Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Utvikling av In Vitro analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Her presenterer vi en enkel metode for å quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i embryonale sebrafisk. HSPCs fra avstand sebrafisk er belagt i methylcellulose med støttende faktorer, skille i eldre blod. Dette gjør påvisning av blod defekter og lar narkotikarelaterte screening for å utføres enkelt.

Abstract

Hematopoiesis er en viktig mobilnettet prosess der blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) skille ut en rekke ulike celle linjene som utgjør modne blod. Isolasjon og identifikasjon av disse HSPCs er vanskelig fordi de definerte ex post facto; de kan bare defineres etter deres differensiering inn bestemt celle overleveringslinjer. De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) blitt en modell organisme til å studere hematopoiesis. Sebrafisk embryo utvikle ex uteroog av 48 timer etter befruktning (hpf) har generert definitive HSPCs. analyser for å vurdere HSPC differensiering og spredning evner er utviklet, utnytte transplantasjon og påfølgende rekonstituering blodkreft systemet i tillegg til visualisere spesialiserte transgene linjer med AC confocal mikroskopi. Men er disse analyser kostnader uoverkommelige, teknisk vanskelig og tidkrevende for mange laboratorier. Utvikling av en i vitro modell å vurdere HSPCs ville være kostnadseffektive, raskere, og presentere færre problemer sammenlignet med tidligere beskrevet metoder, gir laboratorier for å vurdere mutagenese og narkotika skjermer som påvirker HSPC biologi. Denne romanen i vitro analysen å vurdere HSPCs utføres av plating dissosiert hele sebrafisk embryoer og legge ytre faktorer som fremmer bare HSPC differensiering og spredning. Embryo er atskilt i enkeltceller og belagt med HSPC-støttende koloni stimulerende faktorer som forårsaker dem til å generere kolonien danner enheter (CFUs) som oppstår fra en enkelt stamfar celle. Disse analyser bør tillate mer nøye undersøkelse av molekylære veier HSPC spredning, differensiering og regulering, som tillater forskere å forstå grunnlaget for virveldyrenes hematopoiesis og dens feilregulering under sykdom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hematopoiesis er prosessen med å lage mange eldre blod celler kreves for en organismes overlevelse. Det er en nøkkel utviklingsprosess som involverer differensiering av blodkreft stamceller (HSCs) til en rekke developmentally begrenset celletyper som utgjør modne blod. Disse HSCs må selv fornye slik at systemet aldri er oppbrukt og de må beholdes fra embryonale utviklingen til død. I virveldyr, konstant differensiering og spredning av blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) er nødvendig for å tilstrekkelig fylle fleste blod celler som post mitotisk og blir resirkulert hver dag. HSCs genererer eldre blod celler ved første skille i undergrupper av begrenset stamfar celler. vanlige lymfoide progenitors (CLPs)1, som til slutt produsere T, B og NK celler, og vanlige myelogen progenitors (CMPs)2 som genererer granulocytter, erytrocytter, makrofager og megakaryocytes. Disse progenitors er forpliktet til å generere bestemt celle overleveringslinjer og ytterligere skille ut flere developmentally begrenset stamfar celler som myelogen erythroid progenitors (parlamentet) som genererer erytrocytter og blodplater, eller granulocytt macrophage progenitors (GMPs) som genererer basofile, eosinofile, nøytrofile og makrofager2. Identifisere og isolere disse progenitors lar identifikasjon av viktige molekylær veier involvert i blodkreft differensiering og mange blodkreft sykdommer som leukemi oppstår når disse progenitor celler ikke riktig skille.

De siste tiårene, har sebrafisk (Danio rerio) modell systemet blitt en viktig forskningsverktøy for embryonale og voksen blodkreft studier. Sebrafisk er mottakelig for genetisk analyse og phylogenetically laveste virveldyr modell arter som har en lignende blodkar og blodkreft system for mennesker. Sebrafisk embryo utvikle ex utero, og innen 48 timer post generere befruktning (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Sebrafisk er også meget fruktbar, kvinner legge over 100 egg i en enkelt clutch, slik at store og eksperimentelle replikering. Sebrafisk embryoer er optisk gjennomsiktige, slik at mikroskopiske visualisering av blodkreft systemet. Flere fluorescerende transgene linjer med sebrafisk merking HSCs som runx1: EGFP fisk9, cd41: EGFP fisk10, og kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dobbel-positive dyr, tillate live, sanntids visualisering av HSC fremveksten og ekspansjon i vivo3,4,7,8, 9. Den sebrafisk rask generasjon tid og utvikling ex utero har ført til bruk i mutagenese studier11,12,13,14,15 og narkotika screening16,17,18,19,20 for forbindelser som holder terapeutiske løftet for menneskelig blod lidelser. Total, bevaring av blodkreft systemet, tilstedeværelse og enkel utvikling av transgene linjer og rask regenerering tid har gjort sebrafisk en billig, rask, fleksibel og ideelle modell for blodkreft studier.

Mange metoder for å isolere og testing HSCs har blitt utviklet i pattedyr blodkreft systemer. Etterforskerne kan bruke en kombinasjon av celleoverflaten reseptorer å merke HSCs21,22,23,24, i tillegg til å utnytte muligheten for HSCs å middelklasseinnbyggere fargestoff25,26. Etter at de er merket, kan aktiveres av fluorescens celle sortering (FACS) deres fysisk separasjon. Krever bevise at en celle er en HSC irradiating en vert dyr for å ødelegge endogene HSPCs, transplanting antatte HSCs, og observere langsiktige, flere avstamning rekonstituering alle eldre typer blodceller. Disse analyser fungere godt i mus, som det er mange celle-overflate antistoffer mot blodkreft cellene og innavlet musen stammer som letter immun matchende for transplantasjon. Men har noen sebrafisk blodkreft celle-overflate antistoffer vært generert27, hindre identifisering og isolering av HSCs. Den vanligste måten å merke og isolere sebrafisk HSCs er med transgene dyr, der en celle-spesifikke promoter sekvens kjører et fluorescerende protein uttrykk. Studier har visualisert og nummerert HSCs i ventrale veggen av dorsalis med mikroskopi utnytte denne teknikken3,4,8,9. Andre laboratorier har generert klonal stammer sebrafisk28,29 og har utført vellykket transplantasjon i MHC-matchet dyr30. Men disse teknikkene er kostnadseffektivt uoverkommelige for mange laboratorier, teknisk vanskelig, og er tidkrevende. For å løse disse problemene, har laboratorier generert flere i vitro analyser til å teste tilstedeværelsen, prisene spredning og differensiering kapasiteten HSPCs31,32,33, 34,35,36. Disse analyser viser spredning og differensiering av HSPCs i vitro31,32,33,34,35,36, redning av blodkreft defekter36og effektiv metode for å oppdage og testing cytokiner33,34,35. De har også blitt benyttet for å identifisere gener ansvarlig for HSPC biologi31,32. I denne studien ta vi disse analyser et skritt videre, slik at kvantifisering av HSPCs i en utvikling sebrafisk fosteret. Disse analyser kan benyttes for å quantitate antall HSPCs i mutant dyr og dyr behandlet med blodkreft-nedbrytende narkotika. I hovedsak disse analyser er rask, presentere noen tekniske utfordringer, og rimelige måter å quantitate HSPC tall, undersøke deres spredning og undersøke blokker i differensiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) advisory board på California State University i Chico, godkjent alle metodene som er beskrevet nedenfor.

1. blekemiddel 48 hpf sebrafisk embryo

  1. Med 15 cm (w) x 15 cm (l) x 7 cm (h) plastbeholdere opprette 3 vaskestasjoner: 1) med 1 mL av 5% blekemiddel i 1000 mL embryoet medium (E3, se tabell 1), 2) med sterilt E3, og 3) med sterilt E3. Kontroller at hver beholder har 500 mL løsning å senke embryoene i.
    Merk: For hvert vilkår testet, minst 10 embryo vil være nødvendig. Denne vask prosedyren kan romme opptil 200 embryoer.
  2. Med en overføring pipette, plassere embryo i en te sil og senke egg i vask stasjon #1 5 min. fjerne te sil (med embryo inne) og plassere vask Station #2 i 5 min; Gjenta for vask stasjon #3 for en siste 5 min.
  3. Etter siste vask, skyll embryoer fra te sil ved å slå det opp ned over en ren 10 cm Petriskål og forsiktig skylling embryo av te sil med sterilt E3 og en overføring pipette.

2. Dechorionate embryo

  1. Med en overføring pipette, fjerne og forkaste E3 så mye som mulig fra Petriskål og legge til 500 μL dechorionation protease (10 mg/mL) embryoer. Inkuber ved romtemperatur for 5 min. forsiktig trykker på siden av Petriskål å fjerne chorions.
  2. Legge til 20 mL steril E3 å fortynne protease en serologisk pipette. Tillate embryo å bosette seg, og fjerne E3 med en overføring pipette. Gjenta denne wash trinn 3 ganger for å fjerne alle spor av dechorionation protease.

3. forberedelser Embryo prøver

  1. Bruker en P1000 pipette, plassere 10 embryo i en enkelt bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube.
  2. Fjerne E3 med en pipette, og kast.
    Forsiktig: Pipetter forsiktig embryo kan lett forskyves og tapt under følgende vask.

4. forberede embryo dissosiasjon

  1. Overføre prøver å laminær strømning hette og vaske embryo ved å legge til 1 mL steril E3. Tillate embryo bosette til bunnen av rør og fjerne nedbryting med en P1000 pipette. Gjenta for totalt 3 vasker.
  2. Etter siste vask, fjerne E3 og kast. Legg 1 mL av 10 mM dithiothreitol (DTT) i E3 å fjerne slim belegg (og sporer, gjær, eller bakterier som kan være fanget i det) rundt den embryonale sebrafisk. Lå microcentrifuge tube horisontalt og ruge ved romtemperatur i laminær strømning panseret for 25 min.

5. embryo dissosiasjon

  1. Vask eksempel 3 ganger med 1 mL steril DPBS (med Ca2 + og Mg2 +). Etter siste vask legge 500 μL DPBS (med Ca2 + og Mg2 +) og legge til 5 μL 5 mg/mL (26 U/mL) dissosiasjon protease.
    Advarsel: Dette enzymet trenger Ca2 + og Mg2 +, så kontroller at DPBS inneholder disse ioner.
  2. Inkuber samples ved 37 ° C på en horisontal bane shaker på 180 rpm for 60 min. sted prøver i laminær strømning panseret og triturate embryo med en P1000 til prøvene er helt atskilt.
    Forsiktig: Kontroller embryo regelmessig for å fastslå når de blir atskilt. Fosteret løsningen bør ha noen mengde vev stede; Det bør ikke være helt homogent. Det er mulig å over digest, som vil ødelegge HSPCs (se supplerende figur 1).

6. forberedelse av dissosiert embryo

  1. Pipetter 10 dissosiert embryoer på topp reservoaret av en 5 mL polystyren rundt bunnen rør med en 35 μm celle sil cap.
  2. Med en pipette filtrert skyll Petri røret med sterilt PBS (med ingen Ca2 + eller Mg2 +) og overføring løsning 5 mL polystyren rør som inneholder celler fra trinn 6.1. Gjenta til 4 mL væske finnes i 5 mL polystyren røret.
    Merk: PBS, DPBS eller andre isotonic bufrede løsninger kan brukes på dette stadiet, så lenge de ikke inneholder Ca2 + eller Mg2 +
  3. Sentrifuge rør på 4 ° C og 300 x g for 5 min til pellets homogenisert celle prøven. Fjerne en pipette, og forkaste nedbryting fra rundt bunnen røret. Ta vare å ikke forstyrre cellene pelleted nederst på røret. Resuspend cellene i 100 μL PBS.

7. forberedelse av Methylcellulose

  1. Generere 1 x komplett methylcellulose (tabell 1) lagerløsning og legge til 2,5 mL steril runde bunn 14 mL rør med 3 mL sprøyter og 16 G nåler. Bruk en tube for hvert vilkår testet.
  2. Legg cytokiner, små molekyler eller andre agenter undersøkes til hvert utvalg.
    1. Legge til 1% karpe serum og 0,3 mg/mL sebrafisk som rekombinant granulocytt koloni stimulerende faktor (Gcsf)34 til methylcellulose middels myelogen differensiering. Se Svoboda et al. 37 for fullstendig beskrivelse om hvordan å generere karpe serum og rekombinant cytokiner.
    2. For erythroid differensiering, legge til 1% karpe serum og 0,1 mg/mL rekombinant sebrafisk erytropoietin (Epo)38 methylcellulose medium.
    3. For å undersøke multilineage progenitors, Legg Epo og Gcsf.
      Forsiktig: Cytokiner og tilsetningsstoffer bør ikke totalt mer enn 10% av det totale volumet, mediet blir ikke tyktflytende nok å skjelne personlige kolonier.

8. tillegg av dissosiert embryoene til Methylcellulose

  1. Bruker en pipette, tilsett 100 μL av de avstand 10 embryoene til overflaten av de forberedt methylcellulose med rekombinant cytokiner og karpe serum. Cap lokk og vortex forsiktig til fullt homogenize prøve. Hver rør skal nå inneholde dissosiert vev av 10 embryoer.
  2. Bruker 3 mL sprøyter og 16 G nåler, aliquot 1 mL av prøve i 2 separate 35 mm Petri retter. Kontroller at prøven er fullt spredt over hele Petriskål. Gjenta for hvert utvalg.
  3. Plass 35 mm Petri retter med celler i methylcellulose i en 15 cm Petriskål. Hver 15 cm rett, legge en 35 mm Petri plate med 5 mL sterilt vann for å fukte prøvene. Ruge på 32 ° C og 5% CO2 7-10 dager.

9. visualisering av HSPC-avledet kolonien danner enheter (CFUs)

  1. Etter rugende 7 dager, plassere eksempler på en invertert mikroskopet på 40-100 X for visualisering og nummerering. Foreløpig kan enkelte koloniene isolert med en pipette og utsatt for flekker og/eller genet analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å vurdere HSPC tall i embryonale sebrafisk, var 48 hpf embryo fordøyd, belagt i methylcellulose med ytre blodkreft-støttende vekstfaktorer og ruges i 7 dager (figur 1A). Etter 7 dager var koloni danner enheter (CFUs) opplistet (figur 1B) og fotografert (figur 1C). Ved å kontrollere de ulike cytokiner lagt, man kan kontrollere hvilke typer kolonier produsert: Epo er nødvendig for erythroid differensiering og Gcsf er nødvendig for myelogen differensiering. Karpe serum tilsvarer fosterets bovin serum bruk i pattedyr vev kultur; Det er en kilde til generell vekstfaktorer. I figur 1, ble Epo og Gcsf karpe serum lagt, slik at opplistingen av erythroid, myelogen og blandet erythromyeloid kolonier. Disse kolonier kan skjelnes på grunn av sin form og farge. erythroid koloniene er stramt, liten, kompakt, og har en rød farge på grunn av hemoglobinization. Myeloid koloniene er større og mer motile celler på kantene, gi dem en ruffled utseende.

Vellykket plating av embryonale sebrafisk behandlet med HSPC-støttende faktorer vil gi CFUs etter 7-10 dager etter inkubasjon. Viktigere, antallet CFUs samsvarer direkte med antall embryo belagt (figur 1B). Kontaktflate 4 eller 8 embryo per mL (som samsvarer med starter med 10 eller 20 embryo i begynnelsen av eksperimentet) gir ca 1200 eller 2400 CFUs, henholdsvis. Våre protokollen foreslår å bruke 10 embryoer, som det er vanskelig og tidkrevende å telle 2400 CFUs når du utfører en større eksperimentet. På grunn av metodikk fordøye hele embryo, diverse rusk i methylcellulose, men kan enkelt skjelnes fra faktiske koloniene med høyere forstørrelse under mikroskopet. Andre mobilnettet rusk kan også være til stede, men de eneste CFUs stede vil være HSPC-avledet på grunn av HSPC-støttende cytokiner. Hvis CFUs er små og ikke lett sett, kan kulturer være ruges opp til 10 dager å oppmuntre til økt vekst. Men vil økt inkubasjon ikke gi mer CFUs; Hvis CFUs ikke finnes, angir et tap av cytokin aktivitet, over fordøyelsen av embryo (og påfølgende ødeleggelse av HSPCs, se supplerende figur 1), eller feilaktig plating av prøver. Det er alltid viktig å kjøre riktig kontroller hver gang dette eksperimentet utføres for å sikre at små variasjoner i teknikken ikke gir falske forskjeller i HSPC-opplistingen. For eksempel hvis et eksperiment er utført for å analysere antall HSPCs i morphant embryo, bør et utvalg med normal søsken være forberedt sammen. Hvis et eksperiment er utført for å sammenligne effekten av et medikament på utviklingen av HSPCs en prøve med ubehandlet søsken bør være forberedt og analysert sammen.

Figure 1
Figur 1: Lister opp HSPC-avledet CFUs fra 48 hpf sebrafisk embryo. (A) skjematisk oversikt over fosteret plating på methylcellulose med HSPC-støttende cytokiner for generering av blodkreft CFUs. 48 hpf sebrafisk embryo var atskilt og belagt på 1% komplett methylcellulose med erytropoietin (Epo), granulocytt koloni stimulerende faktor (Gcsf) og karpe serum, slik at erythromyeloid differensiering. (B) opplisting av kolonien danner enheter (CFUs) fra prøver belagt i konsentrasjoner av 4 eller 8 embryo per mL (starter eksperimentet med 10 eller 20 embryoer, henholdsvis). Opplisting ble gjort på 100 X på en invertert mikroskop. Stolper angir gjennomsnittlig antall CFUs, og feilfelt viser standardavviket. (C) kolonien morfologi representative for fosteret plating på methylcellulose. Koloniens morfologi angir typene av celler som utgjør koloni. bilder er representative erythroid og myelogen kolonier. CFUs fotografert på 400 X. Skalere barer = 50 μm.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 1
Ekstra figur 1: fordøyelse av embryo med dissosiasjon protease. (A) bilder av 10 embryo før fordøyelsen (igjen, ufordøyd), etter tilstrekkelig fordøyelsen (midten, fordøyd), og etter overflødig fordøyelse (høyre; over fordøyd). (B) bratt stigning i bilder (7.3 X) av fordøyd og over fordøyd rør i (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sebrafisk modell systemet har blitt en effektiv, effektiv og rimelig modell for å studere primitive og definitive virveldyr hematopoiesis. Generasjon av analyser som er rask, billig, og presentere noen tekniske problemer kan utnyttes for testing små molekyler, analysere mutant embryoer og Klargjørende molekylær trasé viktig for HSPC biologi. In vitro plating av HSPCs fra voksen sebrafisk er en effektiv metode for å studere mutagenese cytokiner og blodkreft defekter. Denne protokollen bygger på disse studiene, men benytter embryonale sebrafisk. Bruk disse analyser til embryonale sebrafisk gir raskere datainnsamling, bruk av mindre fysisk plass, bruk av mindre narkotika (for narkotika skjermer), og tillater testing mRNA overuttrykte og/eller morpholino (MO) knockdown av bestemt genetisk. Viktigere, gjør det også studere stadier av hematopoiesis som bare oppstår under tidlig virveldyrenes utvikling.

På grunn av fleksibiliteten til denne analysen, kan den enkelt endres for å møte mange forskjellige behov. En endring av denne protokollen er modulering av utviklingsmessige timing; endre en alder av embryo utnyttet lar kvantifisering av HSPC generasjon over tid. Dette kan også tillate studiet av forskjellige undergrupper av HSPCs som erythromyeloid progenitors6, som oppstår før 36 hpf, versus bona fide HSCs3,4,5,8, som oppstår etterpå. Ingen ennå har vært i stand til å isolere og identifisere mer begrenset sebrafisk HSPC delsett i utviklingsland fosteret, men disse analyser tillate disse eksperimentene. Det er viktig at når du endrer utviklingsstadier av dyrene, mengden av celler som er lagt inn i methylcellulose er også optimalisert; for få dyr vil gi ingen kolonier, mens for mange vil skape en utallige plate HSPC kolonier. Legge ulike cytokiner er en annen endring som kan tilpasses spesifikke eksperimenter. Legge Epo vil tillate kvantifisering av erythroid kolonier, mens Gcsf vil tillate opplisting av myelogen kolonier. Legge til begge disse cytokiner vil tillate flere avstamning CFU generasjon. Viktigere, tillater disse analyser testing av antatte cytokiner og deres innvirkning på HSPC spredning og differensiering. Disse analyser kan også endres for å utføre storskala-narkotikatesting; embryo kan bli utsatt for ulike konsentrasjoner av forbindelser på ulike tidspunkt under utviklingen å se om kjemikalier har en positiv eller negativ effekt på blod produksjonen. En siste måten at disse eksperimentene kan endres er at embryoer kan injiseres på en celle scenen med bestemte mRNA eller MOs, som vil overexpress eller pusse bestemte gener, henholdsvis. Etter å utvikle 24-48 h, kan disse Foster utsettes for disse analyser å avgjøre hvis gevinst - eller tap-av-funksjon av bestemte gener spille en viktig rolle i HSPC formasjon, spredning og differensiering. Det er også viktig å merke seg at utnytte ulike transgene stammer av sebrafisk vil hjelpe i hastighet og brukervennlighet innsamling og tolke data. For eksempel, hvis man er interessert i erythroid utvikling, er det enkelt å utføre disse eksperimentene på gata1: DsRed embryo40, som har arrangøren av erythroid-spesifikke transgene Gata1 transkripsjon faktor kjøring DsRed fluorescens. På denne måten, når du analyserer erythroid kolonier, kan fluorescens mikroskopi benyttes. Likeledes, disse studiene kan utføres på dyr med flere effekter av transgener å se etter flere celle overleveringslinjer samtidig. Denne teknikken ville være nyttig for å identifisere multilineage HSPCs; Selv om erythroid og myelogen koloniene er lett identifiserbar av morfologi, er det vanskelig å identifisere kolonier som inneholder bipotential progenitors uten visualisere tilstedeværelsen av flere slektslinje kundespesifikk transgene uttrykk i samme kolonien .

Selv om disse analyser har mange fordeler, er det viktig å definere tilstrekkelig kontroller hver gang disse eksperimentene er utført; mindre variasjoner i teknikken kan endre resultatene og tolkninger av funnene. For eksempel er det mulig å få ulike tall for HSPCs når du utfører eksperimenter på ulike dager hvis teknikken ikke er nøyaktig; for å håndtere denne muligheten, bør man alltid inkludere en passende kontroll. Hvis et eksperiment er utført for å teste effekten av en MO på utvikling, og deretter kontrollere embryo (enten uninjected eller injisert med en kontroll MO) fra samme clutch bør også behandles sammen med eksperimentelle prøven. Hvis forsøket er utviklet for å teste effekten av et bestemt medikament, bør så ubehandlet prøver være inkludert som en kontroll. Endelig hvis tester effekter av et bestemt cytokin på utvikling, bør deretter dyr fra samme clutch også være behandlet og undersøkt samtidig uten cytokin lagt til kultur.

Mens denne i vitro analysen er enkelt å utføre og resultatene er lett å tolke, kan noen potensielle problemer oppstå under prosedyren. Hvis ingen kolonier er sett etter 7 dager i kultur, er det flere problemer som har oppstått. Først kontrollerer du at cytokiner er ren og i riktig konsentrasjoner; avhengig av hvordan cytokiner er produsert kan det være nødvendig å endre konsentrasjoner og optimalisere deres aktivitet. Et annet problem som ofte oppstår er over fordøye embryoer, som ødelegger HSPCs; ta vare på den fordøyelse trinnet, og endre tidspunktet hvis ingen kolonier vises gjentatte ganger. Til slutt, blanding av methylcellulose og tillegg av karpe serum kan være problemet, så sørg for at alle ingredienser ble lagt til og blandet riktig. I tillegg til tekniske problemer er det viktig å innse at koloniene kan trenger lenger å utvikle under visse omstendigheter; ofte små koloniene er mye mer synlig etter ytterligere 3 dager i kultur. Gå forbi 10 dager anbefales ikke, som methylcellulose begynner å tørke ut kort tid etterpå. Et annet vanlig problem er at noen ganger kolonier pleier å samle rundt kantene på 35 mm Petri retter; skanning platene grundig, spesielt rundt kantene, er viktig. Det er også viktig å huske at disse kolonier utvikler i en tykk, tyktflytende materiale; Når fokus mikroskopet, justerer fokus opp og ned for å observere litt annerledes skal fly-koloniene ikke sitte på bunnen av plast retter.

Disse i vitro analyser har mange fordeler, men de har også noen begrensninger. Det største problemet er at disse analyser ikke kan bevise definitivt at en stamfar er en HSC-det kan bare være bevist av langsiktig rekonstituering bestrålt dyr. I tillegg er ikke alle cytokiner definert og undersøkt i sebrafisk ennå, som begrenser hvilke typer HSPCs som kan bli undersøkt. For eksempel, har ingen sebrafisk lymfoid-støttende cytokiner blitt identifisert ennå, forebygge B og T-celle produksjon i disse analyser. Det er uklart når dyrking multipotent HSPCs hvis tillegg av visse typer eller mengder bestemt cytokiner kan forskyve differensiering ned visse blodkreft trasé. En annen potensiell påminnelse er at denne analysen effektivt ikke kan skjelne hvis HSPCs er tilstede i en prøve, men for noen grunn ikke klarer å skille (eller ellers ikke levedyktig). Som med de fleste i vitro analyser, skal ytterligere eksperimenter alltid utføres for å validere resultatene. Sperring problemene, mye informasjon kan være gleaned fra disse klonal analyser.

Disse analyser er viktig, fordi de tillater rask og effektiv screening av blodkreft defekter. Forskere kan slå ned visse genetisk veier med MOs og plate fordøyd dyr å se hvis genet spiller en rolle i hematopoiesis. I tillegg kan mutant fisk (tidligere generert eller nylig generert i mutagenese skjermer) vurderes raskt og enkelt. Disse analyser kan også effektiv narkotika screening analyser på live, hele organismer å identifisere modulering av HSPC biologi samtidig være stand til å observere om narkotika har en negativ effekt på utvikling eller overlevelse. Disse analyser også tillate kvantifisering av HSPCs i utviklingsland sebrafisk på forskjellige timepoints. Mens flere studier har forsøkt å quantitate HSC tall i voksen7,27,30,41 og embryonale sebrafisk3,4,42, 43, ingen studier har quantitated forskjellige mengder herkomst begrenset HSPCs i sebrafisk. Disse analyser kan i tillegg benyttes for å undersøke og modulere molekylær trasé viktig i blodceller dannes og differensiering, en prosess som forblir gåtefull.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Midler ble gitt av National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 til D.L.S.), California State University programmet for utdanning og forskning i bioteknologi (CSUPERB: molekylære kontroll av virveldyr blodkreft nisje til D.L.S.) og fra diplomstudium kontoret i California State University Chico (til A.C.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
Utvikling av <em>In Vitro</em> analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter