersteunend cytokines geconstateerd nog, voorkomen van B- en T cel productie in deze testen. Bovendien is het onduidelijk wanneer kweken van multipotente HSPCs als de toevoeging van bepaalde typen (of hoeveelheden) van specifieke cytokines laten van de differentiatie van bepaalde hematopoietische trajecten uitvallen kan. Een andere mogelijke valkuil is dat deze bepaling kan niet effectief onderscheiden als HSPCs daadwerkelijk aanwezig is in een steekproef, maar om wat voor reden niet in staat om te onderscheiden zijn (of anders niet rendabel zijn). Zoals met de meeste in vitro testen, moeten verdere experimenten altijd worden uitgevoerd voor het valideren van de bevindingen. Afgezien van deze kwesties, kan veel informatie uit deze klonale testen worden begrepen.
Deze testen zijn belangrijk, omdat zij toestaan snelle en efficiënte screening van hematopoietische gebreken. Onderzoekers kunnen neerhalen van bepaalde genetische trajecten met MOs en plaat verteerd dieren om te zien als het gen een rol in Haematopoiese speelt. Mutant vis (voorheen gegenereerd of nieuw gegenereerd in mutagenese schermen) kunnen bovendien worden beoordeeld snel en gemakkelijk. Deze testen kunnen ook efficiënte drug screening tests op levende, hele organismen te identificeren van de modulatie van de biologie van de HSPC terwijl ze ook kunnen vaststellen als de drugs een negatief effect op de ontwikkeling of het voortbestaan hebben. Deze testen kunnen ook kwantificatie van HSPCs in de ontwikkelende zebravis op verschillende tijdstippen. Terwijl meerdere studies hebben geprobeerd te kwantificeren van HSC getallen in volwassen7,27,30,41 en embryonale zebrafish3,4,42, 43, geen studies hebben de verschillende hoeveelheden lineage-beperkte HSPCs in zebrafish quantitated. Bovendien kunnen deze testen worden gebruikt om de onderzoeken en moduleren van moleculaire pathways belangrijk in bloed celvorming en differentiatie, een proces dat raadselachtige blijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 naar D.L.S.), de California State University Program voor onderwijs & onderzoek in de biotechnologie (CSUPERB: Moleculaire controle van de gewervelde hematopoietische Niche te D.L.S.) en vanuit het kantoor van de Graduate Studies in California State University Chico (op A.C.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
