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Developmental Biology

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

doi: 10.3791/56836 Published: November 30, 2017

Summary

Aqui, apresentamos um método simples para dosar o tronco e progenitoras células hematopoiéticas (HSPCs) no zebrafish embrionária. HSPCs de zebrafish dissociado são banhados em metilcelulose com fatores de apoio, diferenciando-se em sangue maduro. Isto permite a detecção de sangue defeitos e permite para ser facilmente conduzida de despistagem de drogas.

Abstract

Hematopoiese é um processo essencial de celular no qual células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) diferenciarem-se na multiplicidade de linhagens diferentes de células que compõem o sangue maduro. Isolamento e identificação destes HSPCs é difícil, porque eles são definidos ex post facto; Eles só podem ser definidos após sua diferenciação em linhagens de células específicas. Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar a hematopoiese. Embriões de zebrafish desenvolvem ex uteroe pela pós-fertilização de 48 h (hpf) geraram definitivo HSPCs. ensaios para avaliar a diferenciação HSPC e capacidades de proliferação foram desenvolvidas, utilizando o transplante e subsequente reconstituição do sistema hematopoiético além de Visualizar linhas transgénicas especializadas com microscopia confocal. No entanto, estes ensaios são custo proibitivo, tecnicamente difícil e demorado para muitos laboratórios. Desenvolvimento de um modelo in vitro para avaliar HSPCs seria custo-eficaz, mais rápido, e presentes menos dificuldades em relação ao anteriormente descritos métodos, permitindo que os laboratórios avaliar rapidamente telas mutagênese e drogas que afetam a biologia HSPC. Este romance em vitro ensaio para avaliar a HSPCs é realizado pelo chapeamento dissociado do zebrafish toda embriões e adicionando fatores exógenos que promovem a proliferação e diferenciação de HSPC. Os embriões são dissociados em células únicas e chapeados com HSPC-apoio fatores de estimulante de colônia que levá-los a gerar colônia formando unidades (CFUs) que surgem a partir de uma célula progenitora único. Estes ensaios devem permitir análise mais cuidadosa das vias moleculares responsáveis pela HSPC proliferação, diferenciação e regulamento, que permitirá que os pesquisadores a entender os fundamentos da hematopoiese vertebrado e sua desregulação durante a doença.

Introduction

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Hematopoiese é o processo de fazer a multidão de células maduras do sangue necessário para a sobrevivência do organismo. É uma chave no desenvolvimento do processo que envolve a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) em uma variedade de tipos de células desenvolvente restrito que compõem o sangue maduro. Estes linfócitos auto devem renovar para que o sistema nunca está esgotado e eles devem persistir de desenvolvimento embrionário precoce até à morte. Nos vertebrados, constante diferenciação e proliferação de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são necessários para repor adequadamente a maioria das células do sangue que são pós mitóticas e sendo reciclados todos os dias. Linfócitos geram células maduras do sangue por primeira diferenciação em subconjuntos de células progenitoras restrito; comum progenitores linfoides (CLPs)1, que eventualmente produzir células T, B e NK e comum progenitores mieloides (CMPs)2 que geram granulócitos, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos. Estes progenitores estão empenhados em gerar linhagens de células específicas e diferenciarem ainda mais em mais células progenitoras desenvolvente restrito como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que geram eritrócitos e plaquetas ou granulócitos progenitores do macrófago (GMPs) que geram basófilos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos2. Identificando e isolando esses progenitores permitem a identificação de importantes vias moleculares envolvidos na diferenciação hematopoiética e muitas doenças hematopoiéticas, como a leucemia surgem quando essas células progenitoras não corretamente Diferencie-se.

Ao longo das últimas décadas, o modelo de sistema de peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta chave de pesquisa para estudos hematopoiéticas adultas e embrionárias. Zebrafish são passível de análise genética e são as espécies de vertebrados modelo filogeneticamente menores que têm um sistema vascular semelhante e sistema hematopoiético aos seres humanos. Desenvolvem de embriões de zebrafish ex utero, e dentro de 48 horas pós fertilização (hpf) gerar HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish são também altamente fecundo, com fêmeas deitado sobre 100 ovos em uma única embreagem, permitindo a replicação experimental e tamanhos de amostra grande. Zebrafish embriões são opticamente transparentes, permitindo a visualização microscópica do sistema hematopoiético. Várias linhas de transgênicas fluorescentes de zebrafish marcando linfócitos como runx1: EGFP peixe9, cd41: EGFP peixe10, e kdrl:mCherry; CMap: animais de duplo-positivo do GFP3 , permitem a visualização em tempo real de HSC surgimento e expansão na vivo3,4,7,8, 9. Geração rápido tempo e desenvolvimento ex utero do zebrafish conduziu a seu uso em mutagênese estudos11,12,13,14,15 e drogas rastreio de16,17,18,19,20 para compostos que mantêm a promessa terapêutica para distúrbios do sangue humano. Em geral, conservação do sistema hematopoiético, a presença e o desenvolvimento fácil de linhas transgénicas e tempo de regeneração rápida fez o zebrafish um modelo barato, rápido, flexível e ideal para estudos hematopoiéticos.

Numerosos métodos de isolamento e testes de linfócitos foram desenvolvidos em mamíferos sistemas hematopoiéticos. Os investigadores podem utilizar uma combinação de receptores de superfície celular para marcar linfócitos21,22,23,24, bem como explorar a capacidade dos linfócitos de efluxo tintura25,26. Depois que eles são rotulados, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação permite que a sua separação física. Provar que é uma célula de um HSC requer irradiando um animal hospedeiro para destruir HSPCs endógenos, transplantando linfócitos putativos e observando a longo prazo, linhagem multi reconstituição de todos amadurecem tipos de células do sangue. Estes ensaios funcionam bem em ratos, como existem numerosos da pilha-superfície anticorpos contra células hematopoiéticas e linhagens puras do mouse que facilitam a correspondência imune para transplante. No entanto, alguns zebrafish anticorpos de superfície de células hematopoiéticas foram gerados27, dificultando a identificação e isolamento de linfócitos. A maneira mais comum para marcar e isolar linfócitos zebrafish é com animais transgénicos, segundo o qual uma sequência do promotor celular específico está dirigindo expressão de uma proteína fluorescente. Estudos têm visualizado e enumerado de linfócitos na parede ventral da aorta dorsal com microscopia utilizando esta técnica3,4,8,9. Outros laboratórios geraram variedades clonais de zebrafish28,29 e realizaram transplantes bem sucedidos em animais MHC-combinadas30. No entanto, essas técnicas são custo proibitivo para muitos laboratórios são tecnicamente difíceis e são demoradas. Para solucionar esses problemas, laboratórios têm gerado vários ensaios em vitro para testar para a presença, as taxas de proliferação e a capacidade de diferenciação de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estes ensaios mostram proliferação e diferenciação dos HSPCs em vitro31,32,33,34,35,36, o resgate de hematopoiéticas defeitos36e um método eficiente para descobrir e testar citocinas33,34,35. Eles também têm sido utilizados para identificar os genes responsáveis pela HSPC biologia31,32. Neste estudo, tomamos estes ensaios um passo adiante, permitindo a quantificação de HSPCs em um embrião em desenvolvimento do zebrafish. Estes ensaios também podem ser utilizados para quantificar o número de HSPCs em animais mutantes e os animais tratados com drogas hematopoiéticas interrupções. Em essência, estes ensaios são rápidos, presentes alguns desafios técnicos e maneiras baratas de dosar números HSPC, examinar sua proliferação e investigar blocos na diferenciação.

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Protocol

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Conselho Consultivo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.

1. bleach 48 hpf Zebrafish embriões

  1. Com 15 cm (w) x 15 cm (l) x recipientes plásticos de 7cm (h) criar 3 estações de lavagem: 1) com 1 mL de água sanitária de 5% em 1000 mL de meio de embrião (E3; ver tabela 1), 2) com E3 estéril e 3) com E3 estéril. Certifique-se de que cada contêiner tem 500 mL de solução a submergir os embriões em.
    Nota: Para cada condição testada, pelo menos 10 embriões serão necessários. Este procedimento de lavagem pode acomodar até 200 embriões.
  2. Com uma pipeta de transferência, colocar os embriões em um coador de chá e mergulhe os ovos na estação de lavagem #1 por 5 min. Retire o coador de chá (com embriões dentro) e coloque no estação de lavagem #2 por 5 min; Repita para a estação de lavagem #3 para um final 5 min.
  3. Após a última lavagem, enxaguamento embriões de coador de chá, transformando-o de cabeça para baixo sobre um limpa de Petri de 10 cm e enxaguando suavemente embriões fora o coador de chá com E3 estéril e uma pipeta de transferência.

2. Dechorionate embriões

  1. Com uma pipeta de transferência, remover e descartar E3 tanto quanto possível da caixa de Petri e adicionar 500 μL de dechorionation protease (10 mg/mL) de embriões. Incube a temperatura ambiente por 5 min. Bata levemente o lado da caixa de Petri para remover completamente o chorions.
  2. Com uma pipeta sorológica, adicione 20 mL de E3 estéril para diluir a protease. Permitir que embriões resolver e remover o E3 com uma pipeta de transferência. Repita essa etapa de lavagem 3 vezes para remover todos os vestígios de protease a dechorionation.

3. preparação de amostras de embrião

  1. Usando uma pipeta P1000, coloque 10 embriões em um tubo de microcentrifugadora único estéril 1,5 mL.
  2. Retire E3 com uma pipeta e descarte.
    Cuidado: Pipetar com cuidado como embriões podem ser facilmente deslocados e descartados durante as etapas de lavagem a seguir.

4. preparação de embriões para dissociação

  1. Transferir as amostras para fluxo laminar hood e lavar os embriões, adicionando 1 mL estéril E3. Permitir que os embriões resolver a parte inferior do tubo e remover o sobrenadante com uma pipeta P1000. Repita para um total de 3 lavagens.
  2. Após a última lavagem, remova a E3 e descarte. Adicione 1 mL de 10mm ditiotreitol (DTT) na E3 para remover o revestimento de muco (e qualquer esporos, leveduras ou bactérias que podem ser presos nele) cercando o zebrafish embrionário. Colocar o tubo microcentrifuga horizontalmente e incubar a temperatura ambiente na capa de fluxo laminar para 25 min.

5. o embrião dissociação

  1. Lave a amostra 3 vezes com 1 mL de estéril DPBS (com Ca2 + e Mg2 +). Após a última lavagem, adicione 500 μL de DPBS (com Ca2 + e Mg2 +) e adicione 5 μL de protease de dissociação de 5 mg/mL (26 U/mL).
    Atenção: Esta enzima precisa de Ca2 + e Mg2 +, para garantir que o DPBS contém esses íons.
  2. Incubar as amostras a 37 ° C em um agitador orbital horizontal a 180 rpm para amostras de 60 min. lugar do capuz de fluxo laminar e triture os embriões com uma P1000 até amostras são totalmente dissociadas.
    Atenção: Verifique embriões periodicamente para determinar quando eles se tornam dissociados. A solução de embrião deve ter alguma quantidade de tecido presente; Não deve ser completamente homogêneo. É possível digerir excesso, que destruirá as HSPCs (ver suplementar Figura 1).

6. preparação dos embriões dissociadas

  1. Embriões de pipeta 10 dissociada para o reservatório superior de um poliestireno 5ml redondo tubo inferior com uma tampa de filtro de célula de 35 μm.
  2. Com uma pipeta, enxaguar o tubo de Petri com solução de transferência para poliestireno tubo de 5 mL contendo e PBS estéril (com nenhum Ca2 + ou Mg2 +) filtrados células da etapa 6.1. Repita até 4 mL de líquido está presente no tubo de poliestireno de 5 mL.
    Nota: PBS, DPBS ou outras soluções isotônicas em buffer podem ser utilizadas nesta fase, desde que não contenham Ca2 + ou Mg2 +
  3. Centrifugar tubos a 4 ° C e 300 x g por 5 min para a amostra homogeneizada célula de Pelotas. Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante do tubo de fundo redondo. Tome cuidado para não perturbar as células peletizadas na parte inferior do tubo. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS.

7. preparação de metilcelulose

  1. Gerar 1 x solução completa metilcelulose (tabela 1) e adicionar 2,5 mL de tubos estéreis fundo redondo 14 mL com 16G agulhas e seringas de 3 mL. Use um tubo para cada condição testada.
  2. Adicione citocinas, moléculas pequenas ou outros agentes para ser investigado para cada amostra.
    1. Para diferenciação mieloide, adicione 1% carpa soro e 0,3 mg/mL zebrafish recombinante granulócitos da colônia fator (Gcsf)34 para meio de metilcelulose. Ver Svoboda et al 37 para uma descrição completa sobre como gerar citocinas de soro e recombinação de carpa.
    2. Para diferenciação eritroide, adicione 1% carpa soro e 0,1 mg/mL zebrafish recombinante eritropoietina (Epo)38 a médio de metilcelulose.
    3. Para examinar os progenitores multilineage, adicione Epo e Gcsf.
      Cuidado: Citocinas e aditivos devem não total superior a 10% do volume total, como o meio não será suficientemente viscoso para discernir as colônias individuais.

8. adição de embriões dissociadas de metilcelulose

  1. Utilizando uma pipeta, adicione 100 μL de dissociada 10 embriões para a superfície da metilcelulose preparado com soro recombinante de citocinas e carpas. Tampa da tampa e vórtice suavemente para homogeneizar completamente a amostra. Cada tubo agora deve conter o tecido dissociado de 10 embriões.
  2. Usando 3 mL seringas e agulhas de 16G, alíquota de 1ml da amostra em separado 35 mm 2 placas de Petri. Certifique-se que a amostra é totalmente dispersos por todo o prato de Petri. Repita para cada amostra.
  3. Coloque os pratos de Petri 35mm com células em metilcelulose em uma placa de Petri de 15 cm. Para cada prato 15cm, adicione uma placa de Petri 35mm com 5 mL de água estéril para umidificar as amostras. Incube a 32 ° C e 5% de CO2 por 7-10 dias.

9. visualização de HSPC-derivado unidades formadoras (CFUs)

  1. Após 7 dias de incubação, coloca amostras em um microscópio invertido em 40-100 X para visualização e enumeração. Neste ponto, colônias individuais podem ser isoladas com uma pipeta e submetidas a análise de coloração e/ou gene.

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Representative Results

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Para avaliar os números HSPC no zebrafish embrionário, 48 embriões hpf foram digeridos, banhados em metilcelulose com fatores de crescimento hematopoiéticos-apoio exógenos e incubados durante 7 dias (Figura 1A). Após 7 dias, unidades formadora de Colônia (CFUs) foram enumerados (Figura 1B) e imagem (Figura 1C). Controlando as diferentes citocinas adicionadas, um pode controlar os tipos de colônias produzidas: Epo é necessário para a diferenciação eritroide e Gcsf é necessário para a diferenciação mieloide. Soro de carpa é análogo ao uso do soro fetal bovino em cultura de tecidos de mamíferos; é uma fonte de fatores de crescimento gerais. Na Figura 1, foram adicionados Epo, Gcsf e soro de carpa, permitindo que a enumeração de eritroide, mieloide e mistas erythromyeloid colônias. Estas colônias podem ser discernidas devido à sua forma e cor; as colônias eritroide estão apertado, pequeno, compacto e tem uma cor vermelha devido a hemoglobinization. As colônias mieloides são maiores e têm mais células motile em suas bordas, dando-lhe uma aparência de babados.

Sucesso de chapeamento de zebrafish embrionário que tratados com HSPC-apoio fatores produzirá CFUs após 7-10 dias de incubação. Importante, a quantidade de CFUs correlaciona diretamente com o número de embriões chapeado (Figura 1B). Chapeamento de 4 ou 8 embriões por mL (o que se correlaciona com começando com 10 ou 20 embriões no início do experimento) produz aproximadamente 1.200 ou 2.400 CFUs, respectivamente. Nosso protocolo sugere o uso de 10 embriões, como é difícil e demorado para contar 2.400 CFUs quando executa uma maior experiência. Devido a metodologia de digerir todo embriões, detritos diversos está presente na metilcelulose, mas facilmente podem ser discernido das colônias reais com maior ampliação sob o microscópio. Outros restos celulares também podem estar presentes, mas as única CFUs presentes será derivado HSPC devido à adição de citocinas HSPC-apoio. Se CFUs são pequenos e não é facilmente visto, as culturas podem ser incubadas a 10 dias para incentivar o aumento do crescimento. No entanto, aumento de incubação não renderá mais CFUs; se CFUs não estiverem presentes, isto indica uma perda de atividade de citocinas, sobre digestão de embriões (e subsequente destruição da HSPCs; ver suplementar Figura 1), ou impróprio chapeamento de amostras. É sempre importante executar controles adequados, sempre que esta experiência é realizada para garantir que pequenas variações na técnica não produzir falsas diferenças na enumeração HSPC. Por exemplo, se um experimento é realizado para analisar o número de HSPCs presentes em embriões de morphant, uma amostra com irmãos normais deve ser preparada ao lado. Se uma experiência é realizada para comparar o efeito de uma droga no desenvolvimento da HSPCs uma amostra com irmãos não tratadas deve ser preparada e analisada ao lado.

Figure 1
Figura 1: CFUs HSPC enumerando-derivado de 48 embriões de zebrafish hpf. (A) visão geral esquemática do chapeamento do embrião em metilcelulose com citocinas HSPC-apoio para a geração de CFUs hematopoiéticas. 48 hpf zebrafish os embriões foram dissociados e chapeados na completa metilcelulose 1% com eritropoietina (Epo), fator estimulante de colônias de granulócitos colônia (Gcsf) e soro de carpa, permitindo a diferenciação de erythromyeloid. (B) enumeração de formadoras (CFUs) de unidades de amostras chapeadas em concentrações de 4 ou 8 embriões por mL (a partir do experimento com embriões de 10 ou 20, respectivamente). Enumeração foi feita em 100 X em um microscópio invertido. As barras indicam números médios de CFUs, e barras de erro indicam o desvio padrão. (C) morfologia de colônia representativa do chapeamento do embrião em metilcelulose. Morfologia da colônia indica os tipos de células que compõem a colônia; imagens são representativa eritroide e colônias mieloides. CFUs fotografados em 400 X. Barras de escala = 50 μm.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementar Figura 1: digestão de embriões com protease de dissociação. (A) imagens de 10 embriões antes da digestão (deixou; não digerida), após a digestão adequada (média; digerido) e depois da digestão excesso (bem; mais digerido). (B) Zoomed em imagens (7,3 X) de tubos digeridos digeridos e acabou no (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O modelo de sistema de zebrafish tornou-se um modelo eficiente, eficaz e barato para o estudo de hematopoiese vertebrado primitivo e definitivo. Geração de ensaios que são rápidos, baratos e apresentar algumas dificuldades técnicas pode ser utilizada para teste de pequenas moléculas, analisando os embriões mutantes e elucidação moleculares vias importantes para a biologia HSPC. Em vitro chapeamento de HSPCs de zebrafish adulto é um método eficaz para estudar mutagênese e citocinas hematopoiéticos defeitos. Este protocolo baseia-se nesses estudos, mas utiliza o zebrafish embrionário. Aplicando estes ensaios de zebrafish embrionário permite a coleta de dados mais rápida, o uso do espaço físico menos, o uso de drogas menos (para telas de drogas) e permite testes superexpressão de mRNA e/ou nocaute Morpholinos (MO) de percursos genéticos específicos. Importante, também permite o estudo dos estágios da hematopoiese que só ocorrem durante o desenvolvimento precoce de vertebrados.

Devido à flexibilidade do presente ensaio, isso pode ser facilmente modificado para atender a muitas necessidades diversas. Uma modificação do presente protocolo é a modulação do sincronismo do desenvolvimento; modificando a idade dos embriões utilizados permite a quantificação da geração HSPC ao longo do tempo. Isso também pode permitir que o estudo de subconjuntos distintos de HSPCs como erythromyeloid progenitores6, que surgem antes 36 hpf, contra bona fide linfócitos3,4,5,8, que surgem Depois disso. Ninguém ainda foi capaz de isolar e identificar subconjuntos HSPC zebrafish mais restritos no desenvolvimento do embrião, mas estes ensaios permitem que estas experiências. É essencial que ao alterar os estádios de desenvolvimento dos animais, a quantidade de células adicionado na metilcelulose também é otimizada; muito poucos animais renderá sem colónias, enquanto também muitos irão criar um prato incontável de colônias HSPC. Adição de diferentes citocinas é outra modificação que pode ser adaptada a experiências específicas. Adicionar o Epo permitirá a quantificação das colônias eritroide, enquanto Gcsf permitirá a enumeração das colônias mieloides. Adicionar ambos dessas citocinas permitirá geração de linhagem multi CFU. Importante, estes ensaios licença de teste de citocinas putativos e seus efeitos em HSPC proliferação e diferenciação. Estes ensaios também podem ser modificados para executar o teste de drogas em larga escala; embriões podem ser expostos a diferentes concentrações de compostos em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento para ver se os produtos químicos têm um efeito positivo ou negativo sobre a produção de sangue. Uma forma final que estas experiências podem ser modificadas é que os embriões podem ser injetados na fase de uma célula com mRNA específico ou MOs, que serão overexpress ou genes específicos "knockdown", respectivamente. Depois de desenvolver por 24-48 h, estes embriões podem ser submetidos a esses ensaios para determinar se o ganho ou perda-de-função de genes específicos desempenham um papel essencial na formação HSPC, proliferação e diferenciação. Também é importante notar que, utilizar diferentes cepas transgênicas de zebrafish ajudarão na velocidade e facilidade de recolha e interpretação dos dados. Por exemplo, se um está interessado em desenvolvimento eritroide, é fácil de realizar esses experimentos em gata1: DsRed embriões,40, que tem o promotor eritroide específicos transgénico Gata1 transcrição do fator de condução DsRed fluorescência. Desta forma, ao analisar as colónias eritroide, microscopia de fluorescência pode ser utilizada. Da mesma forma, estes estudos podem ser executados em animais com múltiplos transgenes presente para procurar várias linhagens de células de uma só vez. Esta técnica seria útil para identificar multilineage HSPCs; Embora eritroide e colônias mieloides são facilmente distinguíveis pela morfologia, é difícil identificar colônias que contêm bipotential progenitores sem Visualizar a presença de múltiplos expressão do transgene linhagem específica na mesma colônia .

Embora estes ensaios têm muitos benefícios, é essencial para configurar os controles adequados, sempre que estas experiências são realizadas; pequenas variações na técnica poderiam alterar os resultados e interpretações dos resultados. Por exemplo, é possível obter diferentes números de HSPCs quando você executar os experimentos em dias diferentes, se sua técnica não for precisa; para lidar com esta possibilidade, deve-se incluir sempre um controle apropriado. Se uma experiência é realizada para testar o efeito de um MO em desenvolvimento e, em seguida, controlar os embriões (ou uninjected ou injetado com um controle MO) que são da mesma embreagem também deve ser processada juntamente com a amostra experimental. Se o experimento foi concebido para testar o efeito de uma droga em particular, em seguida, amostras não tratadas devem ser incluídas como um controle. Finalmente, se testando os efeitos de uma citocina específica em desenvolvimento, então animais de embreagem mesmo devem também ser processados e analisados ao mesmo tempo sem ter o cytokine adicionado à cultura.

Enquanto este ensaio em vitro é simples de executar e os resultados são fáceis de interpretar, alguns potenciais problemas podem surgir durante o procedimento. Se não há colônias são vistas após 7 dias em cultura, há várias questões que possam ter ocorrido. Primeiro, verifique se que as citocinas são puro e em concentrações adequadas; dependendo de como as citocinas foram produzidas pode ser necessário alterar as concentrações e otimizar sua atividade. Outra questão que surge comumente over está digerindo os embriões, que destrói os HSPCs; Cuide-se para a etapa de digestão e alterar o sincronismo se não colônias são vistas repetidamente. Finalmente, a mistura de metilcelulose e adição de soro de carpa pode ser o problema, então certifique-se de que todos os ingredientes foram adicionados e misturados corretamente. Além de questões técnicas, é importante perceber que colônias podem precisar mais de desenvolver em determinadas circunstâncias; muitas vezes pequenas colônias são muito mais visíveis após um adicional de 3 dias em cultura. Não é recomendado passar por 10 dias, como a metilcelulose começa a secar logo em seguida. Outro problema comum é que, às vezes, colônias tendem a recolher-se em torno das bordas dos pratos Petri 35mm; as placas de digitalização cuidadosamente, especialmente em torno das bordas, é essencial. Além disso, é importante lembrar que estas colônias desenvolvem-se em um material espesso e viscoso; Quando o foco do microscópio, ajustar o foco para cima e para baixo observar ligeiramente diferentes aviões-as colônias não estarei mais sentado no fundo dos pratos plásticos.

Estes ensaios em vitro tem muitas vantagens, mas eles também têm algumas limitações. O maior problema é que estes ensaios não podem provar definitivamente que um progenitor é um HSC-que só pode ser provado por reconstituição a longo prazo dos animais irradiados. Além disso, nem todas as citocinas foram definidas e investigadas no zebrafish ainda, que limita os tipos de HSPCs que podem ser investigados. Por exemplo, nenhum citocinas linfoide-apoio zebrafish foram identificadas ainda, impedindo a produção de B e células T nestes ensaios. Além disso, não está claro quando cultivo multipotentes HSPCs se a adição de determinados tipos (ou quantidades) de citocinas específicas pode distorcer a diferenciação por certos caminhos hematopoiéticas. Outra ressalva potencial é que este ensaio não pode efetivamente discernir se HSPCs estão presentes em uma amostra, mas por alguma razão são incapazes de diferenciar (ou caso contrário, não são viáveis). Tal como acontece com a maioria dos ensaios em vitro , mais devem sempre ser realizados experimentos para validar os resultados. Exceto por estes problemas, muita informação pode ser inferida a partir destes ensaios clonais.

Estes ensaios são significativos, porque eles permitem a rápida e eficiente de rastreio de defeitos hematopoiéticos. Pesquisadores podem derrubar com MOs certas vias genéticas e placa digerido animais para ver se o gene desempenha um papel na hematopoiese. Além disso, peixes mutantes (anteriormente gerado ou recém gerado em telas de mutagênese) podem ser avaliadas rapidamente e facilmente. Estes ensaios permitem também droga eficiente ensaios de rastreio em organismos vivos, todo para identificar a modulação da biologia HSPC enquanto também ser capaz de observar se as drogas têm um efeito negativo no desenvolvimento ou sobrevivência. Estes ensaios também permitem que a quantificação de HSPCs no zebrafish em desenvolvimento em momentos diferentes. Enquanto vários estudos têm tentado dosar números HSC em adultos7,,27,30,41 e embrionárias zebrafish3,4,42, 43, nenhum estudo tem quantificados as diferentes quantidades de HSPCs linhagem restrita no zebrafish. Além disso, estes ensaios podem ser utilizados para examinar e modulam moleculares vias importantes na formação de células de sangue e diferenciação, um processo que permanece enigmático.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Financiamento foi fornecido pela National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 para D.L.S.), o programa de Universidade de estado de Califórnia para Educação & pesquisa em biotecnologia (CSUPERB: controle Molecular do nicho Hematopoietic vertebrados para D.L.S.) e da Secretaria de pós-graduação na Universidade do estado da Califórnia Chico (a A.C.B).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)
Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Desenvolvimento de um ensaio <em>In Vitro</em> para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra
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Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).More

Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).

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