Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/56837
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama
* These authors contributed equally

Summary

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

Abstract

標本は、さまざまな生物学的研究で使用できる植物材料の非常に貴重な源です。標本の使用はサンプル保存品質、劣化 DNA、珍しい標本の破壊的なサンプリングを含む課題の番号に関連付けられます。効果的に大規模なプロジェクトの標本材料を使用、するために DNA の分離およびライブラリの準備の信頼性と拡張性の高い方法が必要です。本稿は、DNA 分離、高速ライブラリ構築に標本から個々 のサンプルの変更を必要としない堅牢で、始めから終わりまでプロトコルを示します。このプロトコルは、組織研削、ライブラリ サイズ選択を変更して低収量ライブラリのオプション reamplification ステップを導入することを最適化することにより従来の低品質の乾燥植物素材とを利用に合わせて調整します。低収量 DNA ライブラリの reamplification は、かけがえのない、潜在的に貴重な標本、追加破壊サンプリングし、共通認識できるシーケンス バイアスを導入することがなく、必要性を否定することから派生したサンプルを救うことができます。系統のアプリケーション。プロトコル数百草種でテストされていますが確認後他の植物の系統での使用に適応します。このプロトコルは、フラグメントは目的のサイズの範囲では存在しない、非常に低下した DNA ときれいな DNA 分離を抑制する二次代謝産物いくつかの植物材料の存在によって制限することができます。全体的に、このプロトコルは DNA の隔離と最小限の変更でアクティブなハンズオン タイムの 8 時間だけで 13 h 未満の 24 サンプル調製されたライブラリでは、高速かつ包括的な方法を紹介します。

Introduction

標本コレクションは、種と系統1,2,3, 集団遺伝学4,5, 保全を含む研究のためのゲノムの多様性の両方の可能性がある貴重な情報源生物学6、外来種生物学7、および形質進化8。種、人口、地理的な場所、タイム ポイントの豊かな多様性を取得する機能は、標本は、「宝箱」9を強調表示します。歴史的に、標本由来 DNA の劣化した自然が多い領域の葉緑体ゲノムや、リボソームの内部転写スペーサー (ITS) などの高いコピー内で見つかったマーカーのみを使用する研究者を追いやって、PCR ベースのプロジェクトを妨げています。RNA。標本と DNA の品質によって異なります広く保全9,10二本鎖切断と損傷の最も一般的な形であること、作成の乾燥工程で使用される熱から断片化の手法、いわゆる 90 %dna ロックアップ PCR ベースの研究11を妨害しています。断片化、別標本のゲノムの第 2 最も一般的な問題は汚染、生菌13から派生する菌類コレクション後、標本12にもマウントする前に死後を取得したようにこの問題は、右真菌データベース (下記参照) を与えられた解決の bioinformatically をすることができます。11押し葉標本の低い (〜 0.03%) と推定されている、3 番目、およびより少なく共通の問題はシトシン脱アミノ化 (C/G→T/A)14日シーケンス変更です。短いリードとシーケンス深さ12,15、低品質の多数の標本から遺伝子レベルのデータ集録が可能高スループット シーケンス (HTS) の出現により、断片化の問題を克服できます。DNA と時々 全ゲノム シーケンス15を許可します。

標本サンプルはより頻繁に使用されるなる、系統のプロジェクト16の大きなコンポーネントです。標本を用いた高温超伝導体の現在の課題が個々 のための方法を最適化することがなく、タイムリーに多くの種から十分な二本鎖 DNA、シーケンス プロトコルは、必要な前提条件を一貫して取得します。標本。本稿では、既存の手段を活用して、高速かつ複製可能な結果を可能にするそれらを変更に DNA の抽出と標本のライブラリの準備のためのプロトコルが示されています。この方法は 13 h、8 h のハンズオン タイム、または 16 h、9 h、ハンズオン時間、オプション reamplification ステップが必要な場合 24 サンプルのライブラリに試験片から処理が完了すること。多くのサンプルの同時処理は、制限要因は遠心力と技術的なスキルが達成可能で。プロトコルは DNA をせん断してだけ典型的な実験装置 (たち、遠心とマグネット スタンド) ネブライザー、超音波発生装置などの特殊な機器ではなくを必要とする設計されています。

DNA の品質、フラグメント サイズと数量は、高スループット シーケンス実験の標本の使用のための要因を制限しています。標本の DNA を分離し、高スループット シーケンス ライブラリを作成する他の方法は 10 として少し使用の有用性を実証している DNA16; ngただし実験的 PCR の最適な数を決定する必要なライブラリの準備のために必要なサイクルです。これは、いくつか標本が単一のライブラリの準備のため十分な DNA のみを生成するよう実行可能なダブルの非常に小さな金額を扱う鎖 DNA (dsDNA)、非現実的ななります。ライブラリの最適化の手順で DNA は失われませんので、ここで紹介した方法は単一サンプルの質に関係なくサイクル数を使用します。代わりに、ライブラリは、シーケンスに必要な最低限の量を満たしていない場合に、reamplification ステップが呼び出されます。多くの植物標本サンプルはまれであり、多くの場合有害なサンプリングを正当化するが難しく少し材料を所有しています。これを対抗するため提案するプロトコルにより、dsDNA 入力サイズを 1.25 未満 ng のライブラリの準備プロセス、高スループット シーケンスと供試体の破壊のサンプリングのための必要性を最小限に抑えるのための実行可能なサンプルの範囲を拡大します。

次のプロトコルを草用に最適化されており、我々 はプロトコルことができます他の多くの植物のグループに適用されることを期待するものの、標本サンプルから別の種の何百ものテストします。低品質または珍しい標本を保存するために使用できる省略可能な回復手順が含まれています。テスト 200 以上の標本を基に、このプロトコルは、最小限の破壊的なサンプリングによって珍しい標本の保存を可能にする低組織入力と品質、標本で動作します。ここでこのプロトコルがゲノミクス ベース プロジェクトのシーケンスことができます高品質ライブラリを提供できることを示す.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 開始前に

  1. 新鮮なセチル トリメチル アンモニウム臭化 (CTAB) バッファー17 CTAB、ポリビニルピロリドン (PVP)、40 100.0 mL 1 M トリス pH 8.0、0.5 M エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0、280.0 mL 40 mL 5 の 10 g の 20 グラムを追加することにより作る M NaCl および 400.0 mL の試薬水一緒に、水 1 L 試薬グレードを使用する合計ボリュームをもたらす。8.0 pH を調整します。
    注: 追加試薬は、各分類群の二次化合物によって CTAB を追加することができます。アレンらを参照してください。18添加試薬の徹底的なリストのため。
  2. Β-メルカプトエタノール CTAB バッファーの 5 mL あたりの 10 μ L を追加します。
    注: この 50 mL のバッチの準備ができ、3-4 週間常温保存します。
    1. 65 ° C の水浴 CTAB 溶液を加熱します。
  3. モルタルと少なくとも 20 分ミクロネジア-20 ° C を寒さ。
  4. 2 n 2 mL チューブ × 4 セットのラベル (n = サンプル数)。氷の上のラベル付きのチューブの 1 セットを置きます。
  5. イソプロパノールまたは-20 ° C のフリーザーで氷の上を冷やします。
  6. 室温 (30 分以上) に釣り合うようにし、冷蔵庫から固相リバーシブル固定 (スプリング) ビーズ (材料の表を参照) を削除します。
  7. 80% エタノールを準備します。
  8. 標本抽出のためを選択し、〜 1 cm2、または 10 mg、標本、できれば葉材料ごとの組織を取得します。

2. DNA の抽出

  1. Prechilled モルタルと乳棒を使用して事前選択された標本組織の ~ 1 cm2を挽きます。液体窒素と 30-50 mg の殺菌砂を追加します。組織に微粉末になるまで挽きます。
    注: 10 mg またはより多くの組織が望ましいですが、以下はまた、いくつかのケースできました。一度液体窒素が蒸発すると、組織は完全に地面まで必要に応じてさらに追加します。細胞や組織を破壊する別の一般的な方法は、ビーズのビーターの使用です。しかし、これらの実験で使用される標本のためによく動作しないこのメソッドが見つかりました。
  2. (管の容積の半分以上を追加) 2 つの 2 mL チューブに冷凍粉を転送します。各管に温かい CTAB 溶液の 600 μ L を追加し、徹底的に反転してボルテックス チューブをミックスします。
    注: 標本資料の質と量が低いため多くの場合、高い利回りを得ることができます 2 つの繰り返しの DNA の隔離を行います。
  3. 1-1.5 h、ボルテックス 15 分毎の 65 ° C の水浴中サンプルをインキュベートします。
  4. 10,000 x g で 5 分間遠心分離機サンプルは、上澄みをラベル付きチューブ (〜 500 μ L) の新鮮なセットに転送します。非塩素処理の標準的なプロシージャを使用してペレットを破棄します。
  5. 各管に RNase A (10 mg/mL) の 4 μ L を加え、反転やピペッティングで混ぜます。37 ° c 15 分間熱ブロックまたは水浴でサンプルをインキュベートします。
  6. チューブが部屋の温度に達したら 25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール混合物の等しいボリューム (〜 500 μ L) を追加します。反転および/または上下にピペッティングして徹底的にミックスします。ラベルの付いたチューブ (~ 400 μ L) の新鮮なセットを水層 (上層) 12,000 x g で 15 分間転送でチューブを遠心分離機します。塩素系廃棄物コンテナーに有機層を破棄します。
    注: ステップ 2.6 は大量の二次化合物が想定される場合に植物素材を繰り返されることがあります。
  7. 24:1 クロロホルム: イソアミル アルコール混合物の等しいボリューム (~ 400 μ L) を追加します。反転および/または上下にピペッティングして徹底的にミックスします。Prechilled のラベルが付いたチューブ (~ 300 μ L) の新鮮なセットを水層 (上層) 12,000 x g で 15 分間転送でチューブを遠心分離機します。塩素系廃棄物コンテナーに有機層を破棄します。
  8. 各チューブに prechilled イソプロパノールと 2.5 M ナトリウムのアセテートの 12 μ L の等しいボリューム (~ 300 μ L) を追加します。30-60 分のための-20 ° C でサンプルをインキュベートします。
    注: インキュベーション時間は (一晩インキュベート) まで延長することができますが、長いサンプルをインキュベート DNA の品質が低下します。
  9. 冷凍庫、遠心 12,000 x g で 15 分間でチューブを削除し、ペレットを乱すことがなくそっと上澄みを廃棄からサンプルを取る。新鮮な 70% エタノール (約 300-500 μ L) 懸濁液によって餌を洗浄します。各 2 倍のサンプルでは、エタノールを伴う 1 つに 2 つの個々 のペレットを統合します。
    注: サンプルは最初にエタノールを使用 1 つの管に連結する必要があり、進みます。エタノールで各サンプルを個別に洗浄する必要はありません。
  10. 12,000 x g で 10 分間削除でチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなくそっと上澄みを廃棄します。空気は乾燥ペレットです。
    注: サンプルは高速乾燥熱ブロックを使用してを乾燥することができます (65 ° C を超えないように)。サンプルは過剰に乾燥しないことを確認してください、これは DNA の最終的な収量を減らすことができます。
  11. 1 x テの 50 μ L の DNA の分離を中断します。長期保存-20 ° C のフリーザーまたは次の週に使用するための 4 ° C で保存します。

3. 品質管理 (QC)

  1. 品質チェックのための agarose のゲルを実行します。
    1. ナトリウム塩、試薬グレードの水を使用して 5 L をもたらす総 54 g のトリス基地、27.5 g ホウ酸 3.75 g EDTA を追加して 1 × トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE) バッファーを準備します。
    2. 1 の 100 mL に 1 g アガロースを追加して 1% の agarose のゲルの準備 x TBE。Agarose が表示されないまで、ソリューションを電子レンジします。追加 0.01% 核酸ゲル染色 (材料の表を参照してください)。それは触ると暖かくなるまでフラスコを冷ます。攪拌でよく混ぜます。ゲル トレイのアガロースを注ぎ、それが固まるまでに座らせてください。
    3. 3 μ L のサンプル、試薬グレード水 2 μ L とローディングの染料 × 6 の 1 μ L を混ぜます。順序を注意してゲルのマトリックスのサンプルをロードします。
    4. 適正露出とフォーカス紫外線の下でゲル 60-70 V. イメージで 60-70 分のサンプルを実行します。
      注: クリア高分子量バンドの存在は高品質 DNA の塗抹標本は通常 DNA 分解を示します。ほとんど標本の品質が低下します。
  2. DsDNA 定量化分析を実行 (材料の表を参照) ダブルの量を決定する DNA を座礁します。
    1. 2 μ L のサンプルを使用して、分析のため。
      注: 彼らは最小量にする傾向があるので希釈は標本材料の定量分析のため必要ありません。成功したライブラリは、このステップからわずか 1.26 ng 合計 dsDNA から作られています。

4. DNA せん断

注: これは商業二本鎖 fragmentase の最適化バージョン プロトコル (材料の表を参照してください)。

  1. 3 ボルテックス後氷の上場所 dsDNA 断片化酵素 s。
  2. 0.2 mL の滅菌ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブでは、ミックス 1-16 μ L は、断片化反応バッファーを伴う 2 μ L で DNA を隔離しました。ヌクレアーゼ フリー水を加えることによって 18 μ L に総量をもたらします。DsDNA 断片化酵素の渦 3 の混合物 2 μ l 添加 s。
    注: 必要な DNA の量は DNA 濃度 (管内 200 ng の目的) によって異なります。
  3. 8.5 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。チューブに 0.5 M の EDTA の 5 μ L を追加します。
    注: この手順は、潜伏期間は上の反応を終了し、過剰剪断からの DNA のサンプルを防ぐためできるだけ早く実行する必要があります。

5. ビーズのクリーンアップ

  1. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。
  2. ヌクレアーゼ フリー水の 25 μ L を追加することによって 50 μ L にせん断の DNA 量をもたらします。上下にピペッティングして徹底的にせん断の DNA とミックスの 50 μ L に室温 SPRI ビーズ (90% ボリューム) の 45 μ L を追加します。
    注: 合計サンプル ボリュームの 90% でビーズを追加頻繁に以下 200 塩基対の DNA 断片の最小を削除する実行されます。
  3. サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、慎重に 5 分間座らせてみましょうを削除し、上清を捨てます。
    注: 目的の DNA ターゲットを含んでいるので、ビーズを邪魔しないように注意。
  4. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s とし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。空気は、そのふたを開くとマグネット スタンドにチューブがあるとき 5 分ビーズを乾燥させます。
    注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
  5. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 55 μ L にビーズから DNA を溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
  6. 上澄みの 52 μ L をやってのけます。回復とライブラリの準備に入る最初の濃度をチェックするサンプルの DNA 定量分析を実行します。
    注: ライブラリは 1.25 未満と推定される合計 dsDNA で作られている ng、しかし各場合 reamplification が必要でした。

6. ライブラリの準備

注: これは市販ライブラリ キットの修正バージョン (材料表プロトコルを参照してください)。

  1. 最後の準備
    1. エンドヌクレアーゼと尾行酵素、リン酸 3 μ L と 7 μ L 反応バッファーを洗浄、せん断された DNA の 50 μ L に付属の追加します。上下にピペッティングして徹底的にミックスします。スピン泡を削除するチューブ。
      注: 合計量は 60 μ L をする必要があります。
    2. 次のプログラムでたちにサンプルを配置: 20 ° C、65 ° C で 30 分で 30 分、4 ° C で押し
      注: 加熱蓋は 75 ° C に設定されました。
  2. アダプター結紮
    1. アダプターを 25-50 倍希釈 (作業アダプター濃度 0.6 – 0.3 μ M)。チューブに結紮術マスター ミックスの 30 μ L、結紮エンハンサーの 1 μ L と 2.5 μ L 高スループット短い読み込みシーケンスのためのアダプターを追加します。
      注: 合計ボリュームは、93.5 μ L をする必要があります。
    2. 上下にピペッティングして徹底的にミックスします。スピン泡を削除するチューブ。20 ° C 15 分でチューブを孵化させなさい。
    3. ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) と DNA グリコシラーゼ リアーゼ エンドヌクレアーゼ VIII の商業の混合物の 3 μ L を追加 (材料の表を参照してください)、チューブに。確実に 96.5 総量 μ。 徹底的に混ぜると、たちを使用して 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。
      メモ: 蓋は ≥47 ° C に設定する必要があります。商業プロトコルの元のバージョンはアダプター結紮手順の最後のステップとしてビーズ クリーンアップ続いて後のサイズ選択。高い利回りを実現するには、このプロトコルはこれらの手順の順序を切り替えます、最後のステップとしてサイズの選択を実装します。
  3. 酵素と小さな断片を削除するクリーンアップ
    1. ボルテックスによって磁気ビーズを均質化します。
    2. SPRI 磁性ビーズ (80% 容積) の 78 μ L を加え、ピペッティングを上下で徹底的に混ぜます。
      注: 合計サンプル ボリュームの 80% でビーズを追加 250 塩基未満が多い小さい DNA のフラグメントを削除する実行されます。小さな DNA 断片のより厳格な除去は、(i) 余剰アダプターを削除し、(ii) 次の手順でより大きな断片の増幅を強調することです。
    3. サンプル間インキュベート 5 分入れて 5 分磁性体板上にチューブは慎重を削除し、目的のサイズの範囲外の DNA が含まれている上澄みを廃棄しましょう。
      注: 目的の DNA ターゲットが含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。
    4. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s とし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。磁気スタンド オープンふた付けのチューブは、空気乾燥 5 分のビーズです。
      注: は、ビーズを乾燥させる上避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
    5. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 17 μ L を追加することによってビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    6. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
    7. 上澄みの 15 μ L をやってのけます。
  4. PCR の拡大
    1. 洗浄アダプター結紮 DNA の 15 μ L に忠実度の高い PCR マスター ミックスの 25 μ L、高スループット短いリード シーケンス ライブラリ準備 5' プライマーの 5 μ L、5 μ L、高スループット短い読み込みシーケンス ライブラリ準備 3' プライマーを追加します。
      メモ: 容量 50 μ L をする必要があります。
    2. ボルテックスでよく混ぜます。表 1にある設定を使用してたちにサンプルを配置: たちの増幅の設定。
      注: サイクル数が多い低入力 DNA 量のため必要です。
サイクルのステップ Temp。 時間 サイクル
初期変性 98 ° C 30 s 1
変性 98 ° C 10 s 12
焼鈍/拡張機能 65 ° C 75 s 12
最終的な拡張 65 ° C 5 分 1
ホールド 4 ° C

表 1: PCR プロトコル変性、アニーリング、および拡張の時間そして温度。温度と時間は、このプロトコルで試薬を最適化しました。場合は試薬を変更すると、温度、時間もう一度最適化する必要があります。

  1. 必要なライブラリのサイズのサイズの選択
    注: このビーズ ステップ対象範囲の上下両方のフラグメントが削除されます。
    1. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。
    2. 室温磁気ビーズを 25 μ l 添加 (50% 容積) と上下にピペッティングして徹底的にミックスします。サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、慎重に 5 分間座らせてみましょう削除し、上清をラベル付きチューブの新しいセットに転送します。
      注: このボリュームは必要なライブラリのサイズに基づいて調整することができます。上清には、希望するサイズの DNA のフラグメントが含まれています。最初のビーズ インキュベーションでビーズ バインド ライブラリ フラグメントが大きい。これらは 400-600 塩基対の範囲のそれらに集中する削除されます。上清より小さいフラグメントが含まれています。
    3. 上下にピペッティングして徹底的に上清とミックスに室温 SPRI ビーズ 6 μ L を追加します。サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、5 分間座らせてみましょう。
      注: このボリュームは 6.5.2 の手順に従って必要なライブラリのサイズに基づいて調整することができます。
    4. 慎重に削除し、上澄みを廃棄します。
      注: 目的の DNA が含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。2 番目のビード インキュベーション フラグメントの最大の DNA の初期の除去後に残った断片にビーズをバインドしています。この一連のフラグメントは通常目的のサイズの範囲内です。
    5. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s、慎重を削除し、上清を捨てます。手順を繰り返します。磁気スタンド オープンふた付けのチューブは、空気乾燥 5 分のビーズです。
      注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
    6. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 33 μ L にビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    7. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。ストレージ (材料表参照) 2 mL チューブに上清および転送の 30 μ L をやってのけます。
      注: ライブラリは、長期保存のための-20 ° C で保存できます。
  2. 品質コントロール
    1. DNA ライブラリの品質管理テストを実行します。3.1 と 3.2 の手順を参照してください。
      注: DNA ライブラリの 96 V ~ 45 分のためのゲルを実行します。
  3. Reamplification ライブラリ: ライブラリの量が十分ではない場合は省略可能。
    注: サンプル ライブラリ濃度 10 以下 nM は、次の手順を使用して reamplified することができます。低濃度ライブラリの reamplification は、シーケンス処理のため実行可能な結果を実現できますが、reamplification 収集示唆 (表 3) は、特定のメトリックのごくわずかであるにもかかわらず、基本組成多様性のささやかなシフトを引き起こす可能性があります。.
    1. 10 倍 0.1 x TE を使用して普遍的な reamplification プライマーを薄くしなさい。
    2. 低濃度ライブラリの 15 μ L に忠実度の高い PCR マスター ミックスの 25 μ L、プライマー希釈ユニバーサル reamplification 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) の 5 μ L、希薄化後の普遍的な reamplification プライマー 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) の 5 μ L を追加します。メモ: 容量 50 μ L でする必要があります。
    3. ボルテックスでよく混ぜます。表 1にある設定を使用してたちにサンプルを配置: たちの増幅の設定
      注: 多くのサイクル数は入力 DNA の量が少ないため必要です。
    4. ビーズのクリーンアップ
    5. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。室温 SPRI ビーズ (90% ボリューム) の 45 μ L を追加し、上下にピペッティングして徹底的に混ぜます。
    6. 5 分間磁気プレートにチューブを入れて 5 分間インキュベート サンプルを聞かせてください。
    7. 慎重に削除、不要な DNA を含む上清を捨てます。
      注: 目的の DNA ターゲットが含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。
    8. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s、慎重に削除し、上清を捨てます。この手順をもう一度繰り返します。
    9. 空気は、そのふたを開くとマグネット スタンドにチューブがあるとき 5 分ビーズを乾燥させます。
      注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA ターゲットの低い回復につながります。
    10. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 33 μ L にビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    11. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
    12. 上澄みの 30 μ L をやってのけます。ライブラリは、長期保存のための-20 ° C で保存できます。
  4. 品質コントロール
    1. DNA ライブラリの品質管理テストを実行します。3.1 と 3.2 の手順を参照してください。DNA ライブラリー 96 V ~ 45 分のためのゲルを実行します。
      注: 場合はゲルの二重バンドを見ると、これはおそらく reamplification ステップからプライマー枯渇の結果。バンドは、6.9 の繰り返しが表 1に描かれている PCR プログラムで 1 つだけのサイクルを使用して削除できます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA の隔離および最終的なライブラリ収量
本研究では 1920 年からの最も古いと 2012 年 (表 2) から最年少 50 の異なるサンプルを使用して標本の DNA の分離および高品質シーケンス ライブラリの回復用のプロトコルの有効性を示した.各サンプルは、葉の組織の約 10 mg は DNA の隔離に使われました。場合は、環境に優しい葉組織が支持され、明らかなカビ汚染と組織が選択されていません。成功の分離は、収量が低くなるはずに黄色や茶色のティッシュを使用して行うことが。合計二重らせん DNA (dsDNA) 3.56 から最初の分離から 2,610 に ng ng。予想通り、標本から得られた DNA は著しく低い (図 1 a図 1カスタマーインフォメーション センターの障害)。酵素せん断 (1.26-464 ng) の分離の部分が使用されました。標本の DNA は、すでに保全プロセスを介して剪断、全体的なライブラリ生産収率改善追加せん断プロトコルの最適化が必要です。DsDNA が剪断後の総回復 〜 < 1% から 51% 以上 1.25 未満の結果入力の dsDNA のライブラリの準備および 328 の最大のための DNA の開始の ng ng。いくつかのサンプルの DNA の極端な損失は、酵素剪断 (図 1 a図 1 の補足) 前に DNA の多くの既に小さな断片のサイズに帰することができます。せん断の DNA 上の 90% のボリューム ビーズ クリーンアップの使用より大きくより望ましいフラグメント サイズを豊かにする DNA の小さいフラグメント意図的削除。これらの小さな断片として 100 塩基対のマーク (図 1 a) で強烈な信号によって示される TK463、TK657、および TK694、サンプルで見た特に。

ライブラリの投稿サイズ選択の合計数量は 1.425 からであった 942.5 に ng ng (補足の表 1、表 2)。初期の抽出およびライブラリの準備したサンプルの 23、ライブラリの十分な量を得られない (< 10 nM;補足の表 1、表 2) ので、これらのサンプルは、プロトコルの reamplification と回復の手順にさらされた 14-680 x の結果合計ライブラリ (補足の表 1、表 2) で増加します。最終的なライブラリは、350 と 500 の塩基対 (図 1 b、カスタマーインフォメーション センターの障害図 2) の間にバンドになりました。時、予想されるライブラリのサイズよりも大きい 2 番目のバンドが見られた (図 1 b、カスタマーインフォメーション センターの障害図 2)。これは、発生 reamplification PCR 利用可能なプライマーを排出し、始めた非相同 DNA 断片のライブラリ アダプターをアニールします。これは分子が終了 (アダプター) が熱処理正しく DNA 挿入はしませんでしたを作成します。この「バブル」分子ゲルのマトリックスをもっとゆっくり移動するそれとして登場、ゲルのより大きいです。既に reamplified のライブラリから別の reamplification 反応を準備し、単一サイクルの実行によりこれらの焼鈍のエラーを修正しました。この 1 つのサイクルは、適切な熱処理や増幅、2 番目のバンド (補足図 3) を削除のプライマーを提供しました。

ライブラリの reamplification 容易に少なくとも 10 の最後のライブラリ濃度 nM。これらの濃度はモル濃度とプールで平等な表現、等しくないサンプルの質が生じているとの問題を否定する支援とシーケンシング ライブラリ収量を等しくなるように希釈するライブラリを許可します。プロジェクトの目標が葉緑体ゲノムの場合、シーケンス、シーケンスの合計額は、異なる系統と異なりますが必要なし、組織が異なる葉緑体 DNA19から発信された読み取りの合計の割合。通常、葉緑体ゲノムの投影範囲 x 50-100 は、アセンブリのための十分な種とシーケンスの結果に応じてできるだけ多く 70 個人を含めるシーケンスの実行をプールできます。

汚染、バイアスおよび Reamplification によって引き起こされる変化のためのテスト
HTS シーケンスの注目は、広範な PCR 増幅20を介してライブラリにバイアスの紹介です。Reamplification の効果をテストして標本材料の潜在的なバイアス系統共通のアプリケーションを識別するには、同じ希釈ライブラリ 1:5 と reamplified (指定された TK686-R) 正常にシーケンスされたライブラリ (TK686) を比較しました。両方の TK686 と TK686-R はイリノイ大学のロイ ・ J カーバー バイオ テクノロジー センターで、ミシガン州立大学研究技術支援施設、イルミナ HiSeq4000 でそれぞれシーケンス処理された、(を参照してください読み取りペア終了 150 塩基対を使用して表 3シーケンス詳細については)。Raw 読み取りは、NCBI SRA (SRP128083) に寄託されています。Trimmomatic v.0.3621 NEB アダプター シーケンス、スライディング ウィンドウ、10 塩基対の 20 の平均 phred スコア フィルタ リングの品質を使用してアダプター トリミングを含むを使用してきれいになった読み取りと最低 40 塩基対のサイズ。汚染が、JGI MycoCosm 真菌ゲノム データベース22 (312 の核ゲノムとミトコンドリアゲノム 79) の一部に対する読み取りをマッピングすることにより推定された真菌汚染標本に関する主な問題の 1 つとして、bowtie2 v を使用.2.2.923 「非常に敏感なローカル」パラメーター セットを使用します。TK686 および TK686-R ライブラリは核のカビ汚染の区別された (9.24% と 9.68% それぞれ) とミトコンドリアのカビ汚染 (0.94%、0.8%)(表 3)。これはほんの一例ですは標本サンプルのカビ汚染は無視できないと標本派生シーケンス データを使用する前に削除する必要があることをお勧め。データベースと識別し、真菌汚染を削除に使用するコマンドは、M. R. マッケイン GitHub のレポジトリ標本ゲノミクス24で見つけることが。

葉緑体ゲノムの系統樹解析で用いられる、標本がソース材料12としてますます使用されます。葉緑体ゲノムのアセンブリの reamplification の再現性をテストするために TK686 と TK686-R の葉緑体ゲノムは、イネ目に設定ボウタイ インデックスが既定の設定で高速プ v.1.2.525を使用組み立てられました。における葉緑体ゲノム TK686-R が得られたが、TK686 葉緑体ゲノムの低い読み取り深度による 7 コンティグに組み立てられました。手動で次のマッケインらTK686 コンティグを組み立てた完全に組み立てられた葉緑体ゲノムは、GUI ベースのアライメント ソフトウェアで互いに整列した26 (材料の表を参照) とアセンブリの間の変化を評価しました。12 SNPs と 1 つの塩基の合計が TK686 の葉緑体アセンブリと TK686 R 間識別されました。TK686 と TK686 R の両方から読み取りセットで評価した報道各バリアントのすべてのケースで最も一般的な変種は、2 つのライブラリと同じだった。TK686 1 T→C 1 G→A 1 G→T、1 G→-、1 C→A、1 T→A、C→A の 4 つのバリエーションを示した。これらの亜種の 5 つはアセンブリにその定款にかもしれない順序の誤りと低い全体的なカバレッジの結果を示唆しているホモポリマー文字列内で発生しました。他の葉緑体ハプロタイプ バリエーション、シーケンス エラー、またはシトシン脱アミノの結果またはこれらの要因のいくつかの組み合わせだったかもしれない。TK686-R は、1 C→T、1 G→T、1 A→G を持っていた。C→T と G→T の亜種は、上記のホモポリマーで発見されました。最終的には、同一の完全な葉緑体ゲノムは両方の読み取りのセットから識別されました。緑豊かな21を使用して、Andropogoneae 部族の他のメンバーと比較して、TK686 から 1 つの葉緑体ゲノムが付けられています。すべての標準的な葉緑体機能の注釈が付けられる: 8 Rrna、38 Trna および 84 の蛋白質コーディングの遺伝子。完全な葉緑体ゲノム、GenBank (MF170217) および緑豊かな27から使用できます。

ライブラリの reamplification からの潜在的なバイアスは、GC % の推定と合計推定トランスポゾン コンテンツを通じても決定しました。パーセントの GC は、カスタム スクリプト24を用いて推定しました。2 つのサンプルの GC 含量の違いは TK686 の 49.7 %gc と TK686 R に 51.2 %gc、無視されました。トランスポゾンの組成は、Transposome28を用いて推定しました。両方のライブラリの 100,000 の読み取りがランダムにサブサンプリング トランスポゾン構成を 90 パーセント アイデンティティ、0.55 の分画範囲、100 のクラスター サイズを使用して推定したし、RepBase 21.10 草繰り返し参照設定29。これは、これらのデータセットからトランスポゾン推定でブートス トラップを実行する 100 回を繰り返した。Transposome 出力から抽出されたトランスポゾンの主要な亜科の全ゲノムの割合と平均と 100 の複製のためにこれらの標準偏差を推定しました。M. R. マッケイン Github のレポジトリ トランスポゾン30でこれらの出力の生成に使用されるすべてのスクリプトを見つけることが、すべての結果は、ドリュアス (doi:10.5061/dryad.r8t2m) に寄託されています。(コピアやジプシーの長いターミナル繰り返しレトロトランスポゾン) の指標として 2 つの最も一般的なトランスポゾン亜科を使用して、結果 24.83 ± 33.52 ± 4.00% の ± 2.94% とジプシーの 31.68コピアとほぼ同一であった2.72%、TK686、TK686 R、24.00 ± 2.35% それぞれ (表 3)。これらのテスト結果このプロトコルの reamplification ステップが高度なゲノムの指標の意味のあるシーケンス バイアスを作成しなかった示唆しています。ただし、この単純な例が reamplified のすべてのライブラリを十分に反映できない場合があります。この 1 つのテストを示して reamplification ステップで r. TK686/TK686 のゲノム メトリックは本質的にバイアスなくシーケンス処理の十分な適用範囲を与えられた葉緑体ゲノムのアセンブリに導入されたバイアスは影響しませんが、実験、TK686/TK686 - r を本研究では提示が行われているターゲットの血統バイアスがないことを確認するにはお勧め転移因子の多様性を調査研究中に発生しました。

Figure 1
図 1: A の Agarose のゲルの画像) DNA の隔離および 10 標本から B) 最終的なシーケンス ライブラリ。各レーンの 3 μ L の DNA またはライブラリが使用されました。(A) DNA すべて標本隔離された劣化一般的な塗抹標本で見られるように。(B) 最終シーケンス ライブラリ描写 200 1,000 塩基; の広い分布を持つ 300 500 塩基対の主なバンド後者は reamplified ライブラリでより流行します。車線両方 (A) と (B) サンプルによって識別された、表 2の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 円形プロットのSchizachyrium scoparium(TK686) 葉緑体ゲノムの注釈と。標本由来 DNA のショットガン ・ シークエンシング法から完全に組み立てられたゲノム展示 139,296 塩基対 (bp) 81,401 の大規模な単一コピー領域 (LSC) の長さの合計 bp、22,669 の倒立リピート領域 (IR) 12,557 小さな単一コピー領域 (SSC) と bp、bp。標準蛋白質のコーディングの遺伝子、Trna、Rrna Andropogoneae 部族のメンバーは、注釈で識別されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 2:10 標本サンプルと 4 つの reamplified ライブラリの DNA 抽出とライブラリの準備の結果。さまざまな合計二本鎖 DNA 手順プロトコルでフィルター サイズの場合は特に、実証どのように変数の品質をすることができます。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。

テーブル 3: TK686 と reamplified TK686R の統計情報をシーケンスします。Reamplification は、全体の葉緑体ゲノムを組み立てる能力トランスポゾン組成推定や GC コンテンツ推定汚染真菌ゲノム全体の発生率には影響しません。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足表 1: 20 reamplified ライブラリを含む、40 の追加標本サンプルの DNA 抽出とライブラリの準備の結果。さまざまな合計二本鎖 DNA 手順プロトコルでフィルター サイズの場合は特に、実証どのように変数の品質をすることができます。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足図 1: 40 の追加 DNA 分離標本からの Agarose ゲル画像。(A) と (B) 20 別 DNA 分離を描写や標本由来 DNA の特性劣化を示します。各レーンの 3 μ L の DNA が使用されました。車線両方 (A) と (B) サンプルによって識別された、補足表 1の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれています。ホワイト クリーニングを削除できませんでしたゲル イメージャの工芸品が画像上の斑点。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

補足図 2: 標本由来 DNA から 40 の追加シーケンス ライブラリの Agarose のゲルの画像。各レーンのライブラリの 3 μ L が使用されました。最終的なシーケンス ライブラリは両方 (A) であると (B) の平均サイズは 300-500 塩基対。いくつかの増幅されたサンプルで見られる二次バンドは、ライブラリの「バブル」をお勧めします。車線両方 (A) と (B) サンプルで識別され、補足表 1の結果と比較することができます。はしごサイズは塩基対 (bp) で描かれています。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

補足図 3: 二次バンド除去、単一サイクルの PCR ステップ Agarose ゲル画像。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで提示されたプロトコルは、DNA の隔離および植物の乾燥標本からのライブラリの準備をシーケンス処理の包括的かつ堅牢な方法です。メソッドとそれを変更する必要は最小限の一貫性は、それは大規模な標本に基づくシーケンス プロジェクトのスケーラブルな標本の品質確認に基づいています。低降伏点ライブラリのオプション reamplification ステップを含めることは、低品質、低量、珍しい、またはシーケンスに適していないなる歴史的に重要なサンプルの包含をことができます。

初期 DNA の収穫の重要性
標本由来 DNA 劣化初期試料保存11検体の DNA と結果として 300 年以上古い歳31の数千に数百を動物の遺体から分離された DNA として劣化とされて,32します。 その結果、初期 DNA 収量の最適化成功シーケンス ライブラリの準備のため十分な高品質 dsDNA の取得で重要であります。草種滅菌砂の併用により最適な収率を達成し、初期研削における液体窒素のステップは、細胞壁のより徹底的な破壊と核酸のリリースを提供すること。このアプローチは、望ましい大きい dsDNA と望ましくない小さな断片 (図 1、補足図 1、表 2、補足表 1など) の両方を増加します。その後ビード清掃手順は隔離し、シーケンス (300-500 塩基対) が回復を大幅に削減、また長いフラグメント (表 2、補足表 1) 豊かに適したサイズの断片に豊か。初期の DNA 分離手順への変更は、下流の処理18二次代謝産物の影響を低減するためにサンプリングされている系統に基づく必要かもしれません。

ライブラリ アダプターの最適化
結紮用アダプターの濃度は、完成したライブラリ アダプター二量体の量に直接影響します。アダプター アダプター セルフライゲーションに起因する不十分なサンプルが存在する場合およびシーケンス実行33を汚染します。標本から利用可能な比較的低い合計 dsDNA 結紮する前にアダプターの希釈が必要になります。アダプターを, 50 倍希釈することができます 15 μ M のストック濃度から個別に測定し、各サンプル (表 2、補足的なテーブルのアダプターを希釈することがなく (プロトコル セクション参照) 促進高スループット ライブラリの準備1). アダプターの彩度は原則的に全体的なライブラリ収量を低下させる、標本がアダプターのような過剰に dsDNA をもたらすこと可能性がありますはありません。

掃除の手順を利回りが高いビーズのバリエーション
シーケンス ライブラリの準備のためにサイズの選択は、目的のサイズ範囲内で主にフラグメントの増幅を可能にするアダプター結紮後通常行われますこの大きく、ターゲット サイズより小さいフラグメントを削除することによって行われます。ライブラリの準備のための植物標本由来 dsDNA の低量を活かして低総 dsDNA の結果、この段階でサイズを選択した後は、悪化し、最終的に低収量最後のライブラリ。結紮後 90% ボリュームのビーズを使用して標準的なビーズ洗浄ステップを行い、以上合計 dsDNA の拡大のステップの濃縮のままです。非常に小さい DNA のフラグメントは、90% の量のビーズを使用して優先的に削除されます。サイズの選択は、目的のフラグメント サイズの充実により増幅されたライブラリを最後の手順で行われています。25 μ L とビーズの 6 μ L の 2 段階ボリューム (図 1 b、補足図 2) このプロトコル内で 400-500 塩基対の挿入のライブラリを取得するために最適化されていますが、目的の範囲を選択するビーズの合計ボリュームを調整できます。

サンプル ライブラリの Reamplification を救助
にもかかわらず、DNA の隔離とライブラリの準備に関するベスト プラクティス、シーケンス処理ライブラリの最終濃度がさらにシーケンスの適切なあります。標本からのサンプリングとしばしば限られた消耗材料の破壊的な性質では、DNA の隔離を繰り返しは常に許可されていません。最大ライブラリを reamplifying で 12 追加の PCR のサイクルも非常に貧しい人々 ライブラリに保存できます。標準的なプライマーは、増幅は、いずれかのデュアルまたはシングル インデックス ライブラリ プロトコルと互換性のあるに使用されます。Reamplification にとって最大の関心事は、GC リッチ部ゲノム20削減により多くの場合、バイアスの紹介です。高品質なポリメラーゼを使用して (材料の表を参照)、これらの潜在的なバイアスを回避可能性があります。これは TK686 と TK686-R (表 3) シーケンスされたライブラリの GC 含量の最低限の変化により示される.2 番目の検証として TK686、TK686 R のトランスポゾン コンテンツは推定され目に見える差はみられなかった (表 3)。最後に、TK686 と TK686-R は、(図 2表 3) の 2 つのアセンブリ間の変動が SNP の厳重な点検の後同一シーケンスの結果からこの加盟の全体の葉緑体ゲノムを組み立てた。これらのテストは、GC 含量とトランスポゾン成分や完全な葉緑体ゲノムを組み立てる能力が受けないこと reamplification のようの標準的なゲノムの指標をお勧めします。これは標本の標本も低下すると考えを組み込むこと、または pcr 法によって導入されたバイアスを気にせずゲノミクス研究材料に欠けているの可能性を開きます。SNP の呼び出しが偏っているかどうかをテストする必要がありますがもシーケンス キャプチャ34, これらの reamplified ライブラリを使用可能性があります。プロジェクトごとにシーケンス ライブラリにバイアスを生じないことを確認するとバイアスの小規模テストを実施することをお勧めします。

制限事項と可能な修正
このプロトコルに取り組んでいるにもかかわらず標本、悪いの何百もの組織を保持まだ任意のステップで失敗します。しかし、それは極めてまれな成功の DNA の抽出と組織から reamplification を通じてライブラリ救助後は特に失敗するライブラリの。対象とする別のサイズのフラグメントまたはフラグメントのいくつかの最終的なライブラリでの広い範囲を減らすために、サイズの選択手順を変更できます。としてすべての植物ベースの抽出のプロトコルと手順は必要かもしれない全体的なプロトコルを妨げることができる系統固有の二次化合物を削除します。提示、このプロトコル草押し葉標本の DNA 分離、高速ライブラリの準備のための標準的な方法を提供します、実験と検証を通じて、他の植物の系統を除去する可能性があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、彼らが競合する利益あるを宣言します。

Acknowledgments

破壊的なサンプリングの標本へのアクセスのためのミズーリの植物園とサンプリング標本、援助のクリスティーナ Zudock ヨルダン Teisher、テイラー AuBuchon-高齢者を感謝いたします。この作品は全米科学財団 (DEB-1457748) からの助成金による支援です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4452300 96 well 
Gel Imaging System Azure Biosystems c300
Microfuge 20 Series Beckman Coulter B30137
Digital Dry Bath Benchmark Scientific BSH1001
Electrophoresis System EasyCast B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) ELGA  89204-092
DNA LoBind Tube  Eppendorf 30108078 2 ml
Mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific 12-812
Mortar Fisher Scientific S02591 porcelain
Pestle fisher Scientific S02595 porcelain
Centrifuge tubes fisher Scientific 21-403-161
Microwave Kenmore 405.7309231
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR VWR 20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Balance Mettler Toledo PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage Nalgene F9401
Magnetic-Ring Stand  ThermoFisher Scientific  AM10050 96 well 
Water Bath VWR 89032-210
Hot Plate Stirrers VWR 97042-754
Liquid Nitrogen Airgas UN1977
1 X TE Buffer Ambion AM9849 pH 8.0
CTAB AMRESCO 0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL AMRESCO 0482-200ML
Ribonuclease A AMRESCO E866-5ML 10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63882
Sodium Chloride bio WORLD 705744
Isopropyl Alcohol bio WORLD 40970004-1
Nuclease Free water bio WORLD 42300012-2
Isoamyl Alcohol Fisher Scientific A393-500
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific s608-500
LE Agarose GeneMate E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder Gold Biotechnology D003-500
EDTA, Disodium Salt IBI Scientific IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32854
TRIS MP Biomedicals 103133 ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X) New England BioLabs B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase New England BioLabs M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina  New England BioLabs E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabs E7600S Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus Omega bio-tek M1386-02
GelRed 10000 X Pheonix Research 41003-1
Phenol solution SIGMA Life Science P4557-400ml
PVP40 SIGMA-Aldrich PVP40-50G
Chloroform VWR EM8.22265.2500
Ethanol Koptec V1016 200 Proof
Silica sand VWR 14808-60-7
Reamplification primers Integrated DNA Technologies see text
Sequencher v.5.0.1 GeneCodes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Tags

問題 133、標本の遺伝学、DNA の隔離、高スループット シーケンス、museomics、ゲノミクス、草
堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg,… More

Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg, E. A. Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens. J. Vis. Exp. (133), e56837, doi:10.3791/56837 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter