Summary
非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides を準備します。
Abstract
リポ蛋白は、細胞膜の重要な構成要素と哺乳動物の生得の免疫反応の強力な活性剤です。細胞生理学と免疫学にその重要性にもかかわらず多くの新しいリポ フォーム、合成方法、および宿主免疫能に関する様々 な形態の影響について発見される遺跡します。リポタンパク質に関する徹底した研究を有効にするには、このプロトコルを記述する細菌のリポタンパク質濃縮法と N 末端トリプシン lipopeptides のマトリックス支援レーザによる構造決定のための準備脱離イオン化飛行時質量 (MALDI-TOF MS)。プロトコルにはリポタンパク質の抽出と濃縮細菌の細胞膜から分割設立 Triton X-114 段階で拡大して、リポ蛋白の収率を増加させる、非リポタンパク質の汚染物質を除去する追加の手順が含まれていて、純度。リポタンパク質は、Toll 様受容体 (TLR) 試金で一般に使用され、最初 MALDI-TOF さん・・・による N 末端構造を特徴づける重要なは、N 末端の濃縮濃縮された疎水性ペプチドを分離する手法を提案します。lipopeptides ナトリウム Dodecyl 硫酸塩ポリ アクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分離されている MALDI-TOF MS さんのリポタンパク質の直接分析に適したニトロセルロース膜に転送されますその場で消化トリプシン、順番にポーラー由来ペプチドを削除する洗浄し、最後にクロロホルム-メタノールで溶出します。洗浄溶液からより極 trypsinized ペプチドの MS と相まって、このメソッドは、リポ蛋白質を識別して単一の実験でその N 末端を特徴付けるのための機能を提供します。意図的なナトリウム付加体形成より多く構造的に有益な断片化スペクトルを促進するツールとしても採用することができます。最終的には、リポタンパク質の濃縮とその N 末端構造の決定は、細菌蛋白質のこのユビキタス クラスのより広範な調査が許可されます。
Introduction
細菌のリポタンパク質は、節約された N ターミナル脂質修飾システイン細胞膜の表面に球状タンパク質ドメインをアンカーによって特徴付けられます。彼らは普遍的に、典型的なゲノム1内のすべての細胞遺伝子の 2 ~ 5% を構成する細菌で配布されます。リポタンパク質はさまざまな養分吸収、シグナル伝達、細胞プロセスで重要な役割を再生、タンパク質複合体の維持およびアセンブリ細胞エンベロープ構造健全性2。病原性細菌のリポタンパク質は病原性因子3,4として機能します。感染中は、Toll 様受容体 (TLR) 2 によって N 末端 lipopeptides の認識は侵入病原体を削除する自然免疫応答を誘発します。N 末端のアシル化状態に応じてリポタンパク質一般に代替 TLR2 ヘテロ二量体複合体によって認識されます。TLR2 TLR1 は、TLR2 TLR6 バインド無料リポペプチド α-アミノ酸テルミニ間の N アシル化 lipopeptides を認識しています。炎症性サイトカイン3,4の分泌を誘発するのにバインドされた後、シグナル伝達経路は収束します。
以前、グラム陽性細菌由来のリポ蛋白だったおよびグラム陰性菌からの diacylated triacylated、節約された N ターミナル システイン残基のアミド結合脂肪酸の有無が異なると考えた。この仮定は、Lnt、triacylated リポ蛋白5を形成するグラム陰性 N アシル転移酵素にグラム陽性菌ゲノムのシーケンスのオルソログ遺伝子の欠如によって支えられました。しかし、最近の研究は明らかにグラム陽性フィルミクテス門その欠如lntでリポ triacylation として、ペプチド、lyso とN -アセチル フォーム6,7 と呼ばれる 3 つの新規 N ターミナル リポタンパク質構造 ,8。これらの調査結果はまだ発見の可能なリポ蛋白フォーム、様々 な形態を伝えるこれらの小説のリポタンパク質の作り方について基本的な質問どのような生理学的な目的や利点と一緒にについて問題を提起します。さらに、彼らは明らかに、リポ蛋白質の構造を予測するためのゲノム科学の現在できないことを示しています。確かに、リポタンパク質 N アシル基転移酵素は、腸球菌セレウス菌、lyso フォーム リポタンパク質9から点灯と呼ばれるの新しいクラスが最近わかりました。これは実験的、非常に疎水性とその分子構造の特性評価に利用可能な限られた方法のために挑戦することができますリポ蛋白の構造を確認する必要を示します。
リポ蛋白質 N 末端構造決定と同様に、宿主の免疫応答の誘導に関する研究を容易にするには、我々 は細菌性リポ蛋白質を浄化し、トリプシンの N 末端を準備するためにいくつか説明したプロトコルを適応しています。MALDI-TOF MS6,10、11,12による解析のための lipopeptides。リポタンパク質は、汚染の非リポタンパク質を削除し、リポタンパク質の収穫を増加するための最適化を使用してメソッドを分割設立 (界面活性剤またはテキサス州 114 と今後は呼ばれる) Triton X-114 位相を用いた濃縮されています。これらの脂蛋白質は SDS ページによって更に精製、TLR の試金で直接使用するために適しています。MALDI-TOF MS の硝酸セルロースの膜にリポ蛋白の転送はトリプシン消化効率の良いその場の足場を提供し、洗浄、および高の結果、膜表面からその後溶出精製 N 末端 lipopeptides。ニトロセルロースは検体の取扱いを容易にし、リポタンパク質9,10 と同様に不可欠な膜蛋白質13,14から高疎水性ペプチド シーケンス カバレッジを向上させる示されています。.このメソッドは単一の実験の N 末端構造決定と同時に精度の高いタンパク質同定の中間洗浄ソリューションを解析するので、極性に基づくペプチドを分留の付加的な利点.このプロトコル一意に機能意図的なナトリウムは、MS/MS Nアシル化状態の構造の割り当てを支援中に dehydroalanyl イオンに向かって親イオン化を促進するために形成を付加物します。N 末端は、リポタンパク質の TLR の認識に関連する最も変数とキーの両方の機能です。一緒に取られて、このプロトコルが精製と簡単に実験の全体的な目標に応じて適応 MALDI-TOF 質量分析法による構造決定の個々 の段階でのリポタンパク質に集中的に、再現性のある研究をできました。
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Protocol
1. セル成長および換散
- 遅い指数段階 (外径600 1.0 1.5) に 15 mL のトリプシン大豆のスープ (TSB) または同じようなリッチ メディアの細菌を成長します。遠心分離によって細胞を収穫、トリス緩衝生理食塩水/EDTA (TBSE) で 1 回洗浄しプロトコルは、または使用するまで凍結します。
注: TBSE: 20 mM トリス塩酸 (HCl)、pH 8.0、130 mM 塩化ナトリウム (NaCl) と 5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA))。リポ蛋白の発現と修正は、(例えば酸味、塩分、成長媒体) の成長条件と成長段階15によって影響があります。細胞の成長は望ましい、しかし 15 mL スケールが過剰なバイオマスは、リポタンパク質収量を減らすことができます、セルのリポタンパク質の 1 つの準備のため推奨です。1 つ 15 mL 準備は一般的に 2 ~ 4 の最適な読み込みのために十分なサンプルを生成標準 SDS ページのミニ ゲルの車線。 - 800 μ L TBSE 1 mM フェニルメチル フッ素 (PMSF) と 0.5 mg/mL リゾチーム細胞を再懸濁します。スクリュー キャップと o リング 2.0 mL スレッド微量遠心チューブにソリューションを転送し、37 ° C で 20 分間インキュベート
注: 特定の種はリゾチームによる溶解に感受性がないです。換散の支援するためには、適切な酵素を置き換えてください。 - チューブに 〜 800 μ L 0.1 mm ジルコニア ・ シリカ ビーズを追加し、30 の 5 サイクルの圧力式ホモジナイザーの最大速度 (7,000 rpm) で揺することによって細胞を混乱させる各サイクル間氷の上残り 2 分、それぞれ s。
- (ビーズと切れ目のない細胞の餌) に 4 ° C で 5 分間 3000 × g で遠心分離機のサンプルです。新しい 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送して氷の上。
- 残りのペレットに TBSE 200 μ L を追加し、追加のサイクルのホモジナイザーに戻ります。(上記) 遠心し、(800-1000 μ L の総ボリュームあるべき) 以前の上澄みで上清を組み合わせます。
2. テキサス州 114 フェーズ分割によるリポタンパク質の濃縮
- 逆解析による混合 〜 15 分毎、1 時間氷上インキュベートし、4% (巻/巻) 冷たい TBSE の界面活性剤の等しい量を追加することによって最終濃度 2% (巻/巻) のテキサス州 114 を界面活性剤で上清を補完します。
注: ときに冷やして、上澄みと界面活性剤になります混和性。 - 37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベートします。Bi 一過性の分離を維持するために室温で 10 分間、10,000 × g でサンプルを遠心します。
- 優しくピペットの上部の水相をオフし、破棄します。元のボリュームにチューブを補充する低い界面活性剤相に冷たい TBSE を追加し、ミックスに反転します。氷上で 10 分間インキュベートします。
- 37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベート、室温で 10 分間、10,000 × g で遠心分離します。
- 3 分版の合計に対して手順 2.3 2.4 をもう一度繰り返します。上層の水相を削除し、破棄します。
- 界面活性剤相に冷たい TBSE の 1 ボリュームを追加して (管の下部に表示されます)、抽出の過程で形成された沈殿したタンパク質のペレットを削除します。不溶性タンパク質を餌に 2 分 16,000 x g で 4 ° C で遠心分離機します。
注: サンプル単相のままする必要があります。相分離が発生すると、再サンプルを冷やすし、再び遠心分離します。ペレットが非リポタンパク質の汚染物質の一般的構成の詳細な分析を保持できます。 - すぐに 100% アセトンの 1250 μ L を含む新鮮な 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送します。粘性があるため先端からサンプルを洗う徹底的に上下ピペットします。逆解析による混合し、蛋白質を沈殿させるのに-20 ° C で一晩インキュベートします。
- 管の向きに注意してリポタンパク質ペレットを室温で 20 分間 16,000 x g でサンプルを遠心します。リポタンパク質管の外の壁に沿って薄く、白い膜が形成されます。
- 100% アセトンで 2 回ペレットを洗浄します。アセトンをデカントし、乾燥空気サンプルを許可します。
- 10 mm トリス-HCl、pH 8.0 または標準的な塩化物イオンと SDS ページ サンプル バッファー16 20 40 μ L を追加し、沈殿したリポタンパク質が付いている壁に対して上下にピペッティングして徹底的に再懸濁します。リポタンパク質を取り除くためピペット チップ、チューブの側面をこすり。
注: リポタンパク質は Tris バッファーでは分解しないが、懸濁液を形成します。- 使用するまで-20 ° C でリポを保存します。
3. SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびプロトコルが Ponceau s 染色
- 標準的な方法16を使用して SDS ページによる独立したリポタンパク質。
注: 適切なゲル アクリルアミドの割合は、その使用目的とリポタンパク質のサイズによって異なります。ここでは、 e. フェカリスリポタンパク質分離された 10% 以上トリス-グリシン ゲル大腸菌小さい Lpp17リポタンパク質の 16.5% トリス トリシン ゲルが使用されていた。 - 標準的な電気的ブロッティング法プロシージャを使用してニトロセルロース転送膜にリポ蛋白を転送します。
注: Bjerrum シェーファー ニールセン バッファー プラス 0.1 %sds を使用して半乾燥の転送は、25 V、1.3 で行われた 15 分18mA。また、ブロッティング (PVDF) される可能性があります、しかし、それは後の手順で膜から疎水性 lipopeptides の効率的な溶出を減らすことがニトロセルロースより疎水性よりは。 - 硝酸セルロースの膜を Ponceau S 溶液 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 酢酸) でカバーしてコンテナーに転送します。ロック 5 分間優しくまたは赤ピンクのバンドが表示されるまで。
- Ponceau S 溶液を捨て、dH2過剰な削除する O 染色と硝酸セルロースの膜を慎重にすすいでください。
注: Ponceau ステンド帯域が急速にすすぐ。バンドが表示されなくなった場合は、染色の手順を繰り返します。 - きれいなかみそりの刃を持つバンドと微量遠心チューブへの転送を切除します。DH2O にバンドを完全にすすぐの 1 mL で 3 回洗浄します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。使用するまで-20 ° C で水で覆われて切除のセクションを格納します。 - きれいなかみそりの刃ときれいな表面にセクションを転送、0.5 mL 低蛋白結合遠心チューブに個小片のおよそ 1 mm x 1 mm. 収集にニトロセルロース ストリップをサイコロします。
- 出来立ての 50 mM 重炭酸アンモニウム (NH4HCO3)、0.5 mL で 2 回部分を洗浄し高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレード水で pH 7.8。
4. トリプシン消化、硝酸セルロースの膜、MALDI ターゲット、およびデータ集録の沈着からリポペプチド抽出
- 50 mM NH4HCO3、pH 7.8 HPLC グレードの水でトリプシンの 20 μ g/mL の溶液の 20 μ l 硝酸セルロースの部分を再懸濁します。ミックスする渦は、すべての作品が、トリプシン溶液によって完全に覆われていることを確保するため簡単にスピンします。蒸発を防ぐために、ダイジェスト 37 ° C で一晩インキュベート パラフィン フィルムを使用してチューブの蓋をカバーします。
- スピン 30 s や削除ピペッティングによる液体のための 16,000 x g でサンプル。
注: これはトリプシンの親水性ペプチド MALDI-TOF 質量分析法によるタンパク質の同定を後で調べることが削除されます。 - HPLC グレードの水に 0.5% トリフルオロ酢酸 (TFA) の 50 μ L を追加します。渦の回転のすべての部分は、ソリューションによって覆われていることを確認する簡単にサンプルを。室温で 10 分間インキュベートします。ピペッティングで液体を削除します。
注意:TFA は吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。 - 手順 4.3 10% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。
注意:アセトニ トリルは吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。 - 手順 4.3 20% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。
注: これは緩く、ニトロセルロースにバインドされている任意の緩やかな疎水性ペプチドを削除します。 - 溶出が緊密にバインドされた lipopeptides をクロロホルム-メタノール (2:1、v/v) に溶解したて 10 mg/mL α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスの 15 μ L を追加し、断続的なボルテックスを室温で 10 分間インキュベートします。
- または、追加 15 μ L クロロホルム-メタノール溶出が lipopeptides と後で行列と混ぜます。2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) など、他の行列は、不満足な結果が特定のリポペプチド コンポジションの場合 CHCA に代わるものとしてテスト必要があります。
注意:クロロホルム、メタノール、吸入すると有害。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。 - オプション:ナトリウムを促進する付加体を形成、1 mM の最終的な集中に炭酸水素ナトリウム水溶液 (NaHCO3) とクロロホルム - メタノール CHCA のソリューションを補完します。
- または、追加 15 μ L クロロホルム-メタノール溶出が lipopeptides と後で行列と混ぜます。2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) など、他の行列は、不満足な結果が特定のリポペプチド コンポジションの場合 CHCA に代わるものとしてテスト必要があります。
- サンプルを簡単にスピンします。ピペット、新しい低蛋白結合遠心チューブに液体を慎重に転送します。このソリューションは、N 末端 lipopeptides の大部分を含まれます。
注: 硝酸セルロース部分的または完全に分解するかもしれないことクロロホルム-メタノール溶液中。これは MS の結果、マイナス影響を及ぼさない、リポペプチド リターンを高めるに代替手段として使用することがあります。PVDF 膜は同じように分解しません。 - 洗練された鋼 MALDI ターゲットに CHCA で溶出した lipopeptides の 1 μ L を入金します。
注: クロロホルム-メタノールは迅速に、結晶の CHCA と lipopeptides を残して蒸発されます。オプション 2 番目 1 μ L 分注は、サンプル濃度を増加する同じ場所上に堆積することができます。クロロホルム-メタノールはターゲットに沈着後大幅に広がる可能性があり、よう、注意が必要サンプルがターゲットの混合を避けるために。預金、各サンプルの複数のスポットを撮影することをお勧めします。 - すぐに質量分析に進みます。特に場合は、スポットは、2 番目の層は、スポットの外側の縁に、lipopeptides をプッシュ可能性がありますサンプルでは、2 つの層は、リポペプチド信号のためのスポットのすべての領域をスキャンします。
注: 推奨される開始レーザー強度が 25%、信号を集録し、十分な信号対雑音比を達成するために複数のスペクトル (20 以上スキャン) の合計強度を高める必要があります。ここでは、スペクトルは MALDI-TOF TOF の計測器で得られた (材料の表を参照してください) リフレクター陽イオン検出 700-3500 m/z範囲にわたって工場構成楽器法を用いたします。ウシ血清アルブミン (BSA) のトリプシン ペプチド混合物と計測器が校正されました。
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Representative Results
プロトコルの概略は、図 1で提供しています。テキサス州 114 によって腸球菌ATCC 19433 から抽出されたリポ蛋白濃縮率は図 2に示します。比較、また沈殿の蛋白分画の帯状の模様が表示されます。この画分からの蛋白質は非常に豊富なリポタンパク質 (表 1) 以外のタンパク質を汚染する MALDI MS によって確認されました。質量スペクトル図 3に示す溶媒の極性 (に記載されているピークの割り当てを増やすことでニトロセルロース バインド PnrA の後洗浄で腸球菌のリポタンパク質に発生する PnrA のトリプシン ペプチド イオン プロファイル表 2)。図 4に示すN-PnrA 定める MALDI-TOF MS/MS、明らかに lyso リポ蛋白の形で一貫した診断のN- アシル化 dehydroalanyl ピークでのターミナル構造解析。図 5は、ナトリウムの効果を示していますN- アシル化 dehydroalanyl イオンを支持して優先的に断片化 sodiated 親イオン フラグメント化形成を付加します。
図 1: プロトコルのスケマティック。リポタンパク質はテキサス州 114 フェーズ分割することにより濃縮し TLR の試金で直接、最も一般的に使用または構造決定の SDS-PAGE で更に精製できます。リポタンパク質は、ニトロセルロース、段階、洗浄、トリプシン消化され、MALDI 質量分析法による構造解析のためのクロロホルム-メタノール溶出結果 lipopeptides に転送されます。トリプシンとニトロセルロースの洗浄溶液は、タンパク質の同定と MS 分析のため保存があります。w/:;TFA: トリフルオロ酢酸;ACN: アセトニ トリル;CHCA: α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸;選択: 省略可能です。MALDI: マトリックス支援レーザー脱離イオン化MS: 質量分析法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: テキサス州 114 のプロファイルを豊かに腸球菌からタンパク質。10% トリス-グリシンの SDS ページのゲル染色 Coomassie 青い(A)と対応する硝酸セルロースの膜と沈殿したタンパク質画分 (「PPT」) 精製のパターン別にバンディングを Ponceau S (B)明らかにステンド グラスリポタンパク質 ("LP")。指定された Coomassie 染色バンド切除し、(表 1参照) 由来のペプチドの MALDI 質量分析法による非リポタンパク質として識別されます。PnrA が特定され記載プロトコルによって分析しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ニトロセルロースの極性のイオン プロファイルと豊富な変更洗浄ソリューションです。(A)トリプシン部分は、図 2に示されている PnrA e. フェカリスリポに対応するいくつかの内部ペプチド フラグメントを示します。分数の信号強度の変化を示して、個々 のピークの全体数の減少 10% 20% と(B) (C)アセトニ トリルを洗います。(D)の N 末端リポペプチドの最終的な溶出画分と濃縮されて高いm/z 997、アスタリスク (*) で示されます。各スペクトルの強度は、信号強度の比較のために(A)に正規化されます。ピーク大衆と割り当てられたシーケンスは表2 のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| バンド | 蛋白質 ID | 加盟号 | 推定分子量 | ペプチド数 | |
| 1 | 伸長因子 Tu | gb |EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH ペルオキシダーゼ | gb |EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | ピルビン酸脱水素酵素 E1component、α サブユニット | gb |EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ E1 コンポーネント、サブユニット β | gb |EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30 代リボソームタンパク質 S2 | gb |EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30 代リボソームタンパク質 S3 | gb |EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
表 1: 沈殿したタンパク質、リポタンパク質非汚染します。タンパク質は、トリプシン消化と MALDI MS によって識別された標準を使用してゲルの消化力のプロトコル19 図2 Coomassie ゲルに表示される順序と同じ順序で下に上から表示されます。各蛋白質に、信頼区間 (c. i.) 95% 以上が確認されました。
| ピーク数 | 理論的質量 | 蛋白質の位置 | 違います。逃したカット サイト | ペプチッド シーケンス | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129 145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285 301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230 247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230 254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
表 2: 固まりおよび対応する由来ペプチドを観察。腸球菌PnrA のトリプシン消化インシリコ(GenBank: EOL37280.1) がサイトをカットを逃した 2 つまで許可する PeptideMass20,21を使用して実行した。図 3のスペクトルで観察されたピークの理論的な大衆は、対応するペプチッド シーケンスとともにリストしています。
図 4: e. フェカリスリポ蛋白 PnrA の MALDI-TOF MS。(A)の親 MS スペクトル、 m/ e. フェカリスPnrA の N 末端リポペプチドに対応する z 997 領域。(B) MS/MS リポペプチド ピークの診断N- アシル化 dehydroalanyl ペプチド フラグメント イオン ピークとアスタリスク (*) で示された、lyso フォームであることを明らかにします。解明の構造(C)を示します。この図は、前の文書の9から変更されています。ロードアイランド: 相対強度この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ナトリウム付加体形成 dehydroalanyl リポペプチド イオンに向かって親イオン化を促進する。(A) MALDI-TOF スペクトル (ターコイズ ブルー トレース) ことがなく大腸菌リポ Lpp N 末端ペプチド (ブルー トレース) と重炭酸ナトリウム添加。最終的な溶出画分に重炭酸ナトリウム添加親リポペプチドの計算された質量から 22 Da 増加で起因します。Nに向けて大幅な優遇断片化プロトン化イオン(B)の MS/MS スペクトルと比較すると、対応する sodiated イオン(C)の MS/MS スペクトルを示します-アシル-中立 dehydroalanyl イオンアスタリスク (*) によって示される、diacylthioglyceryl 基の除去。親 triacylated Lpp N ターミナル トリプシン ペプチドの構造(D)とN-アシル-dehydroalanyl ペプチド フラグメント イオン(E)が描かれています。この図は、前の文書の9から変更されています。ロードアイランド: 相対強度この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルは、リポタンパク質特性の 2 つの明瞭な段階を記述: テキサス州 114 によって濃縮相 MALDI-TOF 質量分析法による分割と構造決定。テキサス州 114 抽出中に追加の遠心分離は高濃縮のリポタンパク質を生成するアセトンの沈殿物に続いて、このプロセス中に沈殿汚染タンパク質を削除します。各セル 15 mL 分の準備の規模を制限すると、いくつかのサンプルすることができます簡単に、並列に処理して、必要な場合は、プロトコルの最後でプールします。
質量分析法による構造解析で、ニトロセルロースにリポ蛋白の転送トリプシンの消化力、洗濯、その後膜溶出容易になります。私たちの手でこのアプローチは、リポ蛋白の硝酸セルロースの膜の表面に関連付けられている、ポリアクリルアミドに埋め込まれていない伝統的なポリアクリルアミドゲル プラグから洗剤を介した抽出する方が適していると証明しました。硝酸セルロース表面とリポ蛋白関連も大きく疎水性ペプチドによるコンテナー表面に非特異的吸着の共通の問題を防ぎます。ニトロセルロース作品の段階溶出法より親水性、内部由来ペプチド MALDI-TOF MS 最終的な溶出のステップを再現性をもって生成しながら精度の高いタンパク質同定課題を達成するために、分析することができますを削除します。主に干渉している塩のイオン汚染物質を抑制する無料の小さなボリュームに濃厚 lipopeptides。
リポタンパク質の MS 解析に成功はその豊かさとですから、Ponceau S 染色膜から暗いバンドが最良の結果を与える可能性があります。ただし、いくつかのリポタンパク質がページの分離は、結果として得られるスペクトルを複雑に単一のバンドで移行ことがあります不可能です。したがって、強くお勧め最初蛋白質を識別するために指紋採取 (PMF)、ペプチドの質量によってトータル分数またはアセトニ トリル洗浄分画の MS スペクトルを収集し、入力に結果として得られるピークで遂行できる、マスコット22などのソフトウェア。タンパク質配列が決定されて、一度は大幅トリプシンの N 末端リポペプチドの質量を計算する MS/MS によるフラグメント イオンを選択に役立ちます。
その他のサンプルの不均一性は、人口と N 末端修正、両方ソース細菌6に応じて内のリポ蛋白質のアシル鎖長を変化させる起因できます。メチレン グループ (以下 - チャンネル2-) に対応する 14 の Da 増分によって特徴付けられる親スペクトルに特徴的なピークあるクラスターのチェーンの長さの変化は、全体的なリポペプチド信号を分割し、感度を減少できます。またそうだ濃縮と断片化、リポタンパク質の異なるフォームに影響を与えることにもかかわらず、我々 は正常に triacylated、diacylated、および記述されているプロトコルを使用して lyso フォーム リポタンパク質を識別しました。同様に、リポタンパク質のさまざまなペプチド鎖の複雑さの別のレベルに追加解析、その N 末端構造に関係なく非常に親水性のアミノ酸組成はリポペプチド有機クロロホルム段階に分割できない場合があります。その他の抽出方法8を使用します。このメソッドですべての溶出画分を分析できるようこのような lipopeptides の勉強に硝酸セルロースに、リポタンパク質の転送を支援します。
Triacylglycerides とリン脂質23を含む以前の文献から描画、意図的なナトリウム付加体形成の形成をより有益な断片化を促進するために使用することができます、(N-アシル)-dehydroalanyl ペプチド イオン。これらの特徴的なイオンは、N 末端のアシル化状態がグリセリル基にアシル置換から分離されて以来、構造体を割り当てることに重要です。ナトリウム付加体形成もNを促進する示されている過酸化水素による酸化硫黄に便利な代替選択肢を提供-アシル-dehydroalanyl ペプチドの断片化6,8。ショーに向けて dehydroalanyl イオン断片化の特定の増加、親イオン信号の全体的な抑制はナトリウム付加体が可能性がありますまで減少した親イオン強度を補正します。他の行列を探検する価値、最も報知的なスペクトルを引き出す付加体の追加の断片化。
このプロトコルは、分割、リポ蛋白濃縮硝酸セルロースの膜へのページ区切りのリポタンパク質の転送トリプシンの消化力と lipopeptides の溶出を促進しながら伝統的なテキサス州 114 フェーズに向上します。トリプシンまたは洗浄の合計分数の MALDI-TOF 質量分析は単一の実験 MS/質量分析法による N 末端構造決定とタンデムでタンパク質同定のためことができます。省略可能なナトリウムより有益なイオン化を促進することによって形成リポペプチド N 末端で差異の強調を付加します。日常的にリポ蛋白質を浄化し、その N 末端を特徴付ける能力、形態が作られどのように新しいリポ蛋白に関する広範な研究、細菌の細胞封筒内の生理学的役割、哺乳類の免疫によって検出する方法を有効にします。システム。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
メレディス ・ ラボでの研究は、エバリー科学大学 (ペンシルベニア州立大学) によって提供されるスタートアップ資金によって支えられました。専門的技術的な助言とペンシルベニア州プロテオミクスと質量分析法による中核施設、大学公園、PA の質量分析法による分析を行った機器へのアクセス、博士タチアナ Laremore に感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
