Summary
Här presenterar vi en enkel metod för att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) i embryonala zebrafiskar. HSPCs från dissocierade zebrafiskar är klädd i metylcellulosa med stödjande faktorer, att differentiera in mogna blodet. Detta möjliggör detektion av blod defekter och tillåter drug screening för att utföras enkelt.
Abstract
Blodbildningen är en viktig cellulär process där differentieras hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) till mängden olika cell härstamningar som utgör mogen blod. Isolering och identifiering av dessa HSPCs är svårt eftersom de är definierade ex post facto; de kan endast fastställas efter deras differentiering till viss cell härstamningar. Under de senaste decennierna blivit zebrafiskar (Danio rerio) modellorganism att studera blodbildning. Zebrafiskar embryon utveckla ex uterooch av 48 h efter befruktning (hpf) har genererat slutgiltig HSPCs. analyser för att utvärdera HSPC differentiering och spridning kapacitet har utvecklats, utnyttja transplantation och efterföljande beredning av hematopoetiska systemet förutom att visualisera specialiserade transgena linjerna med konfokalmikroskopi. Dessa analyser är dock kostnaden oöverkomliga, tekniskt svårt och tidskrävande för många laboratorier. Utveckling av ett in vitro- modell för att bedöma HSPCs skulle vara kostnadseffektiv, snabbare, och innebära färre svårigheter jämfört med tidigare beskrivna metoder, som tillåter laboratorier att snabbt bedöma mutagenes och drog skärmar som påverkar HSPC biologi. Denna nya in vitro- analys att bedöma HSPCs utförs av plätering separerade hela zebrafiskar embryon och lägga exogena faktorer som främjar endast HSPC differentiering och spridning. Embryon är separerade i enstaka celler och klädd med HSPC-stödjande kolonin stimulerande faktorer som orsakar dem att generera kolonin bildar enheter (CFUs) som uppstår från en enda progenitor cell. Dessa testmetoder bör tillåta mer noggrann undersökning av de molekylära vägarna ansvarar för HSPC proliferation, differentiering och förordning, vilket gör att forskare att förstå grunderna för ryggradsdjur blodbildning och dess dysreglering under sjukdom.
Introduction
Blodbildningen är processen att göra mängden mogna blodkroppar krävs för organismens överlevnad. Det är en viktig utvecklande process som involverar differentiering av hematopoetiska stamceller (Förenta) in i en mängd utvecklingsmässigt begränsad celltyper som utgör mogen blod. Dessa Förenta måste själv förnya så att systemet är aldrig slut och de måste kvarstår från tidig embryonal utveckling tills döden. Hos ryggradsdjur, konstant differentiering och spridning av hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) behövs för att fylla på lämpligt sätt på majoriteten av blodkroppar som är efter mitotiska och återvinns varje dag. Förenta generera mogna blodkroppar första differentiera i underuppsättningar av begränsad stamceller; gemensamma lymfoida stamfäder (CLPs)1, som så småningom producera T, B och NK celler, och gemensamma myeloida (CMPs)2 som genererar granulocyter, erytrocyter, makrofager och megakaryocyter. Dessa stamfäder har åtagit sig att generera viss cell härstamningar och ytterligare differentieras till mer utvecklingsmässigt begränsad stamceller såsom myeloisk erytroid stamfäder (ledamöter) som genererar erytrocyter och trombocyter eller granulocyt makrofag stamfäder (god tillverkningssed) som genererar basofiler, eosinofiler, neutrofiler och makrofager2. Att identifiera och isolera dessa stamfäder möjliggör identifiering av viktiga molekylära vägar inblandade i hematopoetiska differentiering och många hematopoetiska sjukdomar som leukemi uppstår när dessa stamceller inte korrekt differentiera.
Under de senaste decennierna, har zebrafisk (Danio rerio) modell systemet blivit en viktig forskningsverktyg för embryonala och vuxen hematopoetiska studier. Zebrafisk är mottagliga för genetisk analys och de fylogenetiskt lägsta ryggradsdjur modell arter som har en liknande vaskulatur och hematopoetiska systemet till människor. Zebrafiskar embryon utveckla ex utero, och inom 48 timmar efter befruktning (hpf) generera HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisk är också mycket fruktsam, med honor om över 100 ägg i en inre koppling, möjliggör stora urvalsstorlekar och experimentella replikering. Zebrafiskar embryon är optiskt transparenta, vilket möjliggör mikroskopiska visualisering av det hematopoetiska systemet. Flera fluorescerande transgena linjerna av zebrafisk märkning Förenta såsom runx1: andra fisk9, cd41: andra fisk10, och kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dubbel-positiva djur, Tillåt för levande, realtid visualisering av HSC framväxt och expansion i vivo3,4,7,8, 9. Den zebrafiskar snabb generation tid och utveckling ex utero har lett till dess användning i mutagenes studier11,12,13,14,15 och drog screening16,17,18,19,20 för föreningar som håller terapeutiska löfte för mänskliga blodsjukdomar. Bevarande av det hematopoetiska systemet, närvaro och enkel utveckling av transgena linjerna och snabb Renbränningstid har sammantaget gjort zebrafiskar en billig, snabb, flexibel och perfekt modell för hematopoetiska studier.
Många metoder att isolera och testning Förenta har utvecklats i däggdjur hematopoetiska system. Utredarna kan utnyttja en kombination av cellernas yta receptorer att markera Förenta21,22,23,24, samt utnyttja Förenta förmåga att efflux dye25,26. När de är märkta, kan fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) deras fysiska separation. Bevisar att en cell är en HSC kräver bestråla en värddjuret för att förstöra endogena HSPCs, omplantering förmodad Förenta, och observera långsiktiga, multi härstamning beredning av alla mogna blodkroppar typer. Dessa analyser fungerar bra i möss, som det finns många cellytan antikroppar mot hematopoetiska celler och inavlade mus stammar som underlättar immun matchande för transplantation. Några zebrafiskar hematopoetiska cellytan antikroppar har dock genererat27, hindra identifiering och isolering av Förenta. Det vanligaste sättet att markera och isolera zebrafiskar Förenta är med transgena djur, whereby en cell-specifika promotorn sekvens driver ett fluorescerande protein uttryck. Studier har visualiseras och uppräknade Förenta i ventrala väggen av dorsala aorta med mikroskopi utnyttja denna teknik3,4,8,9. Andra laboratorier har genererat klonal stammar av zebrafisk28,29 och har genomfört framgångsrika transplantationer i MHC-matchade djur30. Dock dessa tekniker är kostnadseffektivt oöverkomliga många laboratorier är tekniskt svåra och är tidskrävande. För att lösa dessa frågor, har laboratorier genererat flera in vitro- analyser att testa för närvaro, de spridning priserna och differentiering kapacitet HSPCs31,32,33, 34,35,36. Dessa analyser visar proliferation och differentiering av HSPCs in vitro-31,32,33,34,35,36, rädda hematopoetiska defekter36, och en effektiv metod för att upptäcka och testa cytokiner33,34,35. De har också använts för att identifiera gener som ansvarar för HSPC biologi31,32. I denna studie tar vi dessa analyser ett steg längre, så att kvantitering av HSPCs i en växande zebrafiskar embryot. Dessa analyser kan också användas för att kvantifiera antalet HSPCs i muterade djur och djur behandlas med hematopoetisk-störande droger. I huvudsak dessa analyser är snabb, nuvarande några tekniska utmaningar, och är billigt sätt att kvantifiera HSPC nummer, undersöka deras spridning och undersöka block i differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) advisory board vid California State University, Chico, godkända alla metoder beskrivs nedan.
1. blekmedel 48 hpf zebrafiskar embryon
- Med 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastbehållare skapa 3 wash stationer: 1) med 1 mL 5% blekmedel i 1000 mL embryo medium (E3, se tabell 1), 2) med sterila E3 och 3) med sterila E3. Kontrollera att varje behållare har 500 mL lösning att dränka embryona i.
Obs: För varje villkor som testats, minst 10 embryon kommer att behövas. Proceduren tvätt rymmer upp till 200 embryon. - Med överföring pipett, placera embryon i en tesil och dränka ägg i tvätt station #1 för 5 min. ta bort tesil (med embryon inuti) och placera in tvätt station #2 för 5 min; Upprepa för tvätt station #3 för en sista 5 min.
- Efter den sista tvättningen, skölj embryon från tesil genom att vrida den upp och ner över en ren 10 cm petriskål och försiktigt skölja embryon av tesil med steril E3 och överföring pipett.
2. Dechorionate embryon
- Med överföring pipett, ta bort och kassera så mycket E3 som möjligt från petriskål och tillsätt 500 μl av dechorionation proteashämmare (10 mg/mL) till embryon. Odla i rumstemperatur för 5 min. Knacka försiktigt på sidan av petriskål att helt ta bort chorions.
- Tillsätt 20 mL steril E3 att späda proteashämmare med serologiska pipett. Embryon sedimentera och bort på E3 med överföring pipett. Upprepa detta tvätta 3 gånger för att avlägsna alla spår av den dechorionation proteashämmaren.
3. förbereda Embryo prover
- Med P1000 pipett placera 10 embryon i ett enda steril 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Avlägsna E3 med en pipett och kassera.
Försiktighet: Pipettera med omsorg som embryon kan enkelt förflyttas och kasseras under följande tvätta steg.
4. förbereda embryon för Dissociation
- Överföra prover till LAF och tvätta embryon genom att tillsätta 1 mL steril E3. Tillåta embryon att bosätta sig botten av röret och ta bort supernatanten med P1000 pipett. Upprepa för sammanlagt 3 tvättar.
- Efter sista tvättningen, avlägsna E3 och kassera. Tillsätt 1 mL 10 mM Ditiotreitol (DTT) i E3 att avlägsna slem beläggning (och eventuella sporer, jäst, eller bakterier som kan fastna i det) kring den embryonala zebrafiskar. Låg mikrocentrifug rör horisontellt och odla i rumstemperatur i LAF i 25 min.
5. embryot Dissociation
- Tvätta prov 3 gånger med 1 mL steril DPBS (med Ca2 + och Mg2 +). Efter sista tvättningen tillsätt 500 μl av DPBS (med Ca2 + och Mg2 +) och tillsätt 5 μl av 5 mg/mL (26 U/mL) dissociation proteashämmare.
Varning: Detta enzym behöver Ca2 + och Mg2 +, så se till att DPBS innehåller dessa joner. - Inkubera prover vid 37 ° C i en horisontell orbital shaker vid 180 rpm för 60 min. plats prover i LAF och pulverisera embryon med en P1000 tills prover dissocieras fullt.
Försiktighet: Kontrollera embryon regelbundet för att avgöra när de blivit separerade. Embryo lösningen bör ha viss mängd vävnad närvarande; Det bör inte helt homogen. Det är möjligt att alltför digest, som kommer att förstöra de HSPCs (se kompletterande Figur1).
6. beredning av dissocierade embryon
- Pipett 10 dissocierade embryon på översta behållaren i en 5 mL polystyren runt botten rör med badmössa 35 μm cell SIL.
- Tag med en pipett filtrerade skölj Petri röret med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (med ingen Ca2 + eller Mg2 +) och överföring lösning 5 mL polystyren röret som innehåller celler från steg 6.1. Upprepa tills 4 mL vätska finns i 5 mL polystyren röret.
Obs: PBS, DPBS eller andra isoton buffrad lösningar kan användas i detta skede, så länge de inte innehåller Ca2 + eller Mg2 + - Centrifugera rören vid 4 ° C och 300 x g för 5 min till pellet homogeniserad cell provet. Med en pipett, avlägsna och Kassera supernatanten från rund botten röret. Var noga med att inte störa cellerna pelleterat på botten av röret. Att resuspendera cellerna i 100 μL av PBS.
7. förberedelse av metylcellulosa
- Generera 1 x komplett metylcellulosa (tabell 1) stamlösning och tillsätt 2,5 mL steril runda-botten 14 mL rör med 3 mL sprutor och 16 G nålar. Använd en tub för varje villkor som testas.
-
Lägg till cytokiner, små molekyler eller andra agenter för utredas till varje prov.
- För myeloisk differentiering, tillsätt 1% karp serum och 0,3 mg/mL rekombinant zebrafiskar granulocytkolonistimulerande faktor (Gcsf)34 till metylcellulosa medium. Se Svoboda o.a. 37 för fullständig beskrivning på hur till generera karp serum och rekombinant cytokiner.
- För erytroid differentiering, lägga till 1% karp serum och 0,1 mg/mL rekombinant zebrafiskar erytropoietin (Epo)38 metylcellulosa medium.
- För att undersöka Multilinjärt stamfäder, lägga till Epo och Gcsf.
Försiktighet: Cytokiner och tillsatser bör inte totalt mer än 10% av den totala volymen, som medium inte kommer att vara tillräckligt trögflytande för att urskilja enskilda kolonier.
8. tillägg av dissocierade embryon till metylcellulosa
- Med pipett, tillsätt 100 μL av dissocierade 10 embryon till ytan av den beredda metylcellulosa med rekombinant cytokiner och karp serum. Cap locket och vortexa försiktigt till fullt Homogenisera provet. Varje tub bör nu innehålla dissocierade vävnaden av 10 embryon.
- Med 3 mL sprutor och 16 G nålar, alikvotens 1 mL av provet i 2 separata 35 mm petriskålar. Se till att provet är fullt spridda över hela petriskål. Upprepa för varje prov.
- Placera 35 mm petriskålar med celler i metylcellulosa i en 15 cm petriskål. Varje 15 cm skålen, tillsätt en 35 mm Petri platta med 5 mL sterilt vatten för att fukta proverna. Inkubera vid 32 ° C och 5% CO2 i 7-10 dagar.
9. visualisering av HSPC-derived kolonibildande enheter (CFUs)
- Efter inkubation 7 dagar, placera prover på ett inverterat Mikroskop 40-100 X för visualisering och uppräkning. Vid denna punkt, kan enskilda kolonier isoleras med en pipett och utsätts för färgning eller gen analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma HSPC nummer i embryonala zebrafiskar, var 48 hpf embryon rötas, klädd i metylcellulosa med exogena hematopoetiska-stödjande tillväxtfaktorer och inkuberas i 7 dagar (figur 1A). Efter 7 dagar var koloni bildar enheter (CFUs) uppräknad (figur 1B) och avbildad (figur 1C). Genom att kontrollera de olika cytokiner som lagt till, kan man kontrollera vilka typer av kolonier producerad: Epo är nödvändigt för erytroid differentiering och Gcsf behövs för myeloisk differentiering. Karp serum är likartade för fetalt bovint serum's användning i däggdjur vävnadsodling; Det är en källa till allmän tillväxtfaktorer. I figur 1tillkom Epo, Gcsf och karp serum, så att uppräkning av erytroid, myeloisk och blandade erythromyeloid kolonier. Dessa kolonier kan skönjas på grund av sin form och färg; erytroid kolonierna är snäva, liten, kompakt och har en röd färg på grund av hemoglobinization. Myeloisk kolonierna är större och har fler motila celler på sina kanter, vilket ger dem en ruggig utseende.
Framgångsrika plätering av embryonala zebrafiskar behandlas med HSPC-stödjande faktorer ger CFUs efter 7-10 dagars inkubation. Ännu viktigare, kvantiteten av CFUs direkt korrelerar med antalet embryon pläterade (figur 1B). Plätering antingen 4 eller 8 embryon per mL (som korrelerar till börjar med 10 eller 20 embryon i början av experimentet) ger cirka 1.200 eller 2 400 CFUs, respektive. Våra protokoll föreslår 10 embryon, eftersom det är svårt och tidskrävande att räkna 2.400 CFUs när du utför en större experiment. På grund av metodiken för smälta hela embryon, diverse skräp är närvarande i metylcellulosa, men kan enkelt urskiljas från faktiska kolonier med högre förstoring i Mikroskop. Andra cellulära skräp kan också förekomma, men de enda CFUs närvarande blir HSPC-derived på grund av tillägg av HSPC-stödjande cytokiner. Om CFUs är små och inte enkelt sett, kan kulturerna inkuberas upp till 10 dagar att uppmuntra ökad tillväxt. Dock kommer att ökade inkubation inte ge mer CFUs; om CFUs inte är närvarande, detta visar en förlust av cytokin aktivitet, över matsmältningen av embryon (och efterföljande förstörelse av HSPCs; se kompletterande diagram 1), eller felaktig plätering av prover. Det är alltid viktigt att köra ordentliga kontroller varje gång detta experiment utförs för att säkerställa att små variationer i teknik inte ger falska skillnader i HSPC uppräkning. Till exempel om ett experiment utförs för att analysera antalet HSPCs i morphant embryon, bör ett prov med normala syskon utarbetas tillsammans med. Ett experiment har utförts för att jämföra effekten av en drog på utvecklingen av HSPCs ett prov med obehandlade syskon bör förberedas och analyseras tillsammans med.
Figur 1: Enumerating HSPC-derived CFUs från 48 hpf zebrafiskar embryon. (A) Schematisk översikt av embryo plätering på metylcellulosa med HSPC-stödjande cytokiner för generering av hematopoetiska CFUs. 48 hpf zebrafiskar embryon var separerade och ströks på 1% komplett metylcellulosa med erytropoietin (Epo), granulocyt kolonin stimulerande faktor (Gcsf) och karp serum, att låta erythromyeloid differentiering. (B) uppräkning av kolonibildande enheter (CFUs) från prover pläterade i koncentrationer på 4 eller 8 embryon per mL (start experimentet med 10 eller 20 embryon, respektive). Uppräkningen gjordes på 100 X på ett inverterat Mikroskop. Staplarna anger Genomsnittligt antal CFUs och felstaplar visar standardavvikelsen. (C) kolonin morfologi representant embryo plätering på metylcellulosa. Kolonins morfologi anger vilka typer av celler som utgör kolonin; bilder är representativa erytroid och myeloisk kolonier. CFUs fotograferad vid 400 X. Skala barer = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: nedbrytning av embryon med dissociation proteashämmare. (A) bilder av 10 embryon innan matsmältningen (vänster, osmält), efter adekvat matsmältningen (mellersta, smält), och efter överskott matsmältningen (höger; över smält). (B) zoomad i bilder (7,3 X) av smält och över smält rör i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk modellen systemet har blivit en effektiv, effektiv och billig modell för att studera primitiva och slutgiltiga ryggradsdjur blodbildning. Generation av analyser som är snabb, billig och presentera några tekniska svårigheter kan utnyttjas för testning små molekyler, analysera mutant embryon och klarlägga molekylära vägar viktigt för HSPC biologi. In vitro plätering av HSPCs från vuxna zebrafiskar är en effektiv metod att studera mutagenes, cytokiner och hematopoetiska defekter. Detta protokoll bygger på dessa studier, men använder embryonala zebrafiskar. Tillämpa dessa analyser till embryonala zebrafiskar möjliggör snabbare datainsamling, användning av mindre fysiskt utrymme, användning av mindre droger (för drogen skärmar), och tillåter testning mRNA överuttryck eller morpholino (MO) Nedslagning av specifika genetiska vägar. Ännu viktigare, gör det också studiet av stadier av blodbildningen som endast uppstår under tidiga ryggradsdjur utveckling.
På grund av flexibiliteten i denna analys, kan det lätt ändras för att tillgodose många olika behov. En ändring av detta protokoll är moduleringen av utvecklingstoxicitet timing; Ändra år embryon används tillåter kvantitering av HSPC generation över tid. Detta kan också tillåta att studera distinkta undergrupper av HSPCs såsom erythromyeloid stamfäder6, som uppstå innan 36 hpf, kontra bona fide Förenta3,4,5,8, som uppstår efteråt. Ingen har ännu kunnat isolera och identifiera mer begränsad zebrafiskar HSPC grupper i det växande embryot, men dessa analyser tillåta dessa experiment. Det är viktigt att när du ändrar utvecklingsstadierna av djuren, mängden celler läggas in metylcellulosa är också optimerad; för få djur ger inga kolonier, medan alltför många kommer skapa en oräkneliga platta av HSPC kolonier. Lägga olika cytokiner är en annan ändring som kan anpassas till specifika experiment. Lägga till Epo kommer tillåta kvantitering av erytroid kolonier, medan Gcsf kommer att tillåta uppräkning av myeloisk kolonier. Lägga till båda av dessa cytokiner kan flera härstamning CFU generation. Ännu viktigare, dessa analyser tillåter testning av förmodad cytokiner och deras effekt på HSPC proliferation och differentiering. Dessa analyser kan också ändras för att utföra storskaliga drogtester; embryon kan utsättas för olika koncentrationer av föreningar vid olika tidpunkter under utveckling för att se om kemikalierna som har en positiv eller negativ effekt på produktionen av blod. Ett sista sätt att dessa experiment kan ändras är att embryon kan injiceras i en-cellstadie med specifika mRNA eller MOs, som kommer överuttrycka eller knockdown specifika gener, respektive. Efter framkallning för 24-48 h, kan dessa embryon utsättas för dessa analyser avgöra om vinst - eller förlust-av-funktion av specifika gener spelar en viktig roll i HSPC formation, proliferation och differentiering. Det är också viktigt att notera att utnyttja olika transgena stammar av zebrafisk kommer stödet att hastighet och lätthet för att samla in och tolka data. Exempelvis om man är intresserad av erytroid utveckling, det är lätt att utföra dessa experiment i gata1: DsRed embryon40som har arrangören av erytroid-specifika transgena Gata1 Transkriptionfaktorn körning DsRed fluorescens. På detta sätt, när analysera erytroid kolonier, kan fluorescensmikroskopi utnyttjas. Jämväl, dessa studier kan utföras på djur med flera transgener närvarande för att leta efter flera cell linjer på en gång. Denna teknik skulle vara användbart för att identifiera Multilinjärt HSPCs; även erytroid och myeloisk kolonier är lätt urskiljbara av morfologi, är det svårt att identifiera kolonier som innehåller bipotential stamfäder utan visualisera förekomsten av flera härstamning-specifika transgenens uttryck i samma kolonin .
Även om dessa analyser har många fördelar, är det viktigt att inrätta lämpliga kontroller varje gång dessa experiment utförs; mindre ändringar i teknik kunde ändra resultat och tolkningar av resultaten. Exempelvis är det möjligt att få olika antal HSPCs när du utför experiment på olika dagar om din teknik inte är exakt; för att hantera denna möjlighet, bör man alltid innehålla en lämplig kontroll. Om ett experiment utförs för att testa effekten av en MO på utveckling och sedan styra embryon (antingen uninjected eller injiceras med en kontroll MO) som är från samma kopplingen bör också behandlas tillsammans med experimentella provet. Om experimentet är utformad för att testa effekten av en viss drog, då bör obehandlade prover ingå som en kontroll. Slutligen, om testning inverkan på utvecklingen av en specifik cytokin, sedan djur från samma kopplingen bör också bearbetas och granskas samtidigt utan de cytokin till kulturen.
Medan denna in vitro- analys är enkel att utföra och resultaten är lätta att tolka, uppstå några potentiella problem under förfarandet. Om inga kolonier ses efter 7 dagar i kultur, finns det flera problem som kan ha uppstått. Först kontrollerar du att cytokiner är ren och vid korrekt koncentrationer. beroende på hur cytokiner har producerats kan det vara nödvändigt att förändra koncentrationer och optimera sin verksamhet. En annan fråga som ofta uppkommer alltför smälta embryon, vilket förstör HSPCs; ta hand vid matsmältningen steg och ändra tidpunkten om inga kolonier ses flera gånger. Slutligen, blandning av metylcellulosa och tillägg av karp serum kan vara problemet, så se till att alla ingredienser var lagt till och blandade korrekt. Förutom tekniska frågor är det viktigt att inse att kolonierna kan behöva längre utvecklas under vissa omständigheter. ofta små kolonier är mycket mer synliga efter ytterligare 3 dagar i kultur. Gå förbi 10 dagar rekommenderas inte, eftersom metylcellulosa börjar torka ut kort därefter. Ett annat vanligt problem är att ibland kolonierna tenderar att samla runt kanterna på de 35 mm Petriskålarna; scanning plattorna ordentligt, särskilt runt kanterna, är viktigt. Det är också viktigt att komma ihåg att dessa kolonier utvecklar i en tjock, trögflytande material. När fokusera mikroskopet, justera fokus upp och ner för att observera något annorlunda kommer plan-kolonierna inte att sitta på undersidan av plast rätter.
Dessa in vitro- testmetoder har massor av fördelar, men de har också några begränsningar. Det största problemet är att dessa analyser slutgiltigt inte kan bevisa att en stamfader är en HSC-som enbart kan påvisas genom långsiktiga beredning av bestrålade djur. Dessutom har inte alla cytokiner definierats och undersökts hos zebrafiskar ännu, vilket begränsar typerna av HSPCs som kan undersökas. Ingen zebrafiskar lymfoida-stödjande cytokiner har exempelvis identifierats ännu, förebygga B och T-cell produktion i dessa analyser. Dessutom är det oklart när odling multipotenta HSPCs om tillägg av vissa typer av (eller belopp) av vissa cytokiner kan skeva differentieringen ner vissa hematopoetiska vägar. En annan potentiell förbehållet är att denna analys effektivt inte kan urskilja om HSPCs är närvarande i ett prov, men av någon anledning inte förmår skilja (eller inte annars är livskraftiga). Som med de flesta in vitro- analyser, bör ytterligare experiment alltid utföras för att verifiera resultaten. Frånsett dessa frågor mycket information kan härledas från dessa klonal analyser.
Dessa analyser är betydande, eftersom de tillåter snabb och effektiv screening av hematopoetiska defekter. Forskare kan slå ner vissa genetiska vägar med MOs och plattan rötas djur att se om genen spelar en roll i blodbildningen. Mutant fisk (tidigare genererade eller nyligen genererade i mutagenes skärmar) kan dessutom bedömas snabbt och enkelt. Dessa analyser även tillåta effektiv drug screening analyser på live, hela organismer att identifiera moduleringen av HSPC biologi samtidigt vara kunna observera om droger har en negativ effekt på utveckling eller överlevnad. Dessa analyser kan också kvantitering av HSPCs i den framkallande zebrafisk vid olika tidpunkter. Medan flera studier har försökt att kvantifiera HSC nummer i vuxen7,27,30,41 och embryonala zebrafiskar3,4,42, 43, inga studier har quantitated de olika mängder härstamning-begränsad HSPCs i zebrafiskar. Dessa analyser kan dessutom användas för att undersöka och modulera molekylära vägar viktigt i bildning av blodkroppar och differentiering, en process som förblir gåtfulla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansieringen tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 till D.L.S.), California State University programmet för utbildning och forskning inom bioteknik (CSUPERB: molekylär kontroll av Vertebrate hematopoetiska nisch till D.L.S.) och från Graduate Studies Office på California State University Chico (till A.C.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
