Summary
Qui, presentiamo un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSPCs) in zebrafish embrionale. HSPCs dallo zebrafish dissociate sono placcati in metilcellulosa con fattori solidale, differenziando in sangue maturo. Questo consente il rilevamento di sangue difetti e permette lo screening per essere facilmente condotto.
Abstract
L'ematopoiesi è un processo cellulare essenziale in cui cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) si differenziano nella moltitudine degli stirpi differenti delle cellule che compongono il sangue maturo. Isolamento ed identificazione di questi HSPCs è difficile perché sono definiti ex post facto; possono essere definiti solo dopo la loro differenziazione in cellule specifiche. Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l'ematopoiesi. Embrioni di zebrafish sviluppano ex uteroe di post-fertilizzazione 48h (hpf) hanno generato definitiva HSPCs. saggi per valutare la differenziazione HSPC e sono state sviluppate capacità di proliferazione, che utilizza il trapianto e successive ricostituzione del sistema ematopoietico oltre a visualizzare linee specializzate transgenici con microscopia confocale. Tuttavia, queste analisi sono costo proibitivo, tecnicamente difficile e richiede tempo per molti laboratori. Sviluppo di un modello in vitro per valutare HSPCs sarebbe conveniente, più veloce, e presenti meno difficoltà rispetto al precedentemente descritti metodi, che permettano di laboratori valutare rapidamente le schermate di mutagenesi e droga che influiscono sulla biologia HSPC. Questo romanzo in vitro test per valutare la HSPCs viene eseguito da embrioni di zebrafish intero placcatura dissociata e aggiungendo fattori esogeni che promuovono solo HSPC differenziazione e la proliferazione. Gli embrioni sono dissociati in cellule singole e placcati con HSPC-solidale Colonia di granulociti che causano loro di generare unità formanti colonie (CFU) che derivano da una cellula progenitrice singolo. Queste analisi dovrebbero consentire un esame più attento delle vie molecolari responsabili della proliferazione, la differenziazione e il regolamento, che permetterà ai ricercatori di capire le basi della ematopoiesi vertebrato e sua disregolazione HSPC durante la malattia.
Introduction
L'ematopoiesi è il processo di fare il gran numero di cellule ematiche mature, necessaria per la sopravvivenza di un organismo. È un processo chiave di sviluppo che coinvolge la differenziazione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) in una varietà di tipi cellulari inerente allo sviluppo limitato che comprendono sangue maturo. Questi HSCs devono rinnovarsi affinché il sistema non è mai esaurito e si deve mantenere dal primo sviluppo embrionale fino alla morte. Nei vertebrati, costante differenziazione e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) sono necessari per alimentare adeguatamente la maggior parte delle cellule del sangue che sono post-mitotici e viene riciclato ogni giorno. HSC generano cellule ematiche mature differenziando prima in sottoinsiemi di cellule progenitrici limitato; comuni progenitori linfoidi (CLPs)1, che alla fine producono le cellule T, B e NK e comuni dei progenitori mieloidi (CMPs)2 che generano i granulociti, eritrociti, macrofagi e megacariociti. Questi progenitori si sono impegnati a generare cellule specifiche e ulteriormente differenziano in altre cellule progenitrici inerente allo sviluppo limitato come progenitori eritroidi mieloide (MEP) che generano gli eritrociti e piastrine o granulociti progenitori del macrofago (GMP) che generano i basofili, eosinofili, neutrofili e macrofagi2. Identificare e isolare questi progenitori permette l'identificazione di importanti vie molecolari coinvolti nel differenziamento ematopoietico e molte malattie ematopoietiche come leucemia sorgono quando queste cellule progenitrici non correttamente differenziare.
Negli ultimi decenni, il sistema di modello di zebrafish (Danio rerio) è diventato uno strumento chiave della ricerca per gli studi emopoietici embrionali ed adulti. Zebrafish sono suscettibile di analisi genetica e le specie di vertebrati modello filogeneticamente più basse che hanno un simile sistema vascolare e sistema ematopoietico agli esseri umani. Embrioni di zebrafish sviluppano ex utero, ed entro 48 ore post fertilizzazione (hpf) generare HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish sono altamente fertile, anche con le femmine posa oltre 100 uova in un singolo frizione, permettendo per campioni di grandi dimensioni e replica sperimentale. Embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, consentendo per visualizzazione microscopica del sistema ematopoietico. Parecchie linee transgeniche fluorescente di zebrafish marcatura HSCs come runx1: EGFP pesce9, cd41: EGFP pesce10, e kdrl:mCherry; cMyb: animali GFP3 double-positivo, consentire per la visualizzazione in tempo reale di HSC emersione ed espansione in vivo3,4,7,8, 9. Generazione veloce tempo e sviluppo ex utero di zebrafish ha condotto al relativo uso in droga e mutagenesi studi11,12,13,14,15 16,17,18,19,20 per composti che contengono promessa terapeutica per malattie del sangue umano di screening. Nel complesso, conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche e il tempo di rigenerazione rapida ha reso zebrafish un modello economico, veloce, flessibile e ideale per studi ematopoietici.
Sono stati sviluppati numerosi metodi di isolamento e test HSCs nei sistemi mammiferi ematopoietici. Gli investigatori possono utilizzare una combinazione di recettori di superficie per Marco HSCs21,22,23,24, nonché di sfruttare la capacità di HSCs di efflusso tintura25,26. Dopo sono etichettati, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) consente loro separazione fisica. Dimostrare che una cella è un HSC richiede irradiando un animale ospite per distruggere HSPCs endogena, trapianto di HSC putativo e osservando la ricostituzione a lungo termine, multi-lignaggio di tutto maturo tipi di cellule del sangue. Questi test funzionano bene in topi, come ci sono numerosi cellula-superficie anticorpi contro le cellule ematopoietiche e ceppi inbred del mouse che facilitano immuni per il trapianto. Tuttavia, pochi anticorpi di superficie delle cellule ematopoietiche zebrafish sono stati generati27, ostacolando l'identificazione e l'isolamento di HSCs. Il modo più comune per contrassegnare e isolare HSCs zebrafish è con animali transgenici, per cui una sequenza di cellula-specifico promotore sta guidando la espressione di una proteina fluorescente. Studi hanno visualizzato ed enumerato HSCs nella parete ventrale dell'aorta dorsale con microscopia che utilizzano questa tecnica3,4,8,9. Altri laboratori hanno generato ceppi clonali di zebrafish28,29 e sono effettuati trapianti di successo negli animali MHC-abbinato30. Tuttavia, queste tecniche sono costi proibitivi per molti laboratori, sono tecnicamente difficili e richiedono molto tempo. Per risolvere questi problemi, laboratori hanno generato diversi saggi in vitro per verificare la presenza, i tassi di proliferazione e la capacità di differenziazione di HSPCs31,32,33, 34,35,36. Queste analisi mostrano la proliferazione e la differenziazione di HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, il salvataggio di ematopoietiche difetti36e un metodo efficiente per l'individuazione e sperimentazione di citochine33,34,35. Essi sono stati utilizzati anche per identificare i geni responsabili HSPC biologia31,32. In questo studio, prendiamo queste analisi un passo avanti, consentendo la quantificazione di HSPCs in un embrione di zebrafish sviluppo. Queste analisi possono essere utilizzate anche per quantificare il numero di HSPCs in animali mutanti e gli animali trattati con farmaci emopoietici dirompente. In sostanza, queste analisi sono veloce, presenti alcune sfide tecniche e sono modi economici per quantificare i numeri HSPC, esaminare la loro proliferazione e indagare blocchi nella differenziazione.
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Protocol
Comitato consultivo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso la California State University, Chico, ha approvato tutti i metodi descritti di seguito.
1. candeggina 48 embrioni di Zebrafish hpf
- Con 15 centimetri (w) x 15 cm (l) x contenitori di plastica di 7 cm (h) creare 3 stazioni di lavaggio: 1) con 1 mL di candeggina al 5% in 1000 mL di terreno di embrione (E3; si veda tabella 1), 2) con sterile E3 e 3) con E3 sterile. Assicurarsi che ogni contenitore 500 mL di soluzione per sommergere gli embrioni in.
Nota: Per ogni condizione testata, saranno necessari almeno 10 embrioni. Questa procedura di lavaggio può ospitare fino a 200 embrioni. - Con una pipetta di trasferimento, posizionare gli embrioni in un colino da tè e immergere le uova nella stazione di lavaggio #1 per 5 minuti rimuovere il colino da tè (con embrioni all'interno) e inserire nella stazione di lavaggio #2 per 5 min; Ripetere per stazione di lavaggio #3 per un finale 5 min.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risciacquo embrioni da colino da tè ruotandola testa in giù sopra un pulito 10 cm di Petri e risciacquo delicatamente gli embrioni fuori il colino da tè con E3 sterile e una pipetta di trasferimento.
2. Dechorionate embrioni
- Con una pipetta di trasferimento, rimuovere e scartare tanto E3 come possibile da di Petri e aggiungere 500 μL di dechorionation proteasi (10 mg/mL) agli embrioni. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Picchiettare delicatamente il lato di Petri per rimuovere completamente chorions.
- Con una pipetta sierologica, aggiungere 20 mL di sterile E3 per diluire proteasi. Embrioni di stabilirsi ed eliminarne l'E3 con una pipetta di trasferimento. Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte per rimuovere tutte le tracce della proteasi dechorionation.
3. preparazione dei campioni di embrione
- Utilizzando una pipetta P1000, inserire 10 embrioni in un tubo del microcentrifuge singole sterili da 1,5 mL.
- Rimuovere E3 con una pipetta e scartare.
Attenzione: Pipetta con cura come embrioni possono essere facilmente spostati e scartati durante le seguenti fasi di lavaggio.
4. preparare gli embrioni per dissociazione
- Trasferire campioni cappa a flusso laminare e lavare gli embrioni aggiungendo 1 mL sterile E3. Consentire gli embrioni si depositano sul fondo della provetta e rimuovere il surnatante con una pipetta P1000. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
- Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere E3 ed eliminare. Aggiungere 1 mL di 10 mM dithiothreitol (DTT) in E3 per rimuovere il rivestimento di muco (e spore, lievito o batteri che possono essere intrappolati in esso) che circondano il zebrafish embrionale. Posare il tubo del microcentrifuge orizzontalmente e incubare a temperatura ambiente in cappa a flusso laminare per 25 min.
5. embrione dissociazione
- Lavare il campione 3 volte con 1 mL di DPBS sterile (con Ca2 + e Mg2 +). Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 500 μL di DPBS (con Ca2 + e Mg2 +) e aggiungere 5 μL di proteasi di dissociazione di 5 mg/mL (26 U/mL).
Attenzione: Questo enzima ha bisogno di Ca2 + e Mg2 +, in modo da garantire che il DPBS contiene questi ioni. - Incubare i campioni a 37 ° C in un agitatore orbitale orizzontale a 180 giri/min per 60 min. campioni di posto nella cappa a flusso laminare e triturare gli embrioni con un P1000 fino a quando i campioni sono completamente dissociati.
Attenzione: Controllare gli embrioni periodicamente per determinare quando essi diventano dissociate. La soluzione di embrione dovrebbe avere certa quantità di tessuto presente; non dovrebbe essere completamente omogeneo. È possibile sovra-digest, che distruggerà la HSPCs (Vedi Supplemental figura 1).
6. preparazione degli embrioni dissociati
- Embrioni di pipetta il 10 dissociato sul serbatoio superiore di un polistirolo da 5 mL tubo rotondo basso con un tappo di filtro cella 35 μm.
- Con una pipetta, sciacquare il tubo di Petri con PBS sterile (con nessun Ca2 + o Mg2 +) e soluzione di trasferimento a 5 mL provetta polistirolo filtrati celle dal punto 6.1. Ripetere fino a 4 mL di liquido è presente nella provetta polistirolo da 5 mL.
Nota: PBS, DPBS o altre soluzioni isotoniche tampone possono essere utilizzati in questa fase, purché non contengono Ca2 + o Mg2 + - Centrifugare le provette a 4 ° C e 300 x g per 5 min a pellet campione omogeneizzato cellulare. Con una pipetta, rimuovere e scartare il surnatante dal tubo fondo tondo. Fare attenzione a non frantumare le cellule pellettate nella parte inferiore del tubo. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS.
7. preparazione di metilcellulosa
- Generare la soluzione di riserva completa metilcellulosa (tabella 1): 1x e aggiungere 2,5 mL in provette sterili round-fondo 14 mL con 16 G aghi e siringhe da 3 mL. Utilizzare un tubo per ogni condizione testata.
-
Aggiungere citochine, molecole piccole o altri agenti per essere studiato per ogni campione.
- Per differenziazione mieloide, aggiungere 1% carpa del siero e 0,3 mg/mL ricombinante zebrafish stimolante le colonie granulocitarie fattore (Gcsf)34 per mezzo di metilcellulosa. Vedi Svoboda et al. 37 per la descrizione completa su come generare carpa citochine del siero e ricombinante.
- Per differenziazione eritroide, aggiungere 1% carpa del siero e 0,1 mg/mL zebrafish ricombinante dell'eritropoietina (Epo)38 a mezzo di metilcellulosa.
- Per esaminare i progenitori multilineare, aggiungere Epo e Gcsf.
Attenzione: Citochine e additivi non dovrebbero totale più del 10% del volume totale, come il mezzo non sarà abbastanza viscoso a discernere le diverse colonie.
8. aggiunta di embrioni dissociati di metilcellulosa
- Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 μL di dissociata 10 embrioni alla superficie della metilcellulosa preparata con ricombinante del siero di citochine e la carpa. Coperchio tappo e agitare delicatamente per omogeneizzare completamente campione. Ogni tubo deve contenere il tessuto dissociato di 10 embrioni.
- Utilizzando 3 mL siringhe ed aghi di 16 G, aliquotare 1 mL di campione in 2 capsule di Petri separata 35 mm. Assicurarsi che il campione è completamente dispersa in tutto il piatto di Petri. Ripetere per ogni campione.
- Consente di inserire un 15cm di Petri 35mm di Petri con cellule in metilcellulosa. Ad ogni piatto di 15 cm, aggiungere una piastra di Petri di 35 mm con 5 mL di acqua sterile per umidificare i campioni. Incubare a 32 ° C e 5% CO2 per 7-10 giorni.
9. visualizzazione dei derivati HSPC Colony Forming Units (CFU)
- Dopo 7 giorni di incubazione, posizionare il campione sul microscopio invertito a 40-100 X per visualizzazione ed enumerazione. A questo punto, diverse colonie possono essere isolate con una pipetta e sottoposti ad analisi di colorazione e/o gene.
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Representative Results
Per valutare il numero HSPC in zebrafish embrionale, 48 hpf embrioni sono stati digeriti, placcati in metilcellulosa con fattori di crescita ematopoietici-solidale esogeni e incubati per 7 giorni (Figura 1A). Dopo 7 giorni, unità formanti colonie (CFU) sono stati enumerati (Figura 1B) e immagine (Figura 1C). Controllando le diverse citochine aggiunta, uno può controllare i tipi di colonie prodotte: Epo è necessario per la differenziazione degli eritrociti e Gcsf è necessario per la differenziazione mieloide. Siero di carpa è analogo all'uso di siero bovino fetale in coltura di tessuti di mammiferi; è una fonte di fattori di crescita generale. Nella Figura 1, Epo, Gcsf e carpa siero sono stati aggiunti, che consente l'enumerazione di eritroidi, colonie mieloidi e misto erythromyeloid. Queste colonie possono essere individuate a causa della loro forma e colore; le colonie degli eritrociti sono stretto, piccolo, compatto e hanno un colore rosso a causa di hemoglobinization. Le colonie mieloidi sono più grandi e hanno più cellule motili sui bordi, dando loro un aspetto arruffato.
Successo di placcatura di zebrafish embrionali trattati con HSPC-solidale fattori produrrà CFUs dopo 7-10 giorni di incubazione. D'importanza, la quantità di CFUs direttamente correla con il numero di embrioni placcato (Figura 1B). Placcatura di 4 o 8 embrioni / mL (che correla a iniziare con 10 o 20 embrioni all'inizio dell'esperimento) produce circa 1.200 o 2.400 CFUs, rispettivamente. Il nostro protocollo suggerisce di utilizzare 10 embrioni, come è difficile e richiede tempo per contare 2.400 CFUs durante l'esecuzione di un esperimento più grande. A causa della metodologia di digerire interi embrioni, vari detriti sono presenti nella metilcellulosa, ma possono essere facilmente individuati dalle colonie effettivi con maggiore ingrandimento al microscopio. Possono essere presenti anche altri detriti cellulari, ma l'unico CFUs presenti sarà derivata HSPC grazie all'aggiunta di citochine HSPC-solidale. Se CFUs sono piccole e non facilmente visibili, le colture possono essere incubate fino a 10 giorni per incoraggiare una maggiore crescita. Tuttavia, aumentata incubazione non produrrà più CFUs; Se CFUs non sono presenti, questo indica una perdita di attività di citochina, sopra digestione degli embrioni (e la successiva distruzione del HSPCs; vedere Supplemental figura 1), o placcatura improprio dei campioni. È sempre importante eseguire opportuni controlli ogni volta che questo esperimento viene eseguito per garantire che lievi variazioni di tecnica non danno false differenze nell'enumerazione HSPC. Ad esempio, se un esperimento viene eseguito per analizzare il numero di HSPCs presenti in morphant embrioni, un campione con fratelli germani normali deve essere preparato a fianco. Se un esperimento è effettuato per confrontare l'effetto di un farmaco sullo sviluppo di HSPCs un campione con i fratelli non trattati deve essere preparato ed analizzato a fianco.
Figura 1: L'enumerazione HSPC-derivato CFUs da 48 embrioni di zebrafish hpf. (A) descrizione schematica di placcatura di embrione in metilcellulosa con citochine HSPC-solidale per la generazione di CFUs ematopoietico. 48 embrioni di zebrafish hpf sono stati dissociati e placcati su 1% completa metilcellulosa con eritropoietina (Epo), fattore di stimolazione della Colonia del granulocyte (Gcsf) e siero di carpa, permettendo erythromyeloid differenziazione. (B) enumerazione della Colonia formando unità (CFUs) da campioni placcati a concentrazioni di 4 o 8 embrioni per mL (l'esperimento a partire con 10 o 20 embrioni, rispettivamente). Enumerazione è stato fatto a 100 X su un microscopio invertito. Le barre indicano numeri medii di CFUs e barre di errore indicano deviazione standard. Morfologia di Colonia (C) rappresentanza di placcatura di embrione in metilcellulosa. Morfologia della Colonia indica i tipi di cellule che compongono la Colonia; le immagini sono rappresentative degli eritrociti e mieloidi colonie. CFUs fotografato a 400 X. Scala bar = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: digestione degli embrioni con proteasi di dissociazione. (A) immagini di 10 embrioni prima digestione (sinistra; non digerito), dopo un'adeguata digestione (middle; digerito) e dopo la digestione in eccesso (destra; oltre digerito). (B) Zoomed in immagini (7,3 X) di tubi digeriti digeriti e oltre in (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sistema di modello di zebrafish è diventato un modello efficiente, efficace ed economico per studiare l'ematopoiesi vertebrato primitivo e definitiva. Generazione di saggi che sono veloci, poco costoso e presenta alcune difficoltà tecniche può essere utilizzato per test di piccole molecole, analizzando gli embrioni mutanti e delucidare i meccanismi molecolari importanti per la biologia HSPC. Placcatura in vitro di HSPCs dallo zebrafish adulto è un metodo efficace per studiare la mutagenesi e citochine ematopoietici difetti. Questo protocollo si basa su quegli studi, ma utilizza zebrafish embrionale. Applicando questi saggi di zebrafish embrionali consente per la raccolta di dati più veloce, l'utilizzo di meno spazio fisico, l'uso di meno farmaci (per schermi di droga) e permette test mRNA overespressione o atterramento di morpholino (MO) di vie genetiche specifiche. D'importanza, permette anche lo studio delle fasi dell'emopoiesi che si verificano solo durante lo sviluppo iniziale di vertebrati.
Grazie alla flessibilità di questo test, può essere facilmente modificata per soddisfare molte esigenze diverse. Una modifica del presente protocollo è la modulazione di temporizzazione dello sviluppo; modificare l'età degli embrioni utilizzati permette la quantificazione di generazione HSPC nel tempo. Questo può consentire anche lo studio di distinti sottoinsiemi di HSPCs come erythromyeloid progenitori6, che sorgono prima 36 hpf, contro bona fide HSCs3,4,5,8, che derivano in seguito. Nessuno è ancora stato in grado di isolare e identificare i sottogruppi HSPC zebrafish più limitati nell'embrione di sviluppo, ma questi saggi permettono di questi esperimenti. È essenziale che quando si cambiano le fasi di sviluppo degli animali, la quantità di celle aggiunte nella metilcellulosa è anche ottimizzata; troppo pochi animali non produrrà colonie, mentre troppo molti creerà un piatto non numerabile di colonie HSPC. L'aggiunta di diverse citochine è un'altra modifica che possa essere adattata agli specifici esperimenti. Aggiunta di Epo permetterà la quantificazione delle colonie eritroidi, mentre Gcsf permetterà di enumerazione delle colonie mieloidi. Aggiungere entrambe queste citochine permetterà generazione CFU multi-lignaggio. D'importanza, queste analisi permettono prove di putative citochine e loro effetto sulla HSPC proliferazione e differenziamento. Queste analisi possono anche essere modificate per eseguire il test di droga su larga scala; gli embrioni possono essere esposti a diverse concentrazioni di composti in diversi momenti durante lo sviluppo per vedere se i prodotti chimici hanno un effetto positivo o negativo sulla produzione di sangue. Un senso finale che possono essere modificati questi esperimenti è che gli embrioni possono essere iniettati nella fase di un cella con specifici mRNA o MOs, che saranno dei overexpress o atterramento geni specifici, rispettivamente. Dopo aver sviluppato per 24-48 h, questi embrioni possono essere sottoposti a queste analisi per determinare se guadagno o perdita di-funzione di specifici geni svolgono un ruolo essenziale nella formazione HSPC, proliferazione e differenziazione. È anche importante notare che utilizzando diversi ceppi transgenici di zebrafish sarà di aiuto nella velocità e la facilità di raccolta e interpretazione dei dati. Per esempio, se uno è interessato nello sviluppo degli eritrociti, è facile effettuare questi esperimenti in gata1: DsRed embrioni40, che hanno il promotore eritroide-specifico transgenici Gata1 fattore di trascrizione DsRed di guida fluorescenza. In questo modo, quando si analizzano le colonie degli eritrociti, microscopia a fluorescenza può essere utilizzata. Allo stesso modo, questi studi possono essere eseguiti su animali con più transgeni presenti per cercare di stirpi multipli delle cellule in una sola volta. Questa tecnica potrebbe essere utile per identificare HSPCs multilineare; anche se degli eritrociti e mieloidi colonie sono facilmente distinguibili dalla morfologia, è difficile identificare le colonie che contengono bipotential progenitori senza visualizzare la presenza di più l'espressione del transgene lineage-specifici nella stessa Colonia .
Anche se queste analisi hanno molti benefici, è essenziale per impostare controlli adeguati ogni volta che questi esperimenti sono effettuati; variazioni minori in tecnica potrebbero cambiare i risultati e le interpretazioni dei risultati. Ad esempio, è possibile ottenere diversi numeri di HSPCs quando si esegue gli esperimenti in giorni diversi, se la tua tecnica non è precisa; per affrontare questa possibilità, uno deve sempre includere un controllo appropriato. Se viene eseguito un esperimento per testare l'effetto di una MO su sviluppo, quindi controllare gli embrioni (o uninjected o iniettato con un controllo MO) che vengono dalla stessa frizione deve essere elaborato anche a fianco il campione sperimentale. Se l'esperimento è stato progettato per testare l'effetto di un particolare farmaco, campioni non trattati dovrebbero essere inclusi come un controllo. Infine, se gli effetti di una citochina specifica sullo sviluppo di test, quindi animali dalla frizione stessa dovrebbero anche essere elaborati ed esaminati allo stesso tempo senza avere la citochina aggiunta alla cultura.
Mentre questo test in vitro è semplice da eseguire e i risultati sono facili da interpretare, possono sorgere alcuni problemi potenziali durante la procedura. Se nessun colonie sono visibili dopo 7 giorni nella cultura, ci sono diversi problemi che possono essersi verificati. In primo luogo, controllare per assicurarsi che le citochine sono puro e alle concentrazioni adeguate; a seconda di come sono state prodotte le citochine possono essere necessario per alterare le concentrazioni e ottimizzare la loro attività. Un altro problema che comunemente si pone è over-digerire gli embrioni, che distrugge il HSPCs; prendersi cura nella fase di digestione e alterare i tempi se non colonie sono ripetutamente visto. Infine, la miscelazione di metilcellulosa e aggiunta di siero di carpa potrebbe essere il problema, quindi assicuratevi che tutti gli ingredienti sono stati aggiunti e mescolati correttamente. Oltre a problemi tecnici, è importante rendersi conto che le colonie possono bisogno più di sviluppare in determinate circostanze; spesso piccole colonie sono molto più visibili dopo ulteriori 3 giorni nella cultura. Andare oltre 10 giorni non è raccomandato, come la metilcellulosa inizia ad asciugarsi poco dopo. Un altro problema comune è che a volte colonie tendono a raccogliere intorno ai bordi dei piatti Petri 35 mm; le piastre di scansione accuratamente, specialmente intorno ai bordi, è essenziale. Inoltre, è importante ricordare che queste colonie si sviluppano in un materiale spesso, viscoso; quando messa a fuoco il microscopio, regolare il fuoco su e giù per osservare leggermente diversi aerei-le colonie saranno non seduti sul fondo dei piatti in plastica.
Questi saggi in vitro hanno un sacco di vantaggi, ma hanno anche alcune limitazioni. Il problema più grande è che queste analisi non possono dimostrare definitivamente che un progenitore è un HSC-che può essere dimostrata solo di ricostituzione a lungo termine di animali irradiati. Inoltre, non tutte le citochine sono state definite e studiate in zebrafish ancora, che limita i tipi di HSPCs che possono essere studiate. Per esempio, nessun citochine linfoide-solidale di zebrafish sono state identificate ancora, impedendo la produzione delle cellule T e B in queste analisi. Inoltre, non è chiaro quando la coltura HSPCs multipotenti se l'aggiunta di alcuni tipi (o quantità) di specifiche citochine possa distorcere la differenziazione giù determinate vie ematopoietici. Un altro potenziale avvertenza è che questo test non può discernere efficacemente se HSPCs siano effettivamente presenti in un campione, ma per qualche motivo non riescono a differenziare (o altrimenti non sono valide). Come con la maggior parte dei saggi in vitro , ulteriori esperimenti dovrebbero sempre essere eseguiti per convalidare i risultati. Escludendo questi problemi, molte informazioni possono essere raccolte da queste analisi clonali.
Queste analisi sono significative, perché consentono lo screening rapido ed efficiente dei difetti ematopoietici. I ricercatori possono abbattere alcune vie genetiche con MOs e piastra digerito animali per vedere se il gene svolge un ruolo nell'ematopoiesi. Inoltre, i pesci mutanti (precedentemente generato o appena generato nelle schermate di mutagenesi) possono essere valutata rapidamente e facilmente. Queste analisi consentono anche droga efficiente analisi selezione sugli organismi dal vivo, tutto per identificare la modulazione della biologia HSPC essendo anche in grado di osservare se i farmaci hanno un effetto negativo sullo sviluppo o sopravvivenza. Queste analisi consentono anche di quantificazione di HSPCs in zebrafish sviluppo timepoints diversi. Mentre gli studi multipli hanno tentato di quantificare numeri HSC per adulti7,27,30,41 , zebrafish embrionali3,4,42, 43, nessuno studio ha quantificato gli importi differenti di lignaggio-limitata HSPCs in zebrafish. Inoltre, queste analisi possono essere utilizzate per esaminare e modulare le vie molecolari importanti nella formazione dei globuli e differenziazione, un processo che rimane enigmatico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 a D.L.S.), il California State University Program per formazione & ricerca in biotecnologia (CSUPERB: controllo molecolare della nicchia emopoietica vertebrati a D.L.S.) e dall'ufficio studi universitari presso la California State University di Chico (a A.C.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
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