Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Udvikling af et In Vitro Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Her præsenterer vi en enkel metode til at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i embryonale zebrafisk. HSPCs fra dissocierede zebrafisk er belagt i methylcellulose med understøttende faktorer, differentiere til modne blod. Dette giver mulighed for påvisning af blod pixeldefekter og giver mulighed for narkotika screening for at foretages nemt.

Abstract

Bloddannelsen er en afgørende cellulære proces hvor hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) differentiere i mange forskellige celle slægter, der omfatter modne blod. Isolering og identifikation af disse HSPCs er vanskelig, fordi de er defineret ex post facto; de kan kun defineres efter deres differentiering af specifikke celle lineages. I de seneste par årtier, er zebrafisk (Danio rerio) blevet en model organisme at studere bloddannelsen. Zebrafisk embryoner udvikle ex utero, og af 48 timer efter befrugtning (hpf) har genereret definitive HSPCs. Assays for at vurdere HSPC differentiering og spredning kapaciteter er blevet udviklet, udnytte transplantation og efterfølgende rekonstituering af hæmatopoietisk systemet ud over visualisere specialiserede transgene linjer med Konfokal mikroskopi. Men disse assays er omkostningerne uoverkommelige, teknisk vanskeligt og tidskrævende for mange laboratorier. Udvikling af en in vitro- model til at vurdere HSPCs ville være omkostningseffektive, hurtigere, og færre vanskeligheder i forhold til tidligere beskrevne metoder, så laboratorier til hurtigt at vurdere mutagenese og narkotika skærme, der påvirker HSPC biologi. Denne roman i vitro assay at vurdere HSPCs er udført af plating dissocieres hele zebrafisk embryoner og tilføje eksogene faktorer, der fremmer kun HSPC differentiering og spredning. Embryoner er adskilles i enkelt celler og belagt med HSPC-støttende koloni stimulerende faktorer, der forårsager dem til at generere koloni danner enheder (CFUs) der opstår fra en enkelt stamfader celle. Disse assays skal tillade mere omhyggelig undersøgelse af de molekylære veje ansvarlig for HSPC spredning, differentiering og regulering, som giver forskere til at forstå fundament for hvirveldyr bloddannelsen og dens dysregulering under sygdom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bloddannelsen er processen med at gøre mange modne blodceller kræves for en organisme overlevelse. Det er en vigtig udviklingsproces, der involverer differentiering af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) ind i en række udviklingshæmmede begrænset celletyper, der omfatter modne blod. Disse HSCs skal selv forny, således at systemet aldrig er opbrugt, og de skal fortsætte fra begyndelsen embryonale udvikling indtil døden. I hvirveldyr, konstant differentiering og spredning af hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) er nødvendige for at tilstrækkeligt genbestilles fleste af blodlegemer, der er post mitotiske og bliver genanvendt hver dag. HSCs genererer modne blodceller af første differentiering i delmængder af begrænset stamceller; fælles lymfoide stamceller (CLPs)1, som i sidste ende producerer T-, B- og NK celler, og fælles myeloide stamceller (Kystforvaltningsplaner)2 , der genererer granulocytter, erytrocytter, makrofager og megakaryocytes. Disse ophav er forpligtet til at generere specifikke celle slægter, og yderligere differentiere i flere udviklingshæmmede begrænset stamceller som myeloid erythroid ophav (MEP'erne) at genererer erytrocytter og trombocytter eller granulocyt makrofag stamfaderen (GMPs), der genererer basofile, eosinofile, neutrofiler og makrofager2. At identificere og isolere disse stamfaderen giver identifikation af vigtige molekylære veje involveret i hæmatopoietisk differentiering og mange hæmatopoietisk sygdomme såsom leukæmi opstår når disse stamceller ikke korrekt differentiere.

I de seneste par årtier, er zebrafisk (Danio rerio) modelsystemet blevet en vigtig forskningsværktøj til embryonale og voksne hæmatopoietisk undersøgelser. Zebrafisk kan efterproeve genetisk analyse og er Fylogenetisk laveste hvirveldyr model arter, som har en lignende vaskulatur og hæmatopoietisk systemet til mennesker. Zebrafisk embryoner udvikle ex utero, og inden for 48 timer post befrugtning (hpf) generere HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisk er også yderst frugtbar, med hunnerne om over 100 æg i en enkelt kobling, giver mulighed for store stikprøvestørrelser og eksperimenterende replikering. Zebrafisk embryoner er optisk gennemsigtige, giver mulighed for mikroskopiske visualisering af hæmatopoietisk systemet. Flere fluorescerende transgene linjer af zebrafisk mærkning HSCs som runx1: EGFP fiske9, cd41: EGFP fiske10, og kdrl:mCherry; cmyb: normal god landbrugspraksis3 dobbelt-positive dyr, giver mulighed for live, real-time visualisering af HSC fremkomsten og ekspansion i vivo3,4,7,8, 9. Zebrafisks hurtig generation tid og udvikling ex utero har ført til dens anvendelse i mutagenese undersøgelser11,12,13,14,15 og stof screening16,17,18,19,20 til forbindelser, der holder terapeutiske lovende for menneskelige blodsygdomme. Bevarelse af hæmatopoietisk systemet, tilstedeværelse og nem udvikling af transgene linjer og hurtig regenerering tid har generelt gjort zebrafisk en billig, hurtig, fleksibel og ideel model for hæmatopoietisk undersøgelser.

Talrige metoder til isolering og test HSCs er blevet udviklet i pattedyr hæmatopoietisk systemer. Efterforskere kan udnytte en kombination af celle overfladen receptorer til at markere HSCs21,22,23,24, samt udnytte evne til HSCs at efflux farvestof25,26. Efter at de er mærket, tillader fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) deres fysiske adskillelse. Beviser, at en celle er en HSC kræver bestråling af en vært dyret at ødelægge endogene HSPCs, omplantning formodede HSCs, og observere langsigtede, multi lineage rekonstituering af alle modne blod celletyper. Disse assays fungerer godt i mus, som der er mange celle-overflade antistoffer mod hæmatopoietisk celler og indavlede mus stammer, der letter immun matchende til transplantation. Par zebrafisk hæmatopoietisk celle-overflade antistoffer har dog været genererede27, hindre identifikation og isolering af HSCs. Den mest almindelige måde at markere og isolere zebrafisk HSCs er med transgene dyr, hvorved en celle-specifikke promotor sekvens er drivkraften bag en fluorescerende proteiner udtryk. Undersøgelser har visualiseret og optalt HSCs i den ventrale mur af dorsal aorta med mikroskopi udnytte denne teknik3,4,8,9. Andre laboratorier har genereret klonede stammer af zebrafisk28,29 og har udført vellykkede transplantationer i MHC-matchede dyr30. Men disse teknikker er omkostningseffektivt uoverkommelige for mange laboratorier, er teknisk vanskeligt, og er tidskrævende. For at løse disse problemer, har laboratorier, der genereret flere in vitro- assays til at teste for forekomst, spredning priser og differentiering kapaciteten af HSPCs31,32,33, 34,35,36. Disse assays vis spredning og differentiering af HSPCs in vitro-31,32,33,34,35,36, redning af hæmatopoietisk defekter36, og en effektiv metode til at opdage og teste cytokiner33,34,35. De har også været udnyttet til at identificere gener ansvarlige for HSPC biologi31,32. I denne undersøgelse tager vi disse assays et skridt videre og giver mulighed for kvantificering af HSPCs i et embryo under udvikling zebrafisk. Disse undersøgelser kan også udnyttes til at kvantificere antallet af HSPCs i mutant dyr og dyr behandlet med hæmatopoietisk-forstyrrende stoffer. I bund og grund disse assays er hurtig, til stede nogle tekniske udfordringer, og billige måder at kvantificere HSPC numre, undersøge deres spredning og undersøge blokke i differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) advisory board på California State University, Chico, godkendt alle nedenfor beskrevne metoder.

1. blegemiddel 48 hpf zebrafisk embryoner

  1. Med 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastbeholdere oprette 3 wash stationer: 1) med 1 mL 5% blegemiddel i 1000 mL embryo medium (E3, se tabel 1), 2) med steril E3 og 3) med steril E3. Sikre, at hver beholder 500 mL af opløsning til dykke embryoner i.
    Bemærk: For hver betingelse testet, mindst 10 embryoner vil være nødvendig. Denne vask procedure kan rumme op til 200 embryoner.
  2. Med en overførsel pipette, placere embryoner i en tesi og dykke æg i Vaskehal #1 til 5 min. Fjern tesi (med embryoner inde) og placere i Vaskehal #2 for 5 min; Gentag for håndvask station #3 for en sidste 5 min.
  3. Efter den sidste vask, skyl embryoner fra tesi ved at dreje det op og ned over en ren 10 cm petriskål og forsigtigt skylning embryoner off tesi med steril E3 og overførsel pipette.

2. Dechorionate embryoner

  1. Med en overførsel pipette, fjerne og kassere så meget E3 som muligt fra petriskålen og tilsæt 500 μL af dechorionation protease (10 mg/mL) til embryoner. Inkuber ved stuetemperatur for 5 min. Tryk forsigtigt på siden af petriskål til helt at fjerne chorions.
  2. Med en serologisk pipette, tilsættes 20 mL sterilt E3 at udvande protease. Tillade embryoner nøjes, og fjerne E3 med en overførsel pipette. Gentag trinnet vask 3 gange for at fjerne alle spor af dechorionation protease.

3. forberedelse Embryo prøver

  1. Bruger en P1000 pipette, placere 10 embryoner i en enkelt sterile 1,5 mL microcentrifuge tube.
  2. Fjern E3 med en pipette og kassér.
    Forsigtig: Afpipetteres med omhu som embryoner kan nemt fordrevet og kasseres under følgende vaske trin.

4. forberedelse embryoner af Dissociation

  1. Overføre prøver til laminar flow hood, og vaske embryoner ved tilsætning af 1 mL sterilt E3. Tillade embryoner til at bilægge til bunden af røret og Fjern supernatanten med P1000 pipette. Gentag i alt 3 vasker.
  2. Efter sidste vask, fjerne E3 og kassér. Der tilsættes 1 mL af 10 mM dithiothreitol (DTT) i E3 at fjerne slim belægning (og sporer, gær eller bakterier, der kan blive fanget i det) omkring den embryonale zebrafisk. Lå microcentrifuge tube vandret, og der inkuberes ved stuetemperatur i laminar flow hood i 25 min.

5. embryo Dissociation

  1. Vask prøve 3 gange med 1 mL sterilt DPBS (med Ca2 + og Mg2 +). Efter sidste vask tilsættes 500 μl af DPBS (med Ca2 + og Mg2 +) og tilsættes 5 μl af 5 mg/mL (26 U/mL) dissociation protease.
    Forsigtig: Dette enzym behov Ca2 + og Mg2 +, så sikre, at DPBS indeholder disse ioner.
  2. Inkuber prøver ved 37 ° C på en vandret orbitalryster på 180 rpm for 60 min. sted prøver i laminar flow hood og hakkede embryoner med en P1000 indtil prøver er fuldt adskilt.
    Forsigtig: Kontrollere embryoner med jævne mellemrum at bestemme, hvornår de bliver adskilt. Embryo løsning bør have nogle beløb af væv til stede; Det bør ikke være helt ensartet. Det er muligt at overdreven digest, som vil ødelægge de HSPCs (Se supplerende fig. 1).

6. forberedelse af dissocierede embryoner

  1. Pipette på 10 dissocieres embryoner på den øverste reservoir af en polystyren, 5 mL runde nederste rør med en 35 μm celle si cap.
  2. Med en pipette filtreret skyl Petri tube med steril PBS (med ingen Ca2 + eller Mg2 +) og overførsel løsning til 5 mL polystyren tube indeholder celler fra trin 6.1. Gentag indtil 4 mL af væsken er til stede i 5 mL polystyren røret.
    Bemærk: PBS, DPBS eller andre isotonisk "buffered" løsninger kan anvendes i denne fase, så længe de ikke indeholder Ca2 + eller Mg2 +
  3. Der centrifugeres rør ved 4 ° C og 300 x g for 5 min at sammenpresse homogeniseret celle prøven. Med en pipette, Fjern og kassér supernatanten fra rund bund tube. Passe på at ikke forstyrre celler pelleted i bunden af røret. Resuspend celler i 100 μL af PBS.

7. forberedelse af Methylcellulose

  1. Generere 1 x komplet methylcellulose (tabel 1) stamopløsning og tilsættes 2,5 mL til sterile runde-bunden 14 mL rør med 3 mL sprøjter og 16 G nåle. Brug en tube for hver betingelse testet.
  2. Tilføje cytokiner, små molekyler eller andre agenter skal undersøges for hver enkelt prøve.
    1. Myeloid differentiering, tilføje 1% karper serum og 0,3 mg/mL rekombinant zebrafisk granulocyt koloni stimulerende faktor (Gcsf)34 til methylcellulose medium. Se Svoboda et al. 37 for fuld beskrivelse på hvordan man kan generere karper serum og rekombinant cytokiner.
    2. For erythroid differentiering, tilføje 1% karper serum og 0,1 mg/mL rekombinant zebrafisk erythropoietin (Epo)38 til methylcellulose medium.
    3. For at undersøge multilineage progenitorceller, tilføje Epo og Gcsf.
      Forsigtig: Cytokiner og tilsætningsstoffer bør ikke i alt mere end 10% af den samlede mængde, som mediet bliver tyktflydende nok at skelne enkelte kolonier.

8. tilføjelse af dissocierede embryoner til Methylcellulose

  1. Ved hjælp af en pipette, Tilsæt 100 μL af de dissocierede 10 embryoner til overfladen af den forberedte methylcellulose med rekombinant cytokiner og karper serum. Cap låg og vortex forsigtigt til fuldt homogeniseres prøve. Hver tube bør nu indeholde de dissocierede væv af 10 embryoner.
  2. Ved hjælp af 3 mL sprøjter og 16 G nåle, alikvot 1 mL af prøven i 2 separate 35 mm petriskåle. Sørg for, at prøven er fuldt spredt over hele petriskålen. Gentag for hver prøve.
  3. Placer 35 mm petriskåle med celler i methylcellulose i et 15 cm petriskål. Hver 15 cm parabol, tilføje en 35 mm Petri plade med 5 mL sterilt vand for at fugte prøverne. Der inkuberes ved 32 ° C og 5% CO2 i 7-10 dage.

9. visualisering af HSPC-afledte kolonidannende enheder (CFUs)

  1. Efter inkubation 7 dage, skal du placere prøver på en inverteret mikroskop på 40-100 X for visualisering og optælling. På dette tidspunkt, kan enkelte kolonier isoleret med en pipette og udsat for pletter og/eller gen analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at vurdere HSPC numre i embryonale zebrafisk, var 48 hpf embryoner fordøjet, forgyldt i methylcellulose med eksogene hæmatopoietisk-støttende vækstfaktorer og inkuberes i 7 dage (fig. 1A). Efter 7 dage blev koloni danner enheder (CFUs) optalt (figur 1B) og afbildet (figur 1C). Ved at kontrollere de forskellige cytokiner tilføjet, man kan styre typerne af kolonier produceret: Epo er nødvendige for erythroid differentiering og Gcsf er nødvendige for myeloide differentiering. Karpe serum er analog med føtal bovint serum brug i mammale væv kultur; Det er en kilde til generelle vækstfaktorer. I figur 1, blev Epo, Gcsf og karper serum tilføjet, at tillade tælling af erythroid, myeloid, og blandet erythromyeloid kolonier. Disse kolonier kan skimtes på grund af deres form og farve; erythroid kolonierne er stram, lille, kompakt og har en rød farve på grund af hemoglobinization. De myeloide kolonier er større og har mere motile celler på deres kanter, giver dem et pjusket udseende.

Vellykket plating af embryonale zebrafisk behandlet med HSPC-understøttende faktorer vil give CFUs efter 7-10 dage efter inkubation. Vigtigere, mængden af CFUs direkte korrelerer med antallet af embryoner forgyldt (figur 1B). Plating enten 4 eller 8 embryoner pr. mL (der korrelerer til at starte med 10 eller 20 embryoner i begyndelsen af eksperimentet) giver cirka 1.200 eller 2.400 CFUs, henholdsvis. Vores protokol foreslår at bruge 10 embryoner, som det er vanskeligt og tidskrævende at tælle 2.400 CFUs, når du udfører et større eksperiment. På grund af metoden af fordøje hele embryoner, Diverse rester er til stede i methylcellulose, men kan let skelnes fra faktiske kolonier med højere forstørrelse i mikroskopet. Andre celleaffald kan også være til stede, men de eneste CFUs nuværende bliver HSPC-afledte som følge af tilsætning af HSPC-støttende cytokiner. Hvis CFUs er små og ikke let ses, kan kulturer være udruget op til 10 dage til at tilskynde til øget vækst. Imidlertid vil øget inkubation ikke give flere CFUs; Hvis CFUs ikke er til stede, angiver et tab af cytokin aktivitet, over fordøjelsen af embryoner (og efterfølgende destruktion af HSPCs; Se supplerende fig. 1), eller forkert plating af prøver. Det er altid vigtigt at køre ordentlig kontrol, hver gang dette eksperiment udføres for at sikre, at små variationer i teknik ikke give falsk forskelle i HSPC optællingen. For eksempel, hvis et eksperiment udføres for at analysere antallet af HSPCs i morphant embryoner, bør en prøve med normale søskende være forberedt sammen med. Hvis et eksperiment er udført for at sammenligne effekten af et lægemiddel på udvikling af HSPCs bør en prøve med ubehandlet søskende forberedt og analyseret sammen med.

Figure 1
Figur 1: Optæller HSPC-afledte CFUs fra 48 hpf zebrafisk embryoner. (A) skematisk overblik af embryonet plating på methylcellulose med HSPC-støttende cytokiner for generation af hæmatopoietisk CFUs. 48 hpf zebrafisk embryoner blev adskilt og belagt på 1% komplet methylcellulose med erythropoietin (Epo), granulocyt koloni stimulerende faktor (Gcsf) og karper serum, giver mulighed for erythromyeloid differentiering. (B) optælling af kolonidannende enheder (CFUs) fra prøver belagt i koncentrationer på 4 eller 8 embryoner pr. mL (starter eksperimentet med 10 eller 20 embryoner, henholdsvis). Optællingen blev udført på 100 X på en inverteret mikroskop. Angiver gennemsnitlig tal af CFUs, og fejllinjer angiver standardafvigelsen. (C) koloni morfologi repræsentant for embryo plating på methylcellulose. Koloniens morfologi angiver typerne af celler, der omfatter kolonien; billeder er repræsentative erythroid og myeloide kolonier. CFUs fotograferet på 400 X. Skalere barer = 50 μm.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: fordøjelse af embryoner med dissociation protease. (A) billeder af 10 embryoner før fordøjelsen (venstre, ufordøjet), efter passende fordøjelse (midterste; fordøjet), og efter overskydende fordøjelsen (lige; over fordøjet). (B) zoome i billeder (7,3 X) af fordøjet og over fordøjet rør i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebrafisk modelsystemet er blevet en effektiv, effektiv og billig model til at studere primitive og endelige hvirveldyr bloddannelsen. Generation af assays, der er hurtig, billig, og præsentere nogle tekniske vanskeligheder kan udnyttes til at teste små molekyler, analysere mutant embryoner og belyse molekylære veje vigtigt for HSPC biologi. In vitro- plating af HSPCs fra voksne zebrafisk er en effektiv metode til at studere mutagenese, cytokiner og hæmatopoietisk defekter. Denne protokol bygger på disse undersøgelser, men udnytter embryonale zebrafisk. Anvende disse assays til embryonale zebrafisk giver mulighed for hurtigere dataindsamling, anvendelse af mindre fysisk plads, brug af mindre narkotika (for drug skærme), og tillader test mRNA overekspression og/eller morpholino (MO) knockdown af specifikke genetiske veje. Vigtigere, giver det også studiet af stadier af bloddannelsen, der kun forekommer i den tidlige hvirveldyr udvikling.

På grund af fleksibiliteten i dette assay, kan det nemt blive ændret for at imødekomme mange forskellige behov. En ændring af denne protokol er modulering af udviklingsmæssige timing; ændre en alder af embryoner udnyttet tillader kvantitering af HSPC generation over tid. Dette kan også give mulighed for undersøgelse af forskellige delmængder af HSPCs som erythromyeloid ophav6, der opstår før 36 hpf versus Bonafide HSCs3,4,5,8, som opstår bagefter. Ingen har endnu været i stand til at isolere og identificere mere begrænset zebrafisk HSPC delgrupper i den embryo under udvikling, men disse assays tillade disse eksperimenter. Det er vigtigt, når du ændrer udviklingsstadier af dyrene, mængden af celler tilføjede i methylcellulose er også optimeret; for få dyr vil give nogen kolonier, mens alt for mange vil skabe en utallige tallerken HSPC kolonier. Tilføjelse af forskellige cytokiner er en anden ændring, der kan tilpasses specifikke eksperimenter. Tilføje Epo vil tillade kvantitering af erythroid kolonier, mens Gcsf vil tillade optælling af myeloide kolonier. Tilføjelse af begge disse cytokiner vil tillade multi lineage CFU generation. Vigtigere, disse assays tillade afprøvning af formodede cytokiner og deres virkning på HSPC spredning og differentiering. Disse undersøgelser kan også ændres for at udføre omfattende test af lægemidler; embryoer kan blive udsat for forskellige koncentrationer af stoffer på forskellige tidspunkter under udviklingen at se, om kemikalierne, der har en positiv eller negativ virkning på blod produktion. En endelig måde at disse eksperimenter kan være ændret er, at embryoner kan sprøjtes på én-celle stadium med specifikke mRNA eller MOs, som bliver overexpress eller knockdown specifikke gener, henholdsvis. Efter udviklingen i 24-48 timer, kan disse embryoner blive udsat for disse assays til at bestemme, hvis gevinst eller tab-af-funktion af specifikke gener spiller en vigtig rolle i HSPC dannelse, spredning og differentiering. Det er også vigtigt at bemærke, at udnytte forskellige transgene stammer af zebrafisk vil støtte i hurtighed og lethed i at indsamle og fortolke data. For eksempel, hvis man er interesseret i erythroid udvikling, det er let at udføre disse eksperimenter i gata1: DsRed embryoner40, som er fortaler for den erythroid-specifikke transgene Gata1 transskription faktor kørsel DsRed fluorescens. På denne måde, når du analyserer erythroid kolonier, kan Fluorescens mikroskopi udnyttes. Ligeledes, disse undersøgelser kan udføres på dyr med flere transgener til stede for at lede efter flere celle lineages på én gang. Denne teknik ville være nyttigt til at identificere multilineage HSPCs; selv om erythroid og myeloide kolonier er let identificerbar ved morfologi, er det vanskeligt at identificere kolonier, der indeholder bipotential progenitorceller uden visualisere tilstedeværelsen af flere afstamning-specifikke transgen udtryk i den samme koloni .

Selv om disse assays har mange fordele, er det vigtigt at oprette passende kontrol, hver gang disse eksperimenter er udført; mindre variationer i teknik kunne ændre resultater og fortolkninger af resultaterne. For eksempel, er det muligt at få forskellige numre af HSPCs, når du udfører forsøgene på forskellige dage, hvis din teknik ikke er præcise; for at beskæftige sig med denne mulighed, bør man altid omfatte en passende kontrol. Hvis et eksperiment udføres for at teste effekten af en MO på udvikling og derefter kontrollere embryoner (enten uninjected eller injiceres med en kontrol MO), der er fra den samme kobling bør også behandles sideløbende med den eksperimenterende prøve. Hvis eksperimentet er designet til at teste effekten af et bestemt lægemiddel, skal derefter ubehandlet prøver medtages som en kontrol. Endelig, hvis prøvning af en bestemt cytokin virkninger på udviklingen, så dyr fra den samme kobling bør også behandles og undersøges på samme tid uden cytokin tilføjet til kultur.

Mens denne i vitro assay er ligetil at udføre, og resultaterne er nemme at fortolke kan nogle potentielle problemer opstå under proceduren. Hvis ingen kolonier ses efter 7 dage i kultur, er der flere problemer, der kan være opstået. Kontroller først, for at sikre at cytokiner er ren og i passende koncentrationer; afhængigt af hvordan cytokiner har produceret kan det være nødvendigt at ændre koncentrationer og optimere deres aktivitet. Et andet spørgsmål, der ofte opstår er over fordøje embryoner, som ødelægger HSPCs; Pas på trinnet fordøjelsen, og ændre timingen, hvis ingen kolonier ses gentagne gange. Endelig kunne blanding af methylcellulose og tilføjelse af karper serum være problemet, så sørg for at alle ingredienser blev tilføjet og blandet korrekt. Ud over tekniske spørgsmål er det vigtigt at indse, at kolonierne muligvis længere at udvikle under visse omstændigheder; ofte små kolonier er meget mere synlige efter yderligere 3 dage i kultur. Gå forbi 10 dage anbefales ikke, da methylcellulose begynder at tørre kort tid derefter. Et andet fælles problem er, at nogle gange kolonier tendens til at indsamle omkring kanterne af 35 mm petriskåle; scanning pladerne grundigt, især omkring kanterne, er afgørende. Det er også vigtigt at huske på at disse kolonier er ved at udvikle i en tyk, tyktflydende materiale; Når fokus mikroskop, justere fokus op og ned at observere lidt forskellige vil fly-kolonierne ikke blive siddende på bunden af de plast retter.

Disse in vitro- assays har masser af fordele, men de har også et par begrænsninger. Det største problem er, at disse analyser ikke kan bevise definitivt at en stamfader er en HSC-der kan kun bevises af langsigtede rekonstituering af bestrålede dyr. Derudover, har ikke alle cytokiner defineret og undersøgt i zebrafisk endnu, som begrænser typerne af HSPCs, der kan undersøges. For eksempel, er ingen zebrafisk lymfoide-støttende cytokiner konstateret endnu, at forhindre B og T-celle produktion i disse assays. Derudover er det uklart, når dyrkning Multipotente HSPCs hvis tilføjelsen af visse typer (eller beløb) af specifikke cytokiner kan forvrænge differentiering ned visse hæmatopoietisk veje. En anden potentiel advarsel er, at denne analyse effektivt ikke kan skelne, hvis HSPCs er faktisk er til stede i en prøve, men for en eller anden grund ikke er i stand til at differentiere (eller som ellers ikke er levedygtige). Som med de fleste in vitro- assays, skal yderligere eksperimenter altid udføres for at validere resultaterne. Spærring disse spørgsmål meget information kan udledes fra disse klonede assays.

Disse assays er væsentlige, fordi de giver mulighed for hurtig og effektiv screening af hæmatopoietisk defekter. Forskere kan banke ned visse genetiske veje med MOs, og pladen fordøjet dyr at se hvis genet spiller en rolle i bloddannelsen. Derudover vurderes mutant fisk (tidligere genereret eller nyligt genereret i mutagenese skærme) hurtigt og nemt. Disse assays tillader også effektive stof screening-assays på live, hele organismer til at identificere graduering af HSPC biologi samtidig også være i stand til at overholde, hvis stofferne har en negativ effekt på udvikling eller overlevelse. Disse assays også tillade kvantificering af HSPCs i den tredje zebrafisk på forskellige timepoints. Mens flere undersøgelser har forsøgt at kvantificere HSC numre i voksen7,27,30,41 og embryonale zebrafisk3,4,42, 43, ingen undersøgelser har quantitated de forskellige mængder af afstamning-begrænset HSPCs i zebrafisk. Derudover kan disse assays udnyttes til at undersøge og modulere molekylære veje vigtigt i blodlegemer dannelse og differentiering, en proces, der er stadig gådefulde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Finansieringen blev leveret af National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 til D.L.S.), California State University Program for uddannelse og forskning inden for bioteknologi (CSUPERB: Molekylær kontrol af hvirveldyr hæmatopoietisk Niche til D.L.S.) og studier på kontoret på California State University Chico (til A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Udvikling af et <em>In Vitro</em> Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter