Summary
Обогащение бактериальной липопротеинов с использованием фазы неионных ПАВ, секционирование метод описан для прямого использования в TLR анализов или других приложений. Дальнейшие шаги подробно подготовить tryptic lipopeptides N-терминала для структурных характеристик по масс-спектрометрии.
Abstract
Липопротеины являются мощным активаторы млекопитающих врожденный иммунный ответ и важные составляющие конверт бактериальной клетки. Несмотря на их значение для физиологии клетки и иммунологии предстоит быть обнаружены формы роман липопротеинов, как они синтезируются и влияние различных форм на хост иммунитета. Чтобы включить тщательные исследования на липопротеинов, этот протокол описывает метод для обогащения бактериальных липопротеинов и подготовка tryptic lipopeptides N-терминальный структурные определения матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS). Расширение на установленных Тритон X-114 фазы, секционирование метод липопротеинов добычи и обогащения от бактериальных клеточных мембран, протокол включает дополнительные шаги для удаления загрязнений-липопротеиды, увеличивая урожайности липопротеинов и чистоты. Так как липопротеинов широко используются в Толл подобный рецептор (TLR) анализов, важно сначала охарактеризовать структуру N-стержня, г-жа MALDI-TOF здесь, изолировать концентрированной гидрофобные пептиды, обогащенный в N-терминальный представлен метод lipopeptides подходит для прямого анализа MALDI-TOF MS/жа липопротеинов, отделяющий натрия Додециловый сульфат-Полимерность электрофорез геля (SDS-PAGE) передаются на нитроцеллюлозную мембрану, усваивается в situ с трипсин, последовательно промывают для удаления полярных tryptic пептидов и наконец этого eluted хлороформ-метанола. В сочетании с MS более полярных trypsinized пептидов из Вымойте решения, этот метод обеспечивает возможность выявления липопротеинов и характеризуют его N-terminus в одном эксперименте. Преднамеренное натрия аддукт формирования также могут использоваться как инструмент для поощрения более структурно информативный фрагментации спектров. В конечном счете обогащение липопротеинов и определение структуры их N-терминала позволит более обширные исследования на этот вездесущий класса бактериальных белков.
Introduction
Бактериальные липопротеинов характеризуются сохранены N-терминальный липидного изменено хвоща, который закрепляет домена глобулярных белков на поверхности клеточной мембраны. Они распределены повсеместно в бактерии, составляют 2-5% всех клеточных генов в течение типичного генома1. Липопротеиды играют решающую роль в самых разнообразных клеточных процессов, включая поглощение питательных веществ, сигнальной трансдукции телефоны, Ассамблея белковых комплексов и в поддержании конверт структурной целостности2. В патогенных бактерий липопротеинов служат факторы вирулентности3,4. Во время инфекции признание lipopeptides N-стержня, Толл подобный рецептор (TLR) 2 подстрекает врожденный иммунный ответ для удаления вторжение патогенов. В зависимости от состояния ацилирования N-стержня липопротеинов распознаются как правило альтернативные TLR2 гетеродимерная комплексов. TLR2-TLR1 признает N-ацилированных lipopeptides, хотя TLR2-TLR6 связывает свободный липопептиды α-аминокислоты Термини. Один раз связанный, сигнальные пути сходятся побудить секрецию провоспалительных цитокинов3,4.
Ранее считалось, что липопротеинов от грамположительные бактерии были diacylated и те от грамотрицательных бактерий triacylated, отличаясь в отсутствие или наличие связаны Амида жирной кислоты на сохранившихся остатков цистеина N-терминала. Это предположение было поддержано отсутствие последовательности Ортологи в грамположительных геномы Lnt, трансферазы грамотрицательные N-ацил, которая формирует triacylated липопротеины5. Однако недавние исследования показали, triacylation липопротеинов в грамположительных Фирмикуты что отсутствие lnt, а также три романа структуры N-терминальный липопротеинов, называют peptidyl, lyso и N -ацетил формы6,7 ,8. Эти результаты поднимают вопросы о формах можно еще к быть обнаружил липопротеинов, наряду с основополагающие вопросы о том, как эти Роман липопротеинов и какие физиологические цели или преимущество распространять различные формы. Кроме того они наглядно демонстрируют геномики текущего невозможность предсказать структуру липопротеинов. Действительно мы недавно выявили новый класс липопротеинов N-ацил трансферазы, называется Lit, Enterococcus faecalis и Bacillus cereus , что делает lyso форма липопротеинов9. Это указывает на необходимость экспериментально проверить липопротеинов структуры, которая может быть сложным из-за их чрезвычайно гидрофобная природа и ограниченные методы, доступные для характеризовать их молекулярной структуры.
Для облегчения исследований по индукции липопротеинов иммунного ответа, а также структурные определения N-терминала, мы адаптировали несколько ранее описанные протоколы для того чтобы очистить бактериальных липопротеинов и подготовить tryptic N-терминальный lipopeptides для анализа MALDI-TOF MS6,10,,1112. Липопротеины обогащаются с использованием установленных Тритон X-114 (отныне именуемой ПАВ или TX-114) фазы, секционирование метод, с оптимизацией для удаления загрязняющих non липопротеинов и увеличить урожайность липопротеинов. Эти липопротеинов пригодны для непосредственного использования в TLR анализов или для дальнейшей очистки, SDS-PAGE. Для MALDI-TOF MS передачи липопротеинов нитроцеллюлозную мембрану обеспечивает леску для эффективного в situ Пищеварение трипсина, мытье, и последующие элюции от поверхности мембраны, что приводит к весьма очищенный N-терминала lipopeptides. Нитроцеллюлоза было показано, чтобы облегчить пробами и улучшить освещение последовательности для высокой гидрофобностью пептидов из составной мембранных белков13,14, а также липопротеинов9,10 . Метод имеет дополнительное преимущество, фракционирования пептиды, основанные на полярности, так что промежуточные Вымойте решения могут быть проанализированы для идентификации белков высокого доверия одновременно с N-терминальный структурные определения в одном эксперименте . Этот протокол уникально возможности преднамеренного натрия аддукт формирования способствовать фрагментации Ион родителя к dehydroalanyl ионов во время МС/МС, пособничество в структурной назначение государства - ацилирования N. N-го является наиболее переменных и ключевых функций, связанных с признанием TLR липопротеинов. Вместе взятые, этот протокол позволил интенсивной и воспроизводимости исследований на липопротеинов, с отдельные этапы очищения и структурные определения MALDI-TOF MS легко адаптированы в зависимости от общей цели эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост и Lysis клетки
- Растут бактерий в 15 мл tryptic соевый бульон (TSB) или аналогичные богатые средства массовой информации к поздней экспоненциальной фазе (OD600 1,0-1,5). Урожай клетки центрифугированием, раз промойте трис амортизированное saline/ЭДТА (TBSE) и продолжить с протоколом или заморозить до использования.
Примечание: TBSE: 20 мм трис гидрохлорида (HCl), рН 8,0, 130 мм хлорид натрия (NaCl) и 5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)). Выражение липопротеинов и модификации могут зависеть от условий роста (например кислотность, соленость, роста СМИ) и роста фазы15. Рост клеток можно масштабировать как пожелано, но 15 мл клеток рекомендуется для одного подготовки липопротеинов как излишки биомассы может снизить доходность липопротеинов. Один 15-мл препарата обычно дает достаточно образца для оптимальной загрузки ~ 2-4 майны на стандартный мини-геля SDS-PAGE. - Ресуспензируйте клетки в 800 мкл TBSE с 1 мм phenylmethyl сульфонилфторид (PMSF) и 0,5 мг/мл лизоцима. Передача решения резьбовые microcentrifuge 2.0-мл пробирку с винтовой крышкой и уплотнительным кольцом и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
Примечание: Некоторые виды не подвержены лизиса, лизоцима. Для помощи в лизис следует заменить соответствующие литических ферментов. - Добавить ~ 800 мкл 0,1 мм Бусины цирконий/кремнезема в трубку и нарушить клетки путем встряхивания на максимальной скорости (7000 об/мин) на гомогенизатор для 5 циклов 30 s, каждый с 2 мин отдыха на льду между каждого цикла.
- Центрифуга образца на 3000 x g 5 мин при 4 ° C (в гранулах, бисер и непрерывная клетки). Супернатант передать новой microcentrifuge 2.0 мл трубки и держать на льду.
- Добавить 200 мкл TBSE оставшиеся гранулы и вернуться в гомогенизатор для дополнительного цикла. Центрифуга (как выше) и объединить супернатант с предыдущей супернатант (должен быть общий объем 800-1000 мкл).
2. обогащение липопротеинов разделяя фазы TX-114
- Дополнить супернатант с TX-114 сурфактанта в конечной концентрации 2% (vol/vol), добавив равным объемом 4% (vol/vol) сурфактанта в ледяной TBSE и инкубировать на льду за 1 ч, смешивая путем инверсии каждые ~ 15 мин.
Примечание: Когда охлажденный, супернатанта и ПАВ будет смешивается. - Передать трубку ванну воды 37 ° C и проинкубируйте втечение 10 мин побудить разделение фаз. Центрифуга для выборки в 10 000 x g 10 мин при комнатной температуре для поддержания Би фазовые разделения.
- Аккуратно Пипетка с верхней водной фазе и отбросить. Добавьте ледяной TBSE нижней фазе ПАВ для пополнения трубки для его первоначального объема и инвертировать смешивать. Инкубируйте на льду за 10 мин.
- Передать трубку ванну воды 37 ° C и проинкубируйте втечение 10 мин побудить разделение фаз, а затем центрифуги на 10000 x g 10 мин при комнатной температуре.
- Еще раз повторите шаги 2,3-2,4 для в общей сложности 3 цветоделения. Снимите верхний водной фазе и выбросьте.
- Удаление Пелле осажденный белки, которые образуются в ходе извлечения (отображается в нижней части трубки), путем добавления 1 объем ледяной TBSE к этапу ПАВ. Центрифуга на 4 ° C на 16000 x g за 2 мин до Пелле нерастворимых белков.
Примечание: Образец должен оставаться одной фазы. Если происходит разделение фаз, повторно chill образца и центрифуги снова. Пелле обычно состоит из не липопротеиды загрязнителей, но могут быть сохранены для дальнейшего анализа. - Немедленно передать супернатант свежие microcentrifuge 2.0-мл пробирку, содержащую 1250 мкл, 100% ацетона. Пипетка вверх и вниз тщательно мыть образца от кончика, как это будет вязкой. Mix инверсии и Инкубируйте на ночь на 20 ° C до осадок белка.
- Центрифуга для образца на 16000 x g 20 мин при комнатной температуре в Пелле липопротеинов с вниманием к ориентации трубки. Липопротеинов станет тонким, белым фильм вдоль внешней стены трубы.
- Пелле мыть дважды с 100% ацетона. Декант ацетона и дайте высохнуть образца воздуха.
- Добавить 20-40 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8,0 или Стандартный буфер Лэмли SDS-PAGE образец16 и Ресуспензируйте тщательно, закупорить вверх и вниз к стене с осажденный липопротеинов. Царапина на стороне трубки с кончиком пипетки выбить липопротеинов.
Примечание: Липопротеинов не растворится в трис-буфере, но скорее формируют подвеска.- Хранить липопротеинов при-20 ° C до использования.
3. SDS-PAGE, Electroblotting и окрашивание Пуансо
- Отдельный липопротеинов, используя стандартные методы16SDS-PAGE.
Примечание: Соответствующий гель акриламида процентах будет варьироваться в зависимости от его предполагаемого использования и размер липопротеинов. Здесь E. faecalis липопротеинов были отделены более чем на 10% гель трис глицин, пока гель трис Трицин 16,5% было использовано для небольших E. coli липопротеинов Lpp17. - Передать липопротеинов нитроцеллюлозную мембрану передачи, с помощью стандартного electroblotting процедуры.
Примечание: Полусухие передачи с помощью Bjerrum Шафер-Нильсен буфера плюс 0,1% SDS была исполнена на 25 V 1.3 мА1815 мин. Поочередно могут использоваться винилидена фторид (PVDF) мембраны, однако как это гидрофобных чем нитроцеллюлоза, он может уменьшить эффективный элюции гидрофобных lipopeptides от мембраны на более поздних этапах. - Передать нитроцеллюлозную мембрану и крышка с раствор Пуансо (0,2% (w/v) Пуансо в 5% уксусной кислоты). Рок мягко в течение 5 минут или до тех пор, пока красно розовые полосы видны.
- Слейте раствор Пуансо и тщательно промойте нитроцеллюлозную мембрану с dH2O, чтобы удалить излишки пятно.
Примечание: Понсо окрашенных полос будет Отмойте быстро. Если полосы исчезают, повторите процесс окрашивания. - С чистым лезвием акцизных нужный диапазон и передачи пробки microcentrifuge. Вымойте три раза с 1 мл раствора dH2O полностью Отмойте группы.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Храните секции подакцизным, покрыты водой при температуре-20 ° C до использования. - Перенести раздел чистую поверхность и с чистым лезвием, кости нитроцеллюлоза газа на мелкие кусочки из примерно 1 мм x 1 мм. собрать куски в 0,5 мл низкопротеиновое привязки microcentrifuge трубку.
- Промыть куски бикарбонат аммония свежеприготовленные 50 мм (NH4HCO3), дважды с 0,5 мл рН 7,8 в воде класс высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
4. tryptic пищеварение, липопептиды извлечения из нитроцеллюлозную мембрану, осаждения на MALDI цели и сбор данных
- Ресуспензируйте нитроцеллюлозы штук в 20 мкл 20 мкг/мл раствора трипсина в 50 мм NH4HCO3, pH 7,8 в воде класса ВЭЖХ. Вихрь для микс, затем кратко спина для обеспечения охвата всех частей раствором трипсина. Обложка крышку трубки с использованием парафина фильм для предотвращения испарения и инкубировать дайджест ночь в 37 ° C.
- Спин образца на 16000 x g 30 s и удалить жидкость, закупорить.
Примечание: Это удаляет trypsinized гидрофильные пептидов, которые могут быть рассмотрены позднее MALDI-TOF MS для идентификации белков. - Добавьте 50 мкл 0,5% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в воде класса ВЭЖХ. Вихрь для микс, то спина образца кратко, чтобы убедиться, что все части покрыты решения. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре. Удалите жидкость, закупорить.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: TFA вредно при вдыхании. Ручка с осторожностью и использования в химической зонта. Избегайте контакта с кожей. - Повторите шаг 4.3 с 50 мкл 10% Ацетонитрил в воде класса ВЭЖХ.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Ацетонитрил вредно при вдыхании. Ручка с осторожностью и использования в химической зонта. Избегайте контакта с кожей. - Повторите шаг 4.3 с 50 мкл 20% Ацетонитрил в воде класса ВЭЖХ.
Примечание: Это удаляет любой умеренно гидрофобные пептиды, слабо связаны с нитроцеллюлозы. - Элюировать плотно прыгните lipopeptides, добавить 15 мкл свежеприготовленные 10 мг/мл α-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) матрица растворяется в хлороформе метанол (2:1, v/v) и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре с прерывистой vortexing.
- Кроме того добавьте 15 мкл хлороформ метанол элюировать lipopeptides и смешать с матрицей на более позднее время. Другие матрицы, например 2,5-dihydroxybenzoic кислота (DHB), должны быть протестированы как альтернативы CHCA, если для конкретного липопептиды композиции получены неудовлетворительные результаты.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Вредно при вдыхании хлороформе и метаноле. Ручка с осторожностью и использования в химической зонта. Избегайте контакта с кожей. - Факультативного: Для содействия натрия аддукт формирования, дополнить решение CHCA в хлороформе метанол с водного раствора бикарбоната натрия (NaHCO3) до конечной концентрации 1 мм.
- Кроме того добавьте 15 мкл хлороформ метанол элюировать lipopeptides и смешать с матрицей на более позднее время. Другие матрицы, например 2,5-dihydroxybenzoic кислота (DHB), должны быть протестированы как альтернативы CHCA, если для конкретного липопептиды композиции получены неудовлетворительные результаты.
- Вращайте образец кратко. С пипеткой тщательно передать жидкость новой трубки microcentrifuge низкопротеиновое привязки. Это решение будет содержать большую часть N-терминала lipopeptides.
Примечание: Нитроцеллюлоза может частично или полностью растворяются в решение хлороформ метанола. Это не влияет отрицательно на MS результаты и может использоваться как альтернативный метод для увеличения липопептиды возвращения. PVDF мембрану не растворится в том же порядке. - Депозит 1 мкл eluted lipopeptides с CHCA на полированной стали мишенью MALDI.
Примечание: Хлороформ метанол будет быстро испаряются, оставив позади кристаллизуется CHCA и lipopeptides. Необязательный второй 1 мкл аликвота могут быть зачислены на то же место для повышения концентрации образца. Хлороформ метанол может значительно распространилась после осаждения на цель, и как таковой, осторожность во избежание образца смешивания на целевом. Рекомендуется для депозита и стрелять несколько пятен каждого образца. - Немедленно приступить к масс-спектрометрии. Проверка всех областей местом для липопептиды сигнала, особенно если место содержит два слоя образца, как второй слой может подтолкнуть lipopeptides на месте внешний обод.
Примечание: Рекомендуется начальная лазерной интенсивности — 25%, хотя это может быть необходимым увеличить интенсивность сигнала и сумма нескольких спектров (20 или более сканирование) для достижения надлежащего соотношения сигнал шум. Здесь, спектры были приобретены на инструменте MALDI-TOF-TOF (см. Таблицу материалы) с помощью метода фабрики настроенного документа для выявления положительных ионов отражатель в диапазоне m/z 700-3500. Инструмент был откалиброван с бычьим сывороточным альбумином (БСА) tryptic пептид смесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1приводится схема протокола. Липопротеины плотности обогатил дроби, извлеченные из Enterococcus faecalis ATCC 19433 TX-114 показан на рисунке 2. Для сравнения также отображается диапазонов шаблон осажденный белковые фракции. Белки из этой фракции были подтверждены MALDI-MS быть очень обильные загрязнять протеины помимо липопротеинов (Таблица 1). Массовые спектров на рисунке 3 демонстрируют профиль Ион tryptic пептид E. faecalis липопротеина НПАР, что происходит с последующей моет НПАР нитроцеллюлозы граница с растворителями увеличения полярности (пик заданий, перечисленных в Таблица 2). Рисунок 4 показывает N-терминала структурных характеристик НПАР как определено MALDI-TOF MS/MS, раскрывая диагностические N- ацилированных dehydroalanyl пики в соответствии с формой lyso липопротеинов. Рисунок 5 показывает эффект натрия аддукт формирования о фрагментации, с ионом родительского sodiated, преференциально фрагментации пользу Ион dehydroalanyl - ацилированных N.
Рисунок 1: Схема протокола. Липопротеины обогащены TX-114 фазы секционирование и можно использовать непосредственно, чаще всего в TLR анализов или неразделимая SDS-PAGE для определения структурных. Липопротеины передаются нитроцеллюлоза, переваривается с трипсином, промывают поэтапно и полученный lipopeptides этого eluted метанолом метилхлороформа для структурного анализа путем MALDI MS. Трипсина и нитроцеллюлоза Вымойте решения могут быть сохранены для идентификации белков и MS анализа. ж /: с; TFA: trifluoroacetic кислота; АКС: Ацетонитрил; CHCA: α-циано-4-Гидроксикоричная кислота; ОПТ: необязательный; MALDI: матрица помогает лазерная десорбция ионизация; MS: масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Профиль TX-114 обогащенный белки от E. faecalis. 10% гель SDS-PAGE трис глицин витражи с Кумасси синий (A) и соответствующие нитроцеллюлозную мембрану витражи с Пуансо (B) выявить различных диапазонов шаблону между осажденный белковые фракции («PPT») и очищенный Липопротеины («ЛП»). Указанные Кумасси окрашенных полос были подакцизным и определена как не липопротеины MALDI-MS tryptic пептидов (см. таблицу 1). НПАР определены и проанализированы в протоколе, описанные здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ион профиль и обилие изменения полярности нитроцеллюлозы Вымойте решения. (A) доля трипсина показывает несколько внутренних терпеноидные фрагменты, соответствующий липопротеинов E. faecalis НПАР указано на рисунке 2. Ацетонитрил (C) (B) и 20% 10% мыть фракций Показать изменения в интенсивности сигнала и уменьшение общего числа отдельных пиков. (D) фракции окончательный элюции сильно обогащенный с N-терминальный липопептиды на м /z 997, обозначены звездочкой (*). Интенсивность каждого спектров нормализуется к (A) для сравнения интенсивности сигнала. Вершины масс и назначенной последовательности, перечислены в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Группа | Белка ID | О присоединении № | Молекулярный вес EST. | Количество пептида | |
| 1 | коэффициент удлинения Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | НАДН пероксидаза | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | пируват дегидрогеназы E1component, альфа-субъединица | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | пируват дегидрогеназы E1 компонент, бета Субблок | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30S рибосомальной белка S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30S рибосомальной белка S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Таблица 1: осажденный белки являются не липопротеинов. Белки были определены tryptic дайджест и MALDI MS с использованием стандарта в гель пищеварения протоколы19 и перечислены сверху вниз в том же порядке, они отображаются на Кумасси гель на рисунке 2. Каждый белок отождествлялся с доверительный интервал (ди) более чем на 95%.
| Максимальное число | Теоретическая масса | Белка позиция | LOL Пропущенных отрезока сайтов | Пептид последовательность | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Таблица 2: наблюдается масс и соответствующий tryptic пептидов. В silico Пищеварение трипсина E. faecalis НПАР (GenBank: EOL37280.1) была выполнена с помощью PeptideMass20,21, позволяя до двух пропущенных вырезать сайтов. Теоретические массы пиков, наблюдается на спектры в рисунке 3 перечислены, наряду с соответствующей последовательности пептид.
Рисунок 4: MALDI-TOF MS E. faecalis липопротеина НПАР. (A) родителя МС спектр м /z 997 региона соответствует N-терминальный липопептиды E. faecalis НПАР. (B) МС/МС липопептиды пик показывает, что это lyso форма с диагностики N- ацилированных dehydroalanyl Пептидный фрагмент Ион пик обозначается звездочкой (*). (C)показана проясненного структура. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации9. Р.я.: относительная интенсивность пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: натрия аддукт образование способствует фрагментации Ион родителя к dehydroalanyl липопептиды ионов. (A) MALDI-TOF спектры пептида липопротеинов Lpp N-терминальный E. coli (бирюзовый бесследно) и с (голубые следы) добавлением бикарбоната натрия. Добавление бикарбоната натрия результаты окончательного eluted дроби 22 Да увеличение от расчетная масса липопептиды родительского. По сравнению с МС/МС спектр протонированных Ион (B), МС/МС спектр соответствующих Ион sodiated (C) показывает значительные преференциальные фрагментации к N-ацил-dehydroalanyl ионов через нейтральный Устранение diacylthioglyceryl части молекулы, обозначены звездочкой (*). Структура tryptic пептид родительского triacylated Lpp N-стержня (D) и N-ацил-dehydroalanyl Пептидный фрагмент Ион (E) изображены. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации9. Р.я.: относительная интенсивность пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь протокол описывает два отдельных этапов липопротеинов характеристика: обогащение TX-114 фаза перегородки и структурные определения MALDI-TOF MS. Во время извлечения TX-114 дополнительные центрифугирования удаляет загрязняясь протеины, которые осадок во время этого процесса, следуют ацетон осадков приносить высоко обогащенного липопротеинов. Ограничивая масштабы каждого подготовки 15-мл стоит клеток, несколько образцов можно легко обрабатываются параллельно и при желании объединить в конце протокола.
Для структурного анализа, MS передача липопротеинов нитроцеллюлоза облегчает пищеварение трипсина, стирки и последующего элюции от мембраны. В наших руках этот подход оказался предпочтительнее моющих средств опосредованной извлечения из традиционных геля полиакриламида вилки, связанные с поверхности мембраны нитроцеллюлозы а не встроен в Полиакриламида липопротеинов. Липопротеинов ассоциации с поверхностью нитроцеллюлоза также в значительной степени предотвращает общей проблемой неспецифической адсорбционной контейнера поверхности гидрофобные пептиды. Ступенчатые элюции нитроцеллюлоза штук удаляет больше гидрофильные, внутренняя tryptic пептиды, которые могут быть проанализированы MALDI-TOF MS для достижения высокого доверия белка идентификации назначений, в то время как окончательное элюции шаг можно воспроизвести дает концентрированные lipopeptides в небольшом объеме, основном бесплатно, мешая солей и Иона, подавляя загрязнений.
Успешный анализ MS липопротеина при условии его изобилия, и как таковой, темные полосы от окрашенных Пуансо мембраны могут дать лучшие результаты. Однако вполне возможно, что несколько липопротеинов могут мигрировать в одной группе во время разделения страницы, осложняющих результате спектров. Поэтому, настоятельно рекомендуется сначала определить белка пептидные массовой дактилоскопии (PMF), которое может быть достигнуто путем сбора МС спектры на долю всего трипсина или мыть фракции либо ацетонитриле и ввод результате пиков в программное обеспечение таких как талисман22. После того, как определена последовательность белка, расчета массы tryptic N-терминальный липопептиды значительно помогает в выборе которых ион фрагментировать МС/МС.
Дополнительные примеры неоднородность может быть результатом различной длины ацильные цепи на липопротеинов в рамках населения и их модификаций N-терминала, в зависимости от источника бактерии6. Хотя различия в длине цепи делает для отличительные пик кластеров на родительской спектры, характеризуется 14 шагом Да, соответствующий метиленовой группы (- CH2-), он может разделить общий сигнал липопептиды и уменьшить чувствительность. Это также вероятно, что формы различных липопротеинов влияние обогащения и фрагментации, хотя мы успешно определили, triacylated, diacylated и липопротеинов lyso формы с помощью описанных протокола. Аналогично различной пептид постановление липопротеинов добавить еще один уровень сложности в анализ, независимо от их N-стержня структуры, как очень гидрофильные аминокислотный состав может помешать липопептиды перегородки в фазу органических хлороформ используя другие методы извлечения8. Передача липопротеинов нитроцеллюлоза поможет в изучении таких lipopeptides, как все элюции фракции могут быть проанализированы в этом методе.
Рисование от предыдущих литературы, с участием23triacylglycerides и фосфолипидов, преднамеренного натрия аддукт формирования могут быть использованы для содействия более информативным фрагментации через формирование (N-ацил)-Ион dehydroalanyl пептид. Эти характерные ионы являются ключевыми для присвоения структуры, поскольку состояние ацилирования N-конечная изолирован от ацил замен на части молекулы глицерил. Натрия аддукт формирования обеспечивает удобный альтернативный вариант для серы окисления с перекисью водорода, который был показан также содействовать N-ацил-dehydroalanyl пептид фрагментации6,8. Хотя натрия аддуктов может показать общий подавления сигнала родительского Ион, конкретные увеличение раздробленности к dehydroalanyl ионов компенсирует снижение родительского Ион интенсивности. Это может быть стоит изучать другие матрицы и фрагментации дополнительных аддукты выяснить наиболее информативных спектров.
Этот протокол улучшает этапа традиционных TX-114, секционирование метод обогащения липопротеинов, в то время как передача страницы отделенный липопротеинов нитроцеллюлозную мембрану облегчает пищеварение трипсина и элюции lipopeptides. Анализ MALDI-TOF MS на общее tryptic или мыть фракций позволяет для идентификации белков в тандеме с N-терминальный структурные определения МС/МС в одном эксперименте. Необязательный натрия аддукт формирования основные различия на липопептиды N-конечная путем поощрения более информативным Ион фрагментации. Возможность регулярно очищать липопротеинов и характеризуют их N-Термини позволит обширные исследования на формы изготавливаются как Роман липопротеинов, их физиологической роли в бактериальной клетке конверт, и как они распознаются млекопитающих иммунной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Мередит был поддержан запуска средств, предоставленных Эберли Колледж естественных наук (Университет штата Пенсильвания). Мы благодарим д-р Татьяна Laremore для технических экспертов и доступа к оборудованию на Пенн государства протеомики и масс спектрометрии основного фонда, Юниверсити-Парк, штат Пенсильвания, где Массовый спектрометрический анализы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
